袁麗珍 林妮婭 張?jiān)品?胡晶晶 婁筱叮 夏 帆

（中國(guó)地質(zhì)大學(xué)（武漢）生物地質(zhì)與環(huán)境地質(zhì)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 納米礦物材料及應(yīng)用教育部工程研究中心，材料與化學(xué)學(xué)院， 武漢 430074）

生物標(biāo)志物是正常生理過(guò)程、致病過(guò)程或暴露/干預(yù)反應(yīng)的可測(cè)量指標(biāo)，可以反映生物系統(tǒng)與潛在危害（可能是化學(xué)、物理或生物危害）之間的相互作用，可能是功能性的生理反應(yīng)，也可能是細(xì)胞層面的生化反應(yīng)，還可能是分子間的相互作用［1］，因此建立準(zhǔn)確、靈敏和方便的生物標(biāo)志物檢測(cè)方法對(duì)于疾病研究［2］、早期診斷［3］、藥物評(píng)價(jià)［4］和人類健康監(jiān)測(cè)［5］具有重要意義。 離子、小分子、蛋白質(zhì)、多糖、核酸和細(xì)胞等物質(zhì)參與生物體的構(gòu)建，在大多數(shù)生物功能中起著關(guān)鍵作用。 大多數(shù)疾?。ㄈ绨┌Y）的發(fā)生和預(yù)后均與這些物質(zhì)的變化有關(guān)［6］。 因此，對(duì)離子、小分子、蛋白質(zhì)、多糖、核酸和細(xì)胞等生物標(biāo)志物進(jìn)行高靈敏、特異性地檢測(cè)，對(duì)于研究其基本功能、了解生物過(guò)程和發(fā)展分子診斷具有重要意義。

目前，科研工作者已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了多種檢測(cè)生物標(biāo)志物的方法，如熒光法［7］、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定［8］、比色測(cè)定［9］、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）［10］和表面等離子體共振和電泳［11］等。 這些方法可以檢測(cè)存在于血液、尿液和唾液中的生物標(biāo)志物。 然而，昂貴的儀器、復(fù)雜的樣品制備和緩慢的檢測(cè)速率限制了這些檢測(cè)技術(shù)的廣泛應(yīng)用。 固態(tài)納米通道傳感系統(tǒng)具有小型化、靈敏度高、分析速度快、無(wú)標(biāo)記和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注［12］?；诠虘B(tài)納米通道的傳感系統(tǒng)主要分為兩組： 內(nèi)壁修飾固態(tài)納米通道和外表面功能化固態(tài)納米通道［13］。 內(nèi)壁修飾固態(tài)納米通道可以實(shí)現(xiàn)對(duì)各類靶標(biāo)的原位和實(shí)時(shí)檢測(cè)，然而，由于納米通道的直徑有限，內(nèi)壁修飾固態(tài)納米通道無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)大于納米通道孔徑的生物標(biāo)志物（如細(xì)胞）的原位和直接檢測(cè)［14］。 外表面功能化固態(tài)納米通道可以在納米通道的外表面進(jìn)行修飾，大的外表面積，使生物靶標(biāo)識(shí)別的可能性提高，也不受目標(biāo)大小的限制。 近年來(lái)，外表面功能化固態(tài)納米通道已被廣泛研究，實(shí)現(xiàn)了對(duì)離子、小分子、蛋白質(zhì)、多糖、核酸和細(xì)胞的直接檢測(cè)。

本文綜述了外表面功能化固態(tài)納米通道在生物標(biāo)志物分析的研究進(jìn)展。 內(nèi)容主要分為3個(gè)部分：首先，簡(jiǎn)要介紹了固態(tài)納米通道外表面功能化的方法； 其次，重點(diǎn)總結(jié)了外表面修飾固態(tài)納米通道傳感器在生物標(biāo)志物檢測(cè)方面的研究進(jìn)展，按檢測(cè)目標(biāo)分類，包括離子、小分子、生物大分子和細(xì)胞（圖1）；最后，總結(jié)并展望了外表面修飾的固態(tài)納米通道所面臨的挑戰(zhàn)與發(fā)展機(jī)遇。

