邢 蕾 牟含章 潘建斌 康 斌 徐靜娟 陳洪淵

（南京大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院， 生命分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南京 210023）

單細(xì)胞分析是現(xiàn)代生命分析科學(xué)的前沿，是微觀到宏觀系統(tǒng)層次研究的橋梁。 單細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)分析對(duì)于解釋細(xì)胞固有的異質(zhì)性，闡明生命體中各種生物化學(xué)過(guò)程的機(jī)制必不可少［1-2］。 然而，細(xì)胞樣品體積超小（10～50 μm）、內(nèi)含物的豐度低（1×10-15～1×10-21mol）以及組成復(fù)雜，為單細(xì)胞分析提出了巨大的挑戰(zhàn)［3-4］。 因此，發(fā)展具有高分辨以及高靈敏度的單細(xì)胞內(nèi)源與外源物質(zhì)同時(shí)檢測(cè)方法，是單細(xì)胞測(cè)量學(xué)的重要研究方向。

質(zhì)譜分析是目前單細(xì)胞分析常用的方法之一。 與單細(xì)胞研究的其它分析方法相比，質(zhì)譜分析具有無(wú)需標(biāo)記、高特異性地對(duì)多組分物質(zhì)同時(shí)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。 物質(zhì)的種類(lèi)、含量和結(jié)構(gòu)等信息可以在一次質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中同時(shí)獲得。 而質(zhì)譜成像不僅僅可以得到這些信息，它還同時(shí)包含了空間三維信息和該空間位置產(chǎn)生的所有質(zhì)譜信息［5］。 目前，商用的質(zhì)譜成像方法主要為電噴霧離子質(zhì)譜（DESI）、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（MALDI）以及二次離子質(zhì)譜（SIMS），而這3 類(lèi)質(zhì)譜成像方法各有優(yōu)劣勢(shì)。 簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，DESI 和MALDI 可以在大氣壓下實(shí)驗(yàn)，這非常有利于獲得物質(zhì)的真實(shí)物理化學(xué)信息。 但由于電離技術(shù)的固有屬性以及基質(zhì)的結(jié)晶效應(yīng)，導(dǎo)致它們的成像分辨率通常在微米級(jí)別，因此主要適用于組織或大尺寸生物樣品的分析［6-7］。而SIMS最高可獲得近～50 nm 的成像分辨率，但由于離子束的電離能過(guò)高，導(dǎo)致產(chǎn)生嚴(yán)重的離子碎片，不利于分子離子的捕獲，更加適用于元素的分析［8-9］。 盡管近幾年開(kāi)發(fā)的氣體團(tuán)簇離子技術(shù)使得SIMS 在這方面有了很大的改善，其捕獲的m/z可達(dá)～1000，但同時(shí)也犧牲了亞微米級(jí)的成像分辨率，最小僅～1 μm［10-11］。 目前，人們已經(jīng)將質(zhì)譜成像分析的應(yīng)用聚焦到單細(xì)胞分析上來(lái)，而上述幾種方法在實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞有效成分的分析上始終存在缺陷。 因此，找尋一種同時(shí)具有高空間分辨率和高檢測(cè)靈敏度的質(zhì)譜成像方法一直以來(lái)是人們追求的目標(biāo)。

