舒 楊 楊 曼 李志豪 王建華

（東北大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系， 分析科學(xué)研究中心， 沈陽(yáng) 110819）

MicroRNA（miRNA）是大小為20～24 個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈RNA 片段，是保守的非編碼RNA［1］，作為一類新的調(diào)節(jié)基因，在細(xì)胞分化、增殖、代謝和凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用［2-3］。癌癥或疾病的發(fā)生、發(fā)展與某些miRNA 的異常表達(dá)密切相關(guān)［4-5］，miRNA 已成為臨床診斷的理想生物標(biāo)志物。然而，miRNA 的內(nèi)在特性對(duì)其準(zhǔn)確定量帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)，主要?dú)w因于其豐度相對(duì)較低以及miRNA 家族的高度同源［6-7］。因此，發(fā)展快速、靈敏度高和特異性強(qiáng)的miRNA檢測(cè)方法具有重要意義。為此，人們開(kāi)發(fā)了一系列核酸信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)用于構(gòu)建高靈敏度和高選擇性的miRNA 傳感器，包括催化發(fā)夾自組裝［8］、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)［9］、熵驅(qū)動(dòng)催化［10］、等溫指數(shù)擴(kuò)增［11］和DNA 酶輔助等溫?cái)U(kuò)增［12］等。其中Dirks于2004年提出的雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）因其無(wú)酶特性、自主和高效的等溫?cái)U(kuò)增能力而在生物分析中得到廣泛應(yīng)用［13］。目前，已有報(bào)道將HCR的擴(kuò)增能力與傳感平臺(tái)相結(jié)合而提高檢測(cè)的靈敏度，如將HCR和側(cè)向流動(dòng)免疫分析組合可檢測(cè)具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的靶DNA［14］，將HCR集成到形狀編碼的水凝膠微粒中用于miRNA的檢測(cè)［15］。

金納米粒子（AuNPs）具有很高的消光系數(shù)和很強(qiáng)的距離依賴的光子特性，是理想的比色信號(hào)報(bào)告載體［16］，故基于AuNPs 的比色測(cè)定是一種具有競(jìng)爭(zhēng)力的寡核苷酸生物傳感技術(shù)［17］。本研究發(fā)展了一種將AuNPs 的比色性能與DNA 的HCR 擴(kuò)增相結(jié)合的miRNA 分析的檢測(cè)系統(tǒng)。在無(wú)靶標(biāo)的情況下，具有粘性末端的探針H1、H2可穩(wěn)定鹽溶液中的AuNPs，當(dāng)靶標(biāo)miRNA 存在時(shí)，靶標(biāo)miRNA 打開(kāi)輔助發(fā)夾探針（HP），由此觸發(fā)2個(gè)發(fā)夾鏈H1/H2間的HCR反應(yīng)，從而導(dǎo)致AuNPs聚集，改變局部表面等離子體共振特性，導(dǎo)致溶液顏色從酒紅色變?yōu)樗{(lán)色，據(jù)此可以進(jìn)行miRNA的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Milli-Q 型純水儀（美國(guó)Millipore 公司），電阻率大于18.2 MΩ·cm；PB-10 標(biāo)準(zhǔn)型pH 計(jì)（中國(guó)北京賽多利斯儀器有限公司）；U-3900型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-Vis，日本日立公司）； Tecnai G220型場(chǎng)發(fā)射電子透射電鏡（TEM，美國(guó)FEI公司）；Tanon-4600SF型凝膠電泳成像儀（上海富日科技有限公司）。

氯金酸（Au 質(zhì)量分?jǐn)?shù) 23.5%～23.8%）、檸檬酸鈉（99%）、氯化鈉（99.5%）、丙烯酰胺（99.0%）、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺（99.0%）、過(guò)硫酸銨（98%）（上海阿拉丁有限公司），TEMED（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），6×甘油凝膠緩沖液、0.5×TBE（44.5 mmol/L Tris，44.5 mmol/L Boric acid，1.0 mmol/L EDTA，pH 8.0～8.6）、4S Red Plus、10×PBS 緩沖液（NaCl 1.37 mol/L，KCl 26.83 mmol/L，Na2HPO481 mmol/L，KH2PO417.6 mmol/L，上海生工生物工程有限公司）。DNA 粉末、5×TBE 緩沖液、TE 緩沖液（上海生工生物工程有限公司），以上試劑均為分析純。寡核苷酸的序列購(gòu)自上海生工生物工程有限公司（表1）。