圖1 本綜述內(nèi)容概覽Fig.1 The content of this review

1 固態(tài)納米通道外表面功能化

固態(tài)納米通道是指直徑在1～100 nm 且通道的長(zhǎng)度遠(yuǎn)大于孔徑的結(jié)構(gòu)，因固態(tài)納米通道具有良好的幾何結(jié)構(gòu)、尺寸、機(jī)械穩(wěn)定性、易于改進(jìn)以及具有宏觀量子隧道效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，使固態(tài)納米通道成為材料學(xué)、物理化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的重點(diǎn)研究對(duì)象［15］。 納米通道功能化是豐富納米通道性能的重要方式，可以有效拓寬納米通道的應(yīng)用領(lǐng)域。 采用一系列功能化技術(shù)，如物理氣相沉積、化學(xué)氣相沉積、化學(xué)鍍層、原子力沉積、等離子體聚合、共價(jià)鍵接枝、自組裝單分子層以及層層自組裝等［16］，將特定功能性小分子、特定功能的聚合物、配體分子、核酸適配體、抗體以及納米顆粒等功能分子或者涂層，通過(guò)共價(jià)鍵或者非共價(jià)鍵作用，對(duì)稱或非對(duì)稱方式修飾到納米通道表面，可以賦予納米通道可以面向各種場(chǎng)景應(yīng)用的性質(zhì)和功能。 在基于固態(tài)納米通道的傳感系統(tǒng)中，外表面功能化固態(tài)納米通道的檢測(cè)主要是基于離子信號(hào)的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)的，通過(guò)對(duì)外表面探針的接枝密度、電荷密度、潤(rùn)濕性和帶電性的調(diào)控實(shí)現(xiàn)對(duì)生物標(biāo)志物的檢測(cè)［17-22］。

2 外表面修飾的固態(tài)納米通道用于生物標(biāo)志物檢測(cè)

在近些年的發(fā)展過(guò)程中，基于固態(tài)納米通道的傳感器憑借表面功能化和選用功能分子作為探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)生物標(biāo)志物的廣泛檢測(cè)。 本節(jié)按檢測(cè)目標(biāo)分類，對(duì)外表面修飾的固態(tài)納米通道在離子、小分子、生物大分子和細(xì)胞等生物標(biāo)志物分析檢測(cè)的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。

2.1 離子的檢測(cè)

生命體內(nèi)的各種離子在維持生命體各種生命活動(dòng)中扮演者不可或缺的作用，如維持細(xì)胞和生物體的酸堿平衡、構(gòu)成細(xì)胞某些復(fù)雜化合物的重要組成成分等。 這些離子的缺乏或者過(guò)量均會(huì)導(dǎo)致生命體的正常生命活動(dòng)出現(xiàn)嚴(yán)重的問(wèn)題。 例如，汞離子在體內(nèi)積累會(huì)嚴(yán)重影響身體健康［23］。 目前，已有電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）、熒光、比色和電化學(xué)等方法來(lái)檢測(cè)汞離子濃度。 然而，昂貴的儀器、復(fù)雜的樣品制備和緩慢的檢測(cè)速率限制了這些檢測(cè)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，開(kāi)發(fā)高靈敏度和快速檢測(cè)的離子檢測(cè)工具具有相當(dāng)重要的意義。 Yan 等［24］報(bào)道了一種通過(guò)外表面功能化固態(tài)納米孔道特定識(shí)別汞的傳感方法，如圖2a 所示，將硫脲連接的2D 共價(jià)有機(jī)框架（JNU-3）作為識(shí)別單元，共價(jià)鍵合在多孔氧化鋁薄膜（AAO）的外表面上，由于硫脲連接的JNU-3 與Hg（Ⅱ）具有強(qiáng)特異性親和力，JNU-3@AAO 可檢測(cè)0.01～100 pg/mL的汞離子，檢測(cè)限低至3.28 fg/mL，10 pg/mL下Hg（Ⅱ）重復(fù)測(cè)定11次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為3.8%。 硫脲連接的JNU-3和Hg（Ⅱ）可以在90 s內(nèi)實(shí)現(xiàn)相互作用，提高了檢測(cè)Hg（Ⅱ）的速度。