實(shí)際上，隨著空間分辨率的提高，質(zhì)譜成像儀器的檢測(cè)靈敏度將不可避免地降低。 鑒于真空紫外（VUV）光源的光子能量適當(dāng)（～10 eV），能電離大部分具有小于10 eV電離能的有機(jī)生物分子而不產(chǎn)生過(guò)多的碎片，VUV光源逐漸作為質(zhì)譜成像儀器的后電離源以滿(mǎn)足在提升空間分辨率同時(shí)保證足夠高的檢測(cè)靈敏度的需求［12］。 例如，Hang課題組Yin等［13］通過(guò)在質(zhì)譜成像裝置中引入VUV激光后電離源，不僅獲得了近250 nm的最優(yōu)成像分辨能力，同時(shí)成功實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞內(nèi)amol級(jí)原黃素的檢測(cè)。 而Jens Soltwisch 課題組Bookneyer 等［14］則在MALDI 儀器中整合了脈沖VUV 燈模塊，進(jìn)一步提升了哺乳動(dòng)物組織切片中甘油磷酸、鞘氨醇和其它脂質(zhì)的檢測(cè)靈敏度。 2017年，Wang等［15］通過(guò)四波混頻法產(chǎn)生了高強(qiáng)度的VUV激光（125.3 nm），并將其首次作為固態(tài)生物樣品的解吸電離源，成功以8 μm 的成像分辨率測(cè)量了果蠅大腦切片上物質(zhì)的分布； 隨后，又以4 μm 的成像分辨率在小鼠食道組織切片和小鼠受精卵中成功捕獲了完整膽固醇的質(zhì)譜圖像［16］。 2018 年，他們又通過(guò)改進(jìn)聚焦光路進(jìn)一步提升了該儀器的成像分辨率至亞微米級(jí)別（～500 nm），成功獲得了HeLa 單細(xì)胞內(nèi)大量?jī)?nèi)源性代謝物的分布圖［17］； 同時(shí)，與SIMS 技術(shù)相比，該技術(shù)測(cè)量質(zhì)量數(shù)＞m/z100 的物質(zhì)靈敏度更高，成像結(jié)果也更清晰。 以上工作表明，基于VUV 激光的解吸電離質(zhì)譜成像技術(shù)可以同時(shí)獲得高空間分辨率、高檢測(cè)靈敏度以及較少的離子碎片化，因此在單細(xì)胞甚至細(xì)胞器中代謝物原位檢測(cè)上具有顯著優(yōu)勢(shì)。

近期，本課題組開(kāi)發(fā)了一種基于VUV 激光解吸/電離源的質(zhì)譜顯微斷層掃描成像技術(shù)［18］，其最佳空間分辨率可達(dá)～300 nm×300 nm×25 nm。 不僅實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞的納米級(jí)三維成像，還成功捕獲了小鼠小腦活樹(shù)區(qū)域的顆粒細(xì)胞中內(nèi)源性代謝物； 同時(shí)，利用該儀器，揭示了抗癌藥物影響細(xì)胞核中部分內(nèi)源性代謝產(chǎn)物表達(dá)水平的作用機(jī)制； 此外，在沒(méi)有來(lái)自細(xì)胞質(zhì)的信號(hào)干擾情況下，成功地進(jìn)行了細(xì)胞膜的代謝組學(xué)分析。 這種亞細(xì)胞分辨率MSI 技術(shù)已經(jīng)證實(shí)了亞細(xì)胞成像和原位空間代謝組學(xué)分析的能力。 有鑒于此，本文詳細(xì)介紹了這種基于真空紫外激光解吸電離源的質(zhì)譜成像裝置（VUVDI-ToFMS）的研發(fā)過(guò)程，通過(guò)從真空紫外激光能量、激光光路的聚焦以及反射式電場(chǎng)三方面進(jìn)行優(yōu)化，保證了該儀器在保持足夠高的檢測(cè)效率的同時(shí)具有亞微米級(jí)的成像分辨率。 最終，我們利用～500 nm 的成像分辨率實(shí)現(xiàn)了單個(gè)HeLa 細(xì)胞中內(nèi)源和外源物質(zhì)的共成像，成像結(jié)果不僅清晰地呈現(xiàn)了單個(gè)細(xì)胞的外輪廓，同時(shí)清晰地區(qū)分了細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核以及細(xì)胞核仁不同的細(xì)胞區(qū)室，進(jìn)一步證明了該裝置的高空間分辨率以及高檢測(cè)靈敏度。 該儀器具有非常廣泛的應(yīng)用潛力，將有助于單細(xì)胞分析的進(jìn)一步發(fā)展。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

產(chǎn)生基頻激光的兩臺(tái)Nd-YAG PRO-290-30 型激光器和CBST-LG-24 型、CBST-LG-24+SFM-532-N 型及CBST-LG-18型燃料激光器（美國(guó)Spectra-Physics公司）；光學(xué)鏡片購(gòu)自美國(guó)Thorlab公司；ZYLA-5.5-USB3型CCD 相機(jī)（英國(guó)ANDOR 公司）；PPS-20型納米級(jí)精密位移臺(tái)（美國(guó)MICRONIX 公司）；SDCB08T型隔直器（深圳市塞美聯(lián)合通訊技術(shù)有限公司）；HDO6104A型示波器（美國(guó)LeCroy公司）。