表1 研究中所用的寡核苷酸序列Table 1 The sequences of oligonucleotides adopted in the present study

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AuNPs的制備與表征

通過(guò)檸檬酸鹽還原HAuCl4的方法制備AuNPs［18］。將50 mL HAuCl4（1 mmol/L）加熱至140 ℃后，向其中快速加入5 mL 檸檬酸鈉溶液（38.8 mmol/L）。溶液顏色由淡黃色變?yōu)榫萍t色后，反應(yīng)混合物回流20 min。然后，將溶液冷卻至室溫，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，所得到的AuNPs 于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。為獲得AuNPs的TEM圖像，在碳涂層銅網(wǎng)格上加入1滴膠體溶液，于室溫下干燥，制備用于TEM表征的樣品。

1.2.2 凝膠電泳表征

HP、H1 和H2 在95 ℃金屬浴中加熱3 min，然后冷卻2 h 至室溫。將靶miRNA 與HP、H1 和H2 在37 ℃下孵育3 h。6×甘油凝膠緩沖液，其中含質(zhì)量濃度為0.25 g/mL二甲苯青和溴酚藍(lán)，體積分?jǐn)?shù)為60%甘油，用作寡核苷酸染料與樣品混合，并上樣到質(zhì)量濃度為12 g/mL 聚丙烯酰胺凝膠中。將凝膠在0.5×TBE 電泳緩沖液中以恒定電壓（120 V）在4 ℃下電泳50 min。經(jīng)4S Red Plus 核酸染色10 min 后，用凝膠成像系統(tǒng)分析所得凝膠的圖像。

1.2.3 miRNA的測(cè)定

為了測(cè)定靶miRNA，先將HP、H1 和H2 于95 ℃加熱3 min，然后冷卻2 h 至室溫。將3 μL 不同濃度的靶miRNA 樣品（0、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0、20.0、40.0 和60.0 nmol/L）與3 μL HP（100 nmol/L），3 μL H1（1 μmol/L）、3 μL H2（1 μmol/L）和3 μL NaCl（1 mol/L）在15 μL 緩沖溶液（1×PBS）中混合，然后在37 ℃下孵育3 h。隨后，將30 μL上述反應(yīng)混合物加入AuNPs膠體溶液中（270 μL，2.1 nmol/L）。孵育10 min后，在523 nm處測(cè)定混合溶液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 miRNA的檢測(cè)與傳感原理

圖1 中描述了基于HCR 擴(kuò)增和AuNPs聚集狀態(tài)變化的miRNA 比色傳感策略的原理。以miRNA-21為例，在沒(méi)有靶標(biāo)存在的情況下，不能觸發(fā)HCR 過(guò)程，3 個(gè)DNA 發(fā)夾探針HP、H1 和H2 可以在溶液中穩(wěn)定共存，且其粘性末端具有穩(wěn)定傳感系統(tǒng)的作用，此時(shí)AuNPs在523 nm 處的吸收不發(fā)生變化，體系的背景信號(hào)可予以忽略。當(dāng)存在靶標(biāo)miRNA-21時(shí)，HP21中的環(huán)區(qū)序列識(shí)別靶標(biāo)并形成miRNA-21-HP21，打開(kāi)的HP21莖區(qū)與H1 的粘性末端相配對(duì)，H1 經(jīng)粘性末端介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)而將發(fā)夾打開(kāi)。新暴露出來(lái)的H1結(jié)構(gòu)域與H2的粘性末端互補(bǔ)，從而打開(kāi)發(fā)夾并露出H2的粘性末端，其序列與HP21中的莖區(qū)相同，可以與另一個(gè)H1的粘性末端雜交。通過(guò)這種方式，每個(gè)靶標(biāo)均可在交替的H1和H2發(fā)夾之間發(fā)生雜交的連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致長(zhǎng)鏈dsDNA 的形成。dsDNA 具有較強(qiáng)的剛性而使得其帶負(fù)電荷的磷酸骨架暴露出來(lái)，dsDNA 與負(fù)電荷的AuNPs 之間具有強(qiáng)列的排斥作用，使得它們的互相結(jié)合可以忽略不計(jì)，亦即此時(shí)其不能阻止鹽誘導(dǎo)的AuNPs聚集。這種聚集導(dǎo)致膠體溶液的顏色由酒紅色變化為藍(lán)色，同時(shí)在523 nm處的吸光度顯著下降［19］。吸光度的變化與miRNA的濃度線性相關(guān)，為miRNA的測(cè)定提供了依據(jù)。