圖2 （a） JNU-3@AAO 的納米流體傳感器檢測(cè)汞（Ⅱ）示意圖［24］； （b）仿生固態(tài)納米通道（DNA@IWHydrophilic+DNA@OSHydrophilic和DNA@IWHydrophilic+None@OSHydrophobic）傳感目標(biāo)的示意圖［25］Fig. 2 （a） Schematic illustration of JNU-3@AAO-based nanofluidic sensor for the detection of Hg（Ⅱ）［24］；（b） Schematic diagram of bio-inspired solid-state nanochannels （DNA@IWHydrophilic+DNA@OSHydrophilic and DNA@IWHydrophilic+None@OSHydrophobic） sensing target［25］

除了提高檢測(cè)速度，提高檢測(cè)離子的靈敏度也是目前研究者們面對(duì)的主要問(wèn)題之一。 受生物納米孔協(xié)同效應(yīng)的啟發(fā)，Jiang等［25］在固態(tài)納米通道的內(nèi)壁涂覆親水性DNA探針（DNA@IWHydrophilic），外表面涂覆疏水性涂層（None@OSHydrophobic）構(gòu)建具有協(xié)同效應(yīng)的固態(tài)納米通道傳感器（圖2b）。 外表面修飾的疏水性涂層（None@OSHydrophobic）導(dǎo)致納米通道的有效直徑減小，可以阻止干擾元素進(jìn)入納米通道，通過(guò)與內(nèi)表面修飾相結(jié)合實(shí)現(xiàn)在復(fù)雜環(huán)境中對(duì)離子的準(zhǔn)確檢測(cè)，使汞離子的檢測(cè)限降低至1 nmol/L，提升了檢測(cè)靈敏度。

2.2 小分子的檢測(cè)

除了離子，基于納米通道的傳感器也被用作分子傳感的新平臺(tái)［26］。 Xia 等［27］利用亞甲基藍(lán)的共價(jià)標(biāo)記和陽(yáng)離子RuHex 探針的靜電吸附，建立了一種雙電流信號(hào)生成的納米通道傳感平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)在限域空間內(nèi)檢測(cè)腺苷三磷酸（ATP）。 該平臺(tái)利用亞甲基藍(lán)電活性標(biāo)簽標(biāo)記，組裝后的DNA框架作為分子開(kāi)關(guān)，介導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（ET）產(chǎn)生電解電流（EC）信號(hào)，并引導(dǎo)跨膜離子傳輸（IT）產(chǎn)生IC信號(hào)。 DNA內(nèi)層框架上大量吸附的RuHex離子進(jìn)行電化學(xué)還原，通過(guò)ET過(guò)程產(chǎn)生EC信號(hào)，自由存在的RuHex離子被ATP分解時(shí)，逃離納米通道的內(nèi)部空間，從而產(chǎn)生明顯的信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP的靈敏檢測(cè)。

氯霉素（CAP）作為一種常見(jiàn)的獸藥抗生素，被廣泛用于治療傷寒、霍亂和腦膜等傳染病。 然而，食物中微量的CAP殘留可能會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用［28］。 因此，Yan等［29］開(kāi)發(fā)了一種基于適配體自組裝功能化的納米通道傳感器用于檢測(cè)食品中的CAP（圖3a）。 CAP 適配體（Apt）接枝到氨基功能化AAO 上（Apt@AAO），Apt 在Apt@AAO 進(jìn)一步自組裝成AAs 功能化的AAO（AAs@AAO）。 Apt 與CAP 的選擇性相互作用導(dǎo)致Apt 從AAs@AAO 分離，引發(fā)AAs@AAO 納米通道靈敏電流變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣品中CAP的精確測(cè)定。 開(kāi)發(fā)的AAs@AAO納米通道傳感器顯示出從0.32～1600 pg/mL的寬線性范圍，檢測(cè)限低至0.1 pg/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%的高精確性，以及在牛奶、奶粉和蜂蜜樣品中加標(biāo)CAP的回收率為93.4%～102.2%，實(shí)現(xiàn)了寬線性范圍、高精度和高靈敏度的CAP檢測(cè)。