人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）購(gòu)自ATCC 細(xì)胞庫(kù)。 10%澳洲胎牛血清（FBS）購(gòu)自Sigma-Aldrich 有限公司。磷酸鹽緩沖鹽（PBS，pH=7.4，136.7 mmol/L NaCl、2.72 mmol/L KCl、8.72 mmol/L Na2HPO4和1.41 mmol/L KH2PO4），DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。 4%多聚甲醛、亞甲基藍(lán)（MB）水合物（C16H18ClN3S·xH2O，分析純）以及4′，6-二?基-乙-苯基吲哚（DAPI，分析純）購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司。 實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電阻率18.2 MΩ·cm，美國(guó)Milli-Q公司，MiUipore）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

使用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%FBS 和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液，在37 ℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。 將1.5 cm（長(zhǎng)）×寬（3 mm）石英片在質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%酒精以及無(wú)菌水中清洗， 放入培養(yǎng)皿中，將密度為1×104～5×104cell/mL的細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h。

將2個(gè)石英片上接種的細(xì)胞進(jìn)行藥物處理，處理步驟如下： 將一定濃度的MB原溶液加入DMEM 培養(yǎng)液中稀釋。 將原培養(yǎng)液倒掉，用PBS 清洗細(xì)胞3 次，加入含有特定濃度的MB 的培養(yǎng)液，孵育不同的時(shí)間。 將上述分別接種了對(duì)照細(xì)胞和MB 孵育細(xì)胞的石英片用PBS清洗細(xì)胞3次，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定20 min。 固定后用滅菌水快速清洗細(xì)胞3 次。 用無(wú)塵紙從石英片邊緣吸取水分后，放入-80 ℃冷凍干燥。 然后將石英片固定在樣品臺(tái)上等待質(zhì)譜檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器設(shè)計(jì)構(gòu)架

制備了一種基于真空紫外激光光源的解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，圖1 為該裝置示意圖與部分裝置實(shí)物圖。 該儀器主要包括VUV 激光光源產(chǎn)生系統(tǒng)（圖1A 和1B）、分光室（圖1C）、解吸/電離室（圖1D）、反射式飛渡管TOF分析儀（圖1E）和信號(hào)采集系統(tǒng)。 光源是通過(guò)三束基頻光四波混頻產(chǎn)生的VUV激光（～130 nm），然后通過(guò)分光室內(nèi)同軸光學(xué)系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行光譜過(guò)濾并聚焦在樣品表面上。 解吸/電離室中，在樣品基板的背面放置一個(gè)CCD相機(jī)，用于實(shí)時(shí)定位和觀察單細(xì)胞。 通過(guò)移動(dòng)納米級(jí)精密位移臺(tái)，實(shí)現(xiàn)逐像素掃描，然后獲取單個(gè)細(xì)胞的質(zhì)譜圖像。 質(zhì)量分析儀為反式TOF，同時(shí)在正離子模式下運(yùn)行。 最終的質(zhì)譜信號(hào)由3塊微通道板（MCP）收集和放大。 其中，MCP通過(guò)一個(gè)隔直器與示波器直接相連，隔直器可以避免直流信號(hào)對(duì)最終采集信號(hào)的干擾。 實(shí)驗(yàn)中，主要使用了Matlab軟件（美國(guó)MathWorks公司）編寫(xiě)的自編譯程序，將來(lái)自數(shù)字示波器的質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理成文本文件格式，用于成像實(shí)驗(yàn)以及數(shù)據(jù)的提取和保存。 最終的質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò)Origin2019軟件（Origin Lab，美國(guó)North Hampton公司，MA）獲得。

圖1 VUVDI-ToFMSI 裝置的示意圖與部分實(shí)物圖。 該儀器主要包括VUV 光源產(chǎn)生系統(tǒng)（A、B）、分光室（C）、解吸/電離室（D）、反射式TOF分析儀（E）和信號(hào)采集系統(tǒng)Fig. 1 Schematic diagram and partial physical images of the VUVDI-ToFMSI device. The instrument mainly includes a system generating the VUV laser （A， B）， a separation chamber （C）， a desorption/ionization chamber （D），a reflectron tube analyzer （E） and a signal acquisition system