圖1 基于金納米粒子聚集狀態(tài)變化和雜交鏈反應(yīng)擴(kuò)增的高靈敏比色檢測(cè)miRNA原理Fig. 1 Schematic illustration for high sensitive colorimetric detection of miRNA based on the aggregation of gold nanoparticles （AuNPs） and hybridization chain reaction （HCR） amplification

2.2 miRNA傳感的可行性

基于靶miRNA-21，驗(yàn)證靶序列與所設(shè)計(jì)的發(fā)夾探針之間的HCR，進(jìn)一步研究了上述策略檢測(cè)miRNA的可行性。圖2A 顯示了AuNPs 膠體溶液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜及溶液的照片。在沒(méi)有靶miRNA-21 的情況下，可以觀察到AuNPs 在523 nm 處的表面等離子體共振吸收峰，溶液的顏色呈紅色（圖2A 插圖），表明此時(shí)發(fā)夾探針?lè)€(wěn)定，未發(fā)生AuNPs 的聚集。而當(dāng)存在5 nmol/L 靶miRNA-21 時(shí)，523 nm 處的吸光度顯著降低。相應(yīng)地，由于AuNPs局域表面等離子體共振的紅移，導(dǎo)致溶液的顏色從紅色變?yōu)樗{(lán)色（圖2A插圖），與紫外可見(jiàn)吸收光譜的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。從圖2B 中的凝膠電泳（PAGE）圖像中可以看出，當(dāng)缺失輔助發(fā)夾探針HP21時(shí)，H1/H2 鏈堿基個(gè)數(shù)相同，電泳中遷移速率相似，第2 和第3 泳道中只出現(xiàn)一個(gè)條帶，此時(shí)沒(méi)有發(fā)生HCR。第4泳道中只看見(jiàn)底部H1和H2的條帶，未看到H21的條帶的原因是使用的HP21濃度較低，由于沒(méi)有靶miRNA-21，同樣也沒(méi)有發(fā)生HCR。第5 泳道中，當(dāng)靶miRNA-21 與HP21、H1 和H2混合時(shí)，H1、H2 以及H21 參與了HCR 反應(yīng)被消耗，底部條帶減少，在泳道口處出現(xiàn)了新的大分子量條帶，表明HCR已經(jīng)發(fā)生并形成dsDNA聚合物。在HCR過(guò)程中，擴(kuò)增一直持續(xù)到H1或H2的DNA發(fā)夾耗盡，所得聚合物分子的雜交程度不同，故凝膠電泳圖像中聚合物顯示為瀑布帶。

圖2 （A）靶miRNA-21 濃度為0 和5 nmol/L 時(shí)，比色檢測(cè)系統(tǒng)的UV-Vis 光譜。插圖中給出的為AuNPs 溶液的照片。（ B）凝膠電泳圖像。從左到右的泳道： 1-DNA marker； 2-1 μmol/L H1+1 μmol/L H2； 3-1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+50 nmol/L 靶miRNA-21； 4-1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21； 5-1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21+50 nmol/L 靶miRNA-21。（ C）無(wú)靶miRNA-21 與100 mmol/L NaCl 共存時(shí)，比色檢測(cè)系統(tǒng)的TEM 圖像； 插圖為AuNPs 的TEM 粒徑分布圖。（ D）5 nmol/L 靶miRNA-21 與100 mmol/L NaCl 共存時(shí)，比色檢測(cè)系統(tǒng)的TEM圖像Fig.2 （A） UV-Vis absorption spectra for the colorimetric detection system in the absence and presence of 5 nmol/L target miRNA-21. Inset illustrated the photographs of AuNPs solution. （B） Polyacrylamide gel electrophoresis images. From left to right， lane 1： DNA marker； lane 2： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2； lane 3： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+50 nmol/L Target miRNA-21； lane 4： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21； lane 5： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21+50 nmol/L Target miRNA-21.（C） TEM images of AuNPs in the absence of target miRNA-21（ The inset represents the TEM size distribution of AuNPs）.（ D） TEM images of AuNPs in the presence of 5 nmol/L target miRNA-21