該儀器的設(shè)計(jì)具有一些獨(dú)特的思考。 一方面，鑒于電離技術(shù)的選擇應(yīng)當(dāng)具有高的電離效率以及達(dá)到亞微米級(jí)的空間分辨能力，因此VUV 激光在該儀器中作為解吸/電離源的首選光源。 相比于傳統(tǒng)的激光解吸電離質(zhì)譜方法而言，VUV 激光作為質(zhì)譜儀的解吸/電離源具有以下優(yōu)勢(shì)： 1） VUV 激光波長(zhǎng)在105～165 nm，其衍射極限接近100 nm，因此理論上可以很容易地通過(guò)光路設(shè)計(jì)，獲得亞微米直徑的光斑； 2） VUV 激光的單光子能量適中（～10 eV），而大部分的生物有機(jī)分子的電離能均小于10 eV，因此電離效率較高同時(shí)避免過(guò)多的離子碎片，從而有利于單細(xì)胞相關(guān)的生命科學(xué)研究。 另一方面，為了VUV激光的高效傳播以及防止離子在大氣中的湮滅，不論在分光室、解吸/電離室還是反射式飛渡管分析儀中，均需要保持高真空狀態(tài)。 而同時(shí)考慮到換取樣品的便捷性以及盡可能減少達(dá)到可實(shí)驗(yàn)的真空度所需時(shí)間，將這3 部分之間利用一個(gè)可控閥門(mén)隔離。 最終，3 部分的真空度分別約為1.3×10-5、5.0×10-5和1.0×10-6Pa，它們均分別先由一臺(tái)機(jī)械泵抽真空，可達(dá)1×10-1Pa，再通過(guò)一臺(tái)或兩臺(tái)分子泵來(lái)獲取超高真空，可達(dá)1×10-5～1.0×10-6Pa，完全滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需求。

2.2 關(guān)鍵部分的研制和調(diào)試

2.2.1 VUV激光能量的最大化

VUVDI-ToFMSI 的調(diào)試主要分為VUV 激光能量、VUV 激光光路的聚焦以及反射電場(chǎng)最優(yōu)化3 個(gè)部分。激光的能量決定了樣品是否可被有效消融與電離，激光的聚焦決定了該儀器的空間分辨率，而反射電場(chǎng)則決定了不同離子是否可被準(zhǔn)確識(shí)別，這些均是決定質(zhì)譜成像結(jié)果可靠性的關(guān)鍵因素。

2.2.1.1 基頻光波長(zhǎng)的優(yōu)化

想要實(shí)現(xiàn)VUV 激光對(duì)固體樣品的解吸電離，首先需要獲得高強(qiáng)度的VUV 激光，而實(shí)際這很難在傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室中實(shí)現(xiàn)，這是因?yàn)閂UV 激光不僅在大氣中無(wú)法傳播，并且在真空室中也會(huì)被傳統(tǒng)的光學(xué)透鏡等器件吸收，因此它經(jīng)常被用作后電離光源電離氣相分子［12-14］。 本文產(chǎn)生的高強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)室內(nèi)VUV 光源方法主要為四波混頻方案（圖1A 和1B）［17-18］： 首先，通過(guò)一臺(tái)Nd-YAG 激光器泵浦兩臺(tái)染料激光器分別產(chǎn)生兩束波長(zhǎng)約為777和403 nm的基頻光； 然后，另一臺(tái)Nd-YAG激光器泵浦另一臺(tái)染料激光器產(chǎn)生490 nm 激光，532 nm 激光是該固體激光器的倍頻光，第3 束255 nm 的基頻光由490 nm 的激光和532 nm的激光通過(guò)BBO 晶體和頻產(chǎn)生，最終三束基頻光（圖1A）同步進(jìn)入汞蒸氣池（圖1B）進(jìn)行四波混頻，由汞原子發(fā)射產(chǎn)生高強(qiáng)度的VUV激光。 777 nm激光的脈沖能量在0～20 mJ范圍內(nèi)可調(diào)，403 nm激光的脈沖能量在0～30 mJ 范圍內(nèi)可調(diào)。 相比于這兩束激光，由于255 nm 激光是由和頻產(chǎn)生，因此其脈沖能量較低，僅在0～2 mJ范圍內(nèi)可調(diào)。 所有激光束的直徑均約為5 mm。 因此，據(jù)上所述，VUV 激光的產(chǎn)生首先主要由三束基頻光的波長(zhǎng)、能量以及同步化所決定。 只有波長(zhǎng)匹配的基頻光，同步激發(fā)基態(tài)汞原子躍遷至激發(fā)態(tài)，才會(huì)導(dǎo)致激發(fā)態(tài)汞原子最終發(fā)射出高強(qiáng)度的VUV激光。

有鑒于此，以～403 和～777 nm 的激光波長(zhǎng)調(diào)試為例，尋找到可以產(chǎn)生VUV 激光最強(qiáng)能量的最優(yōu)波長(zhǎng)。如圖2A 所示，通過(guò)從403.05～403.35 nm 之間微調(diào)基頻光的波長(zhǎng)，VUV 光強(qiáng)發(fā)生了明顯地改變，并且其在403.22 nm 處最大； 而微調(diào)777 nm 的波長(zhǎng)時(shí)，VUV 光強(qiáng)則在777.6～777.8 nm 波長(zhǎng)之間光強(qiáng)最大（圖2B）。 對(duì)比二者的VUV 光強(qiáng)變化曲線可知，～403 nm 激光的波長(zhǎng)對(duì)VUV 光強(qiáng)的影響更大，其最高峰位置更加尖銳和陡峭，而～777 nm激光的波長(zhǎng)則在一定范圍內(nèi)可調(diào)，其VUV光強(qiáng)最高峰位置有一小段平臺(tái)。 基頻光的同步化主要通過(guò)設(shè)計(jì)光路，保證三束基頻光在到達(dá)汞池前的路程基本一樣即可實(shí)現(xiàn)，而其本身能量的優(yōu)化，則將進(jìn)一步根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求實(shí)時(shí)調(diào)整。

圖2 波長(zhǎng)～403 nm（A）和～777 nm（B）的基頻光對(duì)應(yīng)的VUV光強(qiáng)度隨波長(zhǎng)的變化曲線Fig.2 Variation curves of VUV laser intensity with wavelength corresponding to the fundamental lasers at wavelengths of～403 nm （A） and ～777 nm （B）

2.2.1.2 汞池內(nèi)氣壓以及溫度的優(yōu)化

另一方面，汞蒸氣池所使用的材料為不銹鋼，放置在配套的管式恒溫爐中（圖1B）。 恒溫管兩端連接了冷卻水進(jìn)出口，供循環(huán)冷卻水（291 K）進(jìn)出。 通過(guò)加熱管式恒溫爐，汞蒸氣主要在管道的中心產(chǎn)生。 為了避免汞蒸氣冷凝在兩端窗口片上，通過(guò)一個(gè)干泵驅(qū)動(dòng)，在接近兩端窗口的位置均緩慢的通入惰性氣體氬氣。 管式恒溫爐溫度以及管道兩端的氬氣壓力實(shí)際也會(huì)決定最后產(chǎn)生的VUV 激光強(qiáng)度，這是因?yàn)闇囟冗^(guò)低不利于汞蒸發(fā)形成汞蒸氣，而溫度過(guò)高又會(huì)導(dǎo)致蒸氣密度過(guò)高同時(shí)對(duì)于實(shí)驗(yàn)本身也具有一定的危險(xiǎn)性。 而氬氣則可以輔助基頻光在汞蒸氣內(nèi)的混頻，合適的氬氣壓力可以提高混頻效率。

因此，VUV 激光的能量也可以通過(guò)調(diào)整氬氣壓力以及汞蒸氣池溫度進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)優(yōu)化。 圖3A 為VUV光強(qiáng)度隨著氬氣壓強(qiáng)的變化曲線，可以看到VUV光強(qiáng)在緩沖氣體壓強(qiáng)達(dá)到1000 Pa時(shí)極速上升，在1000～2000 Pa 區(qū)間內(nèi)保持穩(wěn)定。 圖3B 為VUV 光強(qiáng)度隨著汞蒸氣溫度的變化曲線，其中出現(xiàn)明顯變化的拐點(diǎn)為150 ℃。 當(dāng)汞蒸氣池溫度大于此拐點(diǎn)后，VUV 光強(qiáng)度迅速增加，并且在200 ℃趨向平緩。 因此，通過(guò)上述的調(diào)試實(shí)驗(yàn)，最終得到VUV 光強(qiáng)最強(qiáng)時(shí)的相關(guān)參數(shù)如下： 最優(yōu)基頻光波長(zhǎng)為777.7、403.22 和255 nm，氬氣氣壓大約為1100 Pa，汞蒸氣池溫度設(shè)置240 ℃，此時(shí)優(yōu)化后的VUV 激光能量接近13 μJ/pulse。 這一能量完全滿(mǎn)足固體樣品的解吸電離能，因此適用于后續(xù)單細(xì)胞質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。