TEM 圖像可進(jìn)一步證實(shí)HCR 誘導(dǎo)的AuNPs 聚集狀態(tài)的變化。圖2C 表明，在100 mmol/L 鹽（NaCl）存在的情況下（圖2C），若未加入靶miRNA-21，則AuNPs分散性良好，粒徑為12～16 nm，未發(fā)生聚集。這可歸因于發(fā)夾DNA粘性末端的保護(hù)作用。當(dāng)靶miRNA-21存在時(shí)，在同樣濃度下，鹽導(dǎo)致的AuNPs聚集較為顯著（圖2D），此時(shí)AuNPs 的粒徑范圍變?yōu)?46～166 nm。TEM 圖像的分析結(jié)果與UV-Vis 光譜的紅移以及膠體溶液的顏色變化結(jié)果相對(duì)應(yīng)。表明本研究中所設(shè)計(jì)的比色檢測(cè)系統(tǒng)適用于miRNA-21 的檢測(cè)。

2.3 miRNA測(cè)定的方法與條件

通過(guò)考察存在和不存在靶miRNA 時(shí)523 nm 處的吸光度的差值（ΔA）來(lái)評(píng)估影響比色傳感系統(tǒng)測(cè)定性能的主要參數(shù)。由圖3A可見(jiàn)，ΔA的變化具有時(shí)間依賴性，即在0～3 h內(nèi)ΔA隨著雜交時(shí)間的增加而增大，之后隨時(shí)間的增加趨緩。故本研究選擇最佳雜時(shí)間為3 h。

圖3 （A） HCR反應(yīng)時(shí)間對(duì)傳感系統(tǒng)性能的影響。（ B） H1/H2濃度對(duì)AuNPs聚集的影響。（ C）氯化鈉濃度對(duì)AuNPs聚集及比色反應(yīng)的影響。（ D） AuNPs濃度對(duì)傳感系統(tǒng)響應(yīng)的影響。紅色柱： 對(duì)照實(shí)驗(yàn)； 綠色柱： 含有5.0 nmol/L的靶miRNA。（ E）溫度對(duì)HCR反應(yīng)效率的影響。泳道1： DNA mark er； 2： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2；3： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+50 nmol/L 靶miRNA-21； 4： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21； 5-9：1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 n mol/L HP21+50 nmol/L 靶miRNA-21，對(duì)應(yīng)溫度依次為4、20、25、37 和44 ℃。（F）圖3E 中泳道5-9 剩余H1/H2 條帶的強(qiáng)度柱狀圖。（ G）緩沖溶液pH 值對(duì)HCR 反應(yīng)效率的影響。泳道1： DNA marker； 2： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2； 3： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+50 nmol/L 靶miRNA-21；4： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21； 5-9： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21+50 nmol/L 靶miRNA-21，對(duì)應(yīng)pH值依次為： 6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。（ H）圖G中泳道5-9剩余H1/H2條帶的強(qiáng)度柱狀圖。誤差線表示3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差Fig 3 （A） The effect of HCR reaction time on the sensing performance.（ B） The effect of H1/H2 concentration on the aggregation of AuNPs and the sensing performance.（ C） The effect of NaCl concentration on the aggregation of AuNPs and the performance of colorimetric reaction.（ D） The effect of AuNPs concentration on the response of the sensing system. Red columns： control experiments； green columns： with 5.0 nmol/L of target miRNA. （E） The effect of temperature on HCR reaction efficiency. Lane 1： DNA marker； Lane 2： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2； Lane 3 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+50 nmol/L target miRNA-21； Lane 4： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21；Lanes 5-9： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21+50 nmol/L target miRNA-21 at 4， 20， 25， 37 and 44 ℃，respectively. （F） Histogram of the intensity of the residual H1/H2 bands in lanes 5-9 as indicated in Fig.3E.（G） The effect of buffer pH value on HCR reaction efficiency. Lane 1： DNA marker； Lane 2： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2；Lane 3： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+50 nmol/L target miRNA-21； Lane 4： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21； Lanes 5-9： 1 μmol/L H1+1 μmol/L H2+100 nmol/L HP21+50 nmol/L target miRNA-21， corresponding to pH vales of 6.0， 6.5， 7.0， 7.5 and 8.0， respectively.（H） Histogram of the intensity of the residual H1/H2 bands as indicated in lanes 5-9 in Fig.3G. The error bars represent the standard deviation of triplicate detections