圖3 VUV光強(qiáng)度隨（A）氬氣壓強(qiáng)及（B）汞蒸氣溫度的變化曲線Fig.3 Variation curve of VUV laser intensity with （A） argon pressure and （B） the temperature of the mercury vapor

2.2.2 VUV激光光路的聚焦

在汞蒸氣池內(nèi)，部分基頻光轉(zhuǎn)換為VUV光后，剩下的基頻光與VUV光將一起進(jìn)入分光室（圖1C）。由于VUV光強(qiáng)度比基頻光弱很多，僅為基頻光的百分之一或更小，若不進(jìn)行分光，高強(qiáng)度的基頻光將會(huì)對(duì)樣品造成損傷，所以在分光室內(nèi)要對(duì)VUV 光和高強(qiáng)度的基頻光進(jìn)行分離。 分離VUV光有多種方法，本工作采用的是透鏡焦點(diǎn)法，其示意圖如圖4 所示。 光路中主要利用3 塊透鏡和1 個(gè)光闌，3 塊透鏡對(duì)于基頻光與VUV 光而言焦距不同，使得它們的焦點(diǎn)位置也不同，通過(guò)將光闌放置在VUV 光聚焦光路的第2 個(gè)焦點(diǎn)處，從而僅讓大部分VUV 光通過(guò)，而過(guò)濾掉大部分的基頻光，實(shí)現(xiàn)對(duì)VUV 光的篩選。 該方法中光闌的大小直接決定了VUV 光的篩選效率，其中主要使用的是3 個(gè)不同孔徑的光闌，分別為孔徑1 mm、50 μm以及30 μm。 在上一節(jié)中VUV激光能量參數(shù)的調(diào)試中，主要使用的是1 mm的光闌。 但此時(shí)的VUV光能量極高（～13 μJ/pulse），反而不利于后續(xù)的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，因此最終在生物樣本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，使用孔徑尺寸為50 μm以及30 μm的光闌，對(duì)應(yīng)的VUV最高能量大約為1.5 μJ/pulse與1 μJ/pulse。

圖4 透鏡焦點(diǎn)法篩選VUV光示意圖Fig.4 Schematic diagram of screening VUV laser using lens focus method

在激光能量以及光路優(yōu)化后，由于接下來(lái)的質(zhì)譜成像實(shí)驗(yàn)需要大量的采樣點(diǎn)，并且樣品的信號(hào)強(qiáng)度直接受激光能量的影響，這就要求方法的高重復(fù)性和VUV激光器的長(zhǎng)壽命。 考慮到后續(xù)的成像實(shí)驗(yàn)，選擇了可以在保證足夠好的信噪比前提下，以較低的VUV激光能量進(jìn)行了激光能量穩(wěn)定性測(cè)量。 如圖5所示，可以看到～210000個(gè)脈沖的VUV激光能量較為一致，變化較小，保證了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和數(shù)據(jù)的可靠性。

2.2.3 反射電場(chǎng)的優(yōu)化

想要質(zhì)譜成像儀器同時(shí)獲得高空間分辨以及高檢測(cè)靈敏度，除了需要優(yōu)化光源的能量和聚焦光路外，離子飛行路徑的矯正和優(yōu)化也必不可少。 這里采用質(zhì)譜儀器設(shè)計(jì)中更為常用的反射式ToF。 整個(gè)反射器的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)采用等值精密電阻進(jìn)行串聯(lián)逐級(jí)分壓，形成兩級(jí)勻場(chǎng)反射區(qū)（圖1E）。 極片與極片之間的支撐架與絕緣通過(guò)不銹鋼管加陶瓷材質(zhì)墊片以及套管實(shí)現(xiàn)，隔絕無(wú)場(chǎng)飛行區(qū)與第1級(jí)反射場(chǎng)的柵網(wǎng)極片VR1 以及隔開(kāi)兩級(jí)反射場(chǎng)的柵網(wǎng)極片VR2 均為單層網(wǎng)，以形成靜電場(chǎng)反射鏡。 其中，VR2 的電壓直接決定了離子的反射飛行路徑，較小的電壓將無(wú)法將離子推斥回?zé)o場(chǎng)區(qū)域，而較大的電壓將加速離子飛行速度，不利于區(qū)分不同質(zhì)荷比的離子。 因此，首先以聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）的某一個(gè)質(zhì)譜信號(hào)作為參考，將VR2從+2000 V開(kāi)始加壓，每次增加100 V，測(cè)量其質(zhì)譜的信號(hào)變化。 圖6A展示了PMMA 的質(zhì)譜信號(hào)隨VR2 電壓的變化圖。 圖6B 展示了時(shí)間位于38 μs 左右的質(zhì)譜峰強(qiáng)度隨VR2 電壓的變化曲線圖。 從圖中可以看到，當(dāng)VR2 加壓到+2600 V 時(shí)，質(zhì)譜峰開(kāi)始增強(qiáng)，說(shuō)明離子開(kāi)始被推斥出靜電場(chǎng)反射鏡到達(dá)微通道板（MCP），到+3200 V時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度幾乎不變。 說(shuō)明產(chǎn)生的所有離子均被推斥出靜電場(chǎng)反射鏡到達(dá)MCP。

確定好VR2的電壓范圍后，繼續(xù)通過(guò)這樣的方法，調(diào)試VR1電壓，以便獲得最優(yōu)的質(zhì)量分辨率。 同時(shí)，在離子進(jìn)入反射式ToF 管之前，還裝配了偏轉(zhuǎn)電場(chǎng)以及離子聚焦電場(chǎng)，它們可以進(jìn)一步矯正離子飛行路徑，使得盡可能多的離子到達(dá)MCP 檢測(cè)器，從而提高檢測(cè)效率。 因此，在確定好靜電場(chǎng)反射鏡的VR2 和VR1 基礎(chǔ)電壓后，也優(yōu)化了偏轉(zhuǎn)電場(chǎng)和離子聚焦電場(chǎng)。 當(dāng)然，實(shí)際這幾個(gè)電壓之間可以相互影響，并不是按照順序調(diào)整好一個(gè)以后固定不動(dòng)，再調(diào)整下一個(gè)參數(shù)，而是需要根據(jù)質(zhì)譜信號(hào)反復(fù)來(lái)回調(diào)整，最終才能達(dá)到最優(yōu)參數(shù)值（表1）。

表1 VUVDI?ToFMSI儀器中反射腔內(nèi)4個(gè)可調(diào)整的參數(shù)電壓相對(duì)于地的正負(fù)性與最優(yōu)值Table 1 The polarity and optimal values of voltage elative to ground of four adjustable parameters in the reflectron tube of the VUVDI?ToFMSI instrument

2.3 細(xì)胞測(cè)試和優(yōu)化

為了驗(yàn)證所研發(fā)的真空紫外激光解吸電離質(zhì)譜單細(xì)胞成像能力，接下來(lái)對(duì)用光動(dòng)力藥物亞甲基藍(lán)（MB）培養(yǎng)的HeLa 細(xì)胞進(jìn)行了二維質(zhì)譜和熒光成像實(shí)驗(yàn)（圖7）。 同時(shí)，DNA 標(biāo)記物DAPI 也對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行了光學(xué)標(biāo)記。 儀器檢測(cè)到的細(xì)胞內(nèi)源性離子（m/z152.1）的富集位置圖7D 與DAPI 的熒光圖像一致（圖7B），其初步歸屬于質(zhì)子化鳥(niǎo)嘌呤離子（［C5H5N5O+H］+），表明其作為DNA 片段在細(xì)胞核中富集。 同時(shí)，另一個(gè)細(xì)胞內(nèi)源性離子（m/z81.1）則主要富集在核仁內(nèi)（圖7A 和7E）其歸屬可能為核糖的碎片信號(hào)［19］。 這些內(nèi)源性化合物的質(zhì)量圖像進(jìn)一步證明了儀器的細(xì)胞器成像能力。 除了這些內(nèi)源性代謝產(chǎn)物外，還獲得了外源性光動(dòng)力藥物MB 的質(zhì)量成像。 MB 已經(jīng)證明在細(xì)胞環(huán)境中存在正電荷，并且可以在線粒體和溶酶體中積累［18］。 激光掃描共聚焦顯微鏡的熒光成像結(jié)果也支持了這一觀點(diǎn)，顯示MB 主要分布在細(xì)胞質(zhì)中（圖7C）。 同時(shí)，MB（［C16H18N3S］+在m/z284.4處）的特征質(zhì)量峰的MS圖像（圖7F）與其熒光圖像匹配良好（圖7C），進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法成像結(jié)果的可靠性。 與圖7G 中的光學(xué)疊加圖像相比，通過(guò)無(wú)標(biāo)記質(zhì)譜成像方法可以清楚地區(qū)分細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和核仁（圖7H）。 這些結(jié)果驗(yàn)證了本方法在同時(shí)成像細(xì)胞器內(nèi)內(nèi)源性代謝物和外源性藥物方面的亞細(xì)胞分辨能力。