在沒(méi)有靶miRNA-21 的情況下HP21不產(chǎn)生任何錯(cuò)誤的雜交信號(hào)以觸發(fā)AuNPs 的聚集，這對(duì)于保持檢測(cè)的靈敏度十分重要。體系中H1/H2發(fā)夾是HCR 的重要組成部分，H1/H2 的濃度變化對(duì)比色信號(hào)的影響很顯著。圖3B 的結(jié)果表明，H1/H2 濃度從50 nmol/L 增加到100 nmol/L 時(shí)，ΔA迅速增加，而在100～600 nmol/L范圍內(nèi)，H1/H2濃度的增加伴隨著ΔA的明顯降低。這可能是因?yàn)镠1/H2濃度過(guò)高，HCR反應(yīng)后會(huì)剩余大量發(fā)夾，而H1/H2 較低時(shí)沒(méi)有足夠的保護(hù)作用，均影響測(cè)定靈敏度。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇H1/H2的濃度為100 nmol/L。

鑒于AuNPs 的聚集是miRNA 測(cè)定的重要實(shí)驗(yàn)條件，用于誘導(dǎo)聚集的NaCl濃度是一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，其很大程度上可決定檢測(cè)的靈敏度。鹽濃度過(guò)高易超出發(fā)夾的保護(hù)范圍，濃度過(guò)低又不足以促使AuNPs聚集。由圖3C 結(jié)果可見(jiàn)，NaCl 濃度為100 mmol/L 時(shí)較為合適。此外，AuNPs 的濃度對(duì)測(cè)定靈敏度亦有較大影響（圖3D）。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，選擇AuNPs的濃度為2.1 nmol/L。還研究了HCR反應(yīng)溫度以及緩沖溶液pH值對(duì)傳感體系的影響。由圖3E、3F、3G和3H可見(jiàn)，HCR的最佳反應(yīng)溫度和pH值為37 ℃及7.5。

在傳感體系中加入不同濃度的靶miRNA-21（0～6 nmol/L），AuNPs 膠體體系的顏色發(fā)生明顯變化（圖4A）。很顯然，在此濃度范圍內(nèi)，miRNA-21 的存在導(dǎo)致AuNPs 膠體的顏色逐漸由酒紅色變?yōu)樗{(lán)色。圖4B中傳感體系的紫外-可見(jiàn)吸收光譜表明，隨著miRNA-21濃度的增加，523 nm處的吸光度逐漸降低。且miRNA-21 濃度在0.05～0.5 nmol/L 范圍內(nèi)，A523與miRNA-21 濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖4C），其線性回歸方程為y=-0.344x+0.577（R2=0.9990），miRNA-21的檢出限為15 pmol/L（S/N=3）。