圖7 （A）單個(gè)Hela 細(xì)胞的光學(xué)圖像。 （B） DAPI 的熒光圖像。 （C） MB 的熒光圖像。 （D） m/z 152.1 離子的質(zhì)量圖像。 （E） m/z 81.1離子的質(zhì)量圖像。 （F） MB（［C16H18N3S］+在m/z 284.4處）的質(zhì)量圖像。 （G） A、B和C的合并圖像。 （H） D、E和F的合并圖像。 所有MS圖像均以500 nm/像素檢測(cè)。 不同的顏色亮度代表離子的豐度，顏色越亮，離子的豐度越強(qiáng)。 標(biāo)尺： 8 μmFig.7 （A） Optical image of a single Hela cell. （B） Fluorescence image of DAPI. （C） Fluorescence image of MB.（D） mass image of ions at m/z 152.1.（E） Mass image of fragments of ions at m/z 81.1.（F） Mass image of MB（［C16H18N3S］+ at m/z 284.4）. （G） Merged image of A， B and C. （H） Merged image of D， E and F. All MS images were detected at 500 nm/pixel. Different color brightness represents the ion′s abundance and the brighter the color，the stronger the abundance of the ions. Scale bar： 8 μm

3 結(jié) 論

在生物樣品的外源和內(nèi)源性化合物共成像中，一直追求無(wú)基質(zhì)、多尺度和高檢測(cè)靈敏度的MSI 方法。 本文所提出的VUVDI-ToFMSI方法為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)提供了更多的可能性。 首先，通過(guò)調(diào)整基頻光的波長(zhǎng)、能量、同步化以及汞蒸氣池的壓力、溫度，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)產(chǎn)生的VUV激光強(qiáng)度可最優(yōu)化至13 μJ/pulse，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿(mǎn)足解吸電離固體樣品的要求。 同時(shí)，透鏡焦點(diǎn)法的應(yīng)用使得VUV 激光光路共軸和聚焦方便，調(diào)整簡(jiǎn)單，更容易實(shí)現(xiàn)衍射極限的聚焦。 最后，反射式電場(chǎng)整合偏轉(zhuǎn)電場(chǎng)以及離子聚焦電場(chǎng)的設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化了離子的飛行路徑，提高了該儀器的檢測(cè)靈敏度以及質(zhì)量分辨率。 這些確保了在沒(méi)有基質(zhì)或電離后輔助的情況下，即使在亞細(xì)胞分辨率水平下，該儀器也能同時(shí)檢測(cè)單細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)室的外源和內(nèi)源性分子。 相比于目前已有的質(zhì)譜成像儀器而言，本文開(kāi)發(fā)的VUVDI-ToFMSI 方法主要有以下優(yōu)勢(shì)： 1）在該儀器測(cè)試前，樣本前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，無(wú)需基質(zhì)噴涂，同時(shí)，激光主要以90 度消融樣品表面，不會(huì)由于樣本的制備，例如局部不同的樣品密度以及對(duì)樣品透射的厚度要求，導(dǎo)致其難以產(chǎn)生均勻的離子； 2）已證實(shí)該儀器的亞細(xì)胞分辨能力，這將有助于推動(dòng)質(zhì)譜成像技術(shù)在亞細(xì)胞尺度的研究；3）解吸/電離源為真空紫外激光，根據(jù)衍射極限公式可知，理想狀態(tài)下，該儀器的空間分辨率可達(dá)100 nm左右，因此未來(lái)可以繼續(xù)通過(guò)改善聚焦光路、優(yōu)化離子飛行路徑以及增加后電離源等方案，進(jìn)一步提高該儀器的成像分辨率以及檢測(cè)靈敏度。 該儀器展現(xiàn)了在單細(xì)胞成像分析領(lǐng)域的強(qiáng)大優(yōu)勢(shì)，未來(lái)有望在組織切片不同區(qū)域的單細(xì)胞水平研究，以揭示細(xì)胞集落之間的異質(zhì)性，并為疾病的發(fā)生和發(fā)展提供線索。