圖4 （A）不同濃度靶miRNA-21存在下檢測(cè)體系比色響應(yīng)的照片。從左到右靶標(biāo)miRNA-21的濃度依次為0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、2.0、4.0 和6.0 nmol/L。 （B）不同濃度靶miRNA-21 存在時(shí)的紫外-可見(jiàn)吸收光譜，隨著miRNA 濃度的增大，523 nm 處的吸光度明顯降低。 （C）靶miRNA-21 濃度與吸光度A523關(guān)系圖； 插圖為0.05～0.50 nmol/L 濃度范圍內(nèi)，吸光度與miRNA 濃度的線性關(guān)系。 （D）傳感體系對(duì)靶miRNA-21 的特異性檢測(cè)。miRNA 濃度為5.0 nmol/L。 （E）血清中含有的BSA、Lys、Glu 和Cys 等對(duì)miRNA-21 測(cè)定的干擾實(shí)驗(yàn)。BSA、Lys、Glu和Cys的濃度分別為1 μmol/L、1 mmol/L、1 μg/mL和5 g/L。誤差棒為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差Fig. 4 （A） The photographs of colorimetric response of the detection system in the presence of different concentrations of target miRNA-21. From left to right the concentrations of target miRNA-21were 0， 0.05， 0.1，0.2， 0.3， 0.5， 1.0， 2.0， 4.0 and 6.0 nmol/L.（B） UV-visible absorption spectra of the sensing system in the presence of various concentrations of miRNA-21. （C） The relationship between target miRNA-21 concentration and absorbance A523 （The inset represents the linear calibration within a concentration range of 0.05～0.5 nmol/L）.（D） The specific detection of target miRNA-21 by sensing system. The concentration of miRNA was 5.0 nmol/L.（E） Anti-interference test for the detection of miRNA-21 in the presence of BSA， Lys， Glu and Cys contained in serum. The concentrations of BSA， Lys， Glu and Cys were 1 μmol/L， 1 mmol/L， 1 μg/mL and 5 g/L ， respectively.The error bars represent the standard deviation of three repetitive detections

鑒于miRNA 家族的高度同源性，生命體系中共存的其它miRNA 可能對(duì)miRNA-21 的檢測(cè)產(chǎn)生影響或干擾。為此，評(píng)估了所建立方法的特異性或選擇性，研究了miRNA-155、miRNA-let-7a、miRNA-10b 和miRNA-31 對(duì)本傳感體系的響應(yīng)，如圖4D 所示，當(dāng)靶miRNA-21 不存在時(shí)，523 nm 處的A523值與背景值相近，說(shuō)明體系對(duì)于miRNA-21具有良好的特異性，可能歸因于對(duì)堿基互補(bǔ)配對(duì)的高度特異性識(shí)別。

為了評(píng)定本策略的抗干擾能力，對(duì)人血清樣品中包含的一些干擾物質(zhì)，如牛血清白蛋白（BSA）、溶菌酶（Lys）、葡萄糖（Glu）和半胱氨酸（Cys）進(jìn)行研究。圖4E表明，這些干擾物質(zhì)對(duì)AuNPs的紫外吸收信號(hào)無(wú)明顯影響，說(shuō)明本傳感體系在真實(shí)樣品中具有良好的抗干擾能力。

表2 總結(jié)了一些其它比色法檢測(cè)miRNA 的方法，Lee課題組David 等［20］建立了基于氧化石墨烯的熒光/比色雙重傳感平臺(tái)，對(duì)miRNA-21 進(jìn)行檢測(cè)，由于該方法未采用信號(hào)放大技術(shù)，檢出限為2.6 nmol/L。Hosseini課題組Wei 等［21］基于G-四鏈體的球形DNAzyme 構(gòu)建檢測(cè)miRNA-155 的比色方法，檢測(cè)到低至0.7 nmol/L 的miRNA-155。該方法將DNA探針鏈偶聯(lián)至金納米粒子表面，檢測(cè)成本較高。Javier課題組Li 等［22］對(duì)DNA 序列進(jìn)行硫醇化修飾且無(wú)擴(kuò)增策略，價(jià)格昂貴，檢出限為1.3 nmol/L。Oishi 課題組Tan等［23］使用金納米粒子和磁珠（GNP/MB）復(fù)合材料，依賴靶miRNA觸發(fā)DNA電路的催化拆解，用于miRNA的比色測(cè)定。本策略設(shè)計(jì)復(fù)雜，利用DNA 鏈置換反應(yīng)放大信號(hào)，檢出限較低，為5 pmol/L。但在DNA 循環(huán)過(guò)程中，燃料鏈的使用存在信號(hào)泄露的問(wèn)題。Xu課題組Liu等［24］開(kāi)發(fā)了基于階梯鏈位移擴(kuò)增（S-SDA）的比色傳感平臺(tái)，用于臨床血清樣品中miRNA-let-7a的檢測(cè)。該策略引入DNA 聚合酶和核酸切口酶實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大的同時(shí)，需要控制酶的最適溫度和滅活溫度，因此對(duì)反應(yīng)條件的要求也更為嚴(yán)格。相比之下，我們開(kāi)發(fā)的方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，HP 發(fā)夾可以防止信號(hào)泄露，DNA 鏈利用率高，無(wú)需酶的參與，成本較低，因此表現(xiàn)出較好的檢測(cè)性能。

表2 不同miRNA檢測(cè)方法的比較Table 2 Comparison of different miRNA detection methods

2.4 方法的通用性研究與實(shí)際樣品分析

為了證明所建立的傳感體系及策略在檢測(cè)miRNA 中的通用性，通過(guò)改變輔助發(fā)夾HP 環(huán)區(qū)的DNA序列（表1），評(píng)估了其檢測(cè)不同miRNA 的可行性，并選擇miRNA-31 作為靶標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。圖5A 中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著miRNA-31 濃度的增加，AuNPs 在523 nm 處的吸光度呈下降趨勢(shì)，在0.05～0.5 nmol/L范圍內(nèi)二者呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖5A，插圖），線性回歸方程為y=-0.198x+0.572（R2=9980），檢出限為18 pmol/L。評(píng)估了該傳感方法檢測(cè)miRNA-31 的特異性。結(jié)果表明，miRNA-155、miRNA-let-7a、miRNA-10b 和miRNA-21 對(duì)miRNA-31 的檢測(cè)沒(méi)有干擾，亦即其對(duì)miRNA-31 的選擇性良好（圖4B）。這里的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究所建立的傳感體系是一種測(cè)定miRNA的通用方法，只需改變輔助發(fā)夾HP環(huán)區(qū)的DNA序列，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同miRNA的檢測(cè)。

圖5 （A）靶miRNA-31 的濃度與吸光度A523關(guān)系圖； 插圖為0.05～0.50 nmol/L 濃度范圍內(nèi)，靶miRNA-31 濃度與吸光度之間的線性關(guān)系。 （B）傳感體系對(duì)靶miRNA-31的特異性檢測(cè)。miRNA濃度為5.0 nmol/LFig. 5 （A） The relationship between target miRNA-31 concentration and absorbance A523 （The inset represents the linear calibration within a concentration range of 0.05～0.50 nmol/L）. （B） The specific detection of target miRNA-31 by the sensing system. The concentration of miRNA was 5.0 nmol/L

通過(guò)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)評(píng)估了所建立的傳感系統(tǒng)在實(shí)際樣品中的適用性。用1×PBS緩沖溶液將人血清樣品稀釋50 倍后，加入不同濃度的miRNA-21 或miRNA-31，然后分別對(duì)miRNA-21 或miRNA-31 進(jìn)行回收率的測(cè)定，結(jié)果如表3 所示。miRNA-21 的回收率為98%～112%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.2%～2.3%，miRNA-31 的回收率為91%～111%，RSD 為1.8%～2.7%。生物樣品測(cè)定要求相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%，回收率在80%～120%之間，可滿足實(shí)際生命樣品中miRNA測(cè)定的要求［25］。

表3 稀釋的人血清樣品中miRNA-21與miRNA-31的測(cè)定與回收率（n=3）Table 3 The spiking recovery of miRNA-21 and miRNA-31 in diluted human serum samples （n=3）

3 結(jié) 論

將雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增與miRNA 誘導(dǎo)的金納米粒子聚集狀態(tài)的變化相結(jié)合，開(kāi)發(fā)了一種適于不同靶miRNA 測(cè)定的比色傳感方法。所建立的傳感系統(tǒng)除了具備AuNPs比色法的傳統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)外，還具有以下顯著特點(diǎn)： 1）避免酶的引入； 2）提供了miRNA 檢測(cè)的高靈敏度，對(duì)miRNA-21 和miRNA-31 檢出限分別為15 和18 pmol/L； 3）對(duì)不同miRNA 均可提供必要的高特異性。通過(guò)對(duì)人血清中miRNA 的檢測(cè)，驗(yàn)證了本方法的可行性。