手性分子具有非對(duì)稱性質(zhì)，其鏡像異構(gòu)體（對(duì)映體）在生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)和化學(xué)合成等領(lǐng)域中具有不同的生物活性、藥效和化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)。 因此，準(zhǔn)確檢測(cè)手性分子的存在和濃度對(duì)于藥物研發(fā)、藥物安全性評(píng)估、環(huán)境監(jiān)測(cè)和化學(xué)合成等方面具有重要意義。 Kuang 等［30］采用界面自組裝技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)含有手性配體且納米孔尺寸可定制的大規(guī)模非均膜體系，用以檢測(cè)具有手性結(jié)構(gòu)的萘普生（圖3b）。 該體系由帶負(fù)電荷的零維Cu2－x@Se NP 陣列組成。通過(guò)將帶負(fù)電荷的L-青霉胺（L-pen）插入Cu2－x@ Se（L-pen Cu2－x@ Se）膜中，提高離子整流，在近紅外區(qū)域（800～1600 nm）表現(xiàn)出圓二色性（CD）帶，在1440 nm 處最大強(qiáng)度為164.5 mdeg。 此外，通過(guò)控制層數(shù)、減少孔徑和調(diào)整功能配體，導(dǎo)致整流增加到114。 青霉胺的加入使得對(duì)萘普生的高對(duì)映選擇性識(shí)別成為可能，其顯示出極高的靈敏度，檢測(cè)限低至0.027 nmol/L。

甲醛（HCHO）是一種常見(jiàn)的揮發(fā)性有機(jī)物，廣泛用于化工行業(yè)，人一旦吸入過(guò)量的甲醛，容易患上白血病。 因此，檢測(cè)甲醛的存在和濃度對(duì)于保護(hù)人體健康非常重要。 目前，已經(jīng)發(fā)展出多種甲醛傳感器，但這些傳感器主要集中在改變探針的成分和結(jié)構(gòu)上，而很少研究界面潤(rùn)濕性對(duì)傳感器性能的影響。 由于甲醛在水中的溶解度較高，傳感器的納米通道應(yīng)具有較強(qiáng)的親水性，以確保甲醛可以自由地?cái)U(kuò)散到納米通道中并與探針充分接觸。 然而，過(guò)多的親水性基團(tuán)會(huì)導(dǎo)致“淹沒(méi)”現(xiàn)象，即過(guò)高的膜滲透性會(huì)嚴(yán)重削弱納米通道的整流效應(yīng)和檢測(cè)性能。 基于此，Zhang等［31］受生物水通道的啟發(fā)，提出了一種后修飾可調(diào)控納米通道親水/疏水性平衡的策略（圖3c）。 通過(guò)利用2-氨基對(duì)苯二甲酸在AAO納米通道上可控地原位組裝配位聚合物（CPs）來(lái)調(diào)節(jié)親水/疏水平衡，以促進(jìn)HCHO檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)CP/AAO異質(zhì)體中的疏水/親水平衡對(duì)于HCHO 的有效檢測(cè)起到了重要作用。 疏水的AAO屏障層有助于支撐限制效應(yīng)，而親水性CPs 可以最大限度地降低接觸電阻并增加活性胺單元的數(shù)量，從而促進(jìn)HCHO 富集和反應(yīng)，更有效地形成亞胺。 對(duì)HCHO的定量分析，經(jīng)過(guò)優(yōu)化的CP/AAO展現(xiàn)出從100 pmol/L～1 mmol/L的寬線性檢測(cè)范圍。

2.3 生物大分子的檢測(cè)

2.3.1 蛋白質(zhì)的檢測(cè)

蛋白質(zhì)是生命的物理基石，它們?cè)谏矬w的結(jié)構(gòu)功能、催化調(diào)節(jié)、運(yùn)輸和儲(chǔ)存等方面發(fā)揮著重要作用，對(duì)蛋白質(zhì)的高靈敏檢測(cè)有助于深入了解生物過(guò)程。 蛋白質(zhì)由20種不同的氨基酸組成，這些氨基酸折疊成不同的空間構(gòu)型，造就蛋白質(zhì)特定的3D 結(jié)構(gòu)［32］。 核酸適配體是一類短單鏈DNA（ssDNA）、RNA（ssRNA）或XNA（異種核酸，一種合成核酸類似物），可以通過(guò)核苷酸堿基互補(bǔ)配對(duì)、氫鍵、π-π堆積和靜電作用力等多種相互作用力發(fā)生自身適應(yīng)性折疊后形成特定的三維結(jié)構(gòu)來(lái)適應(yīng)具有高親和力和特異性的靶標(biāo)［33］。 基于此，Xia 等［34］將凝血酶適配體通過(guò)共價(jià)鍵固定在離子通道的外表面來(lái)檢測(cè)血清中的凝血酶（圖4a）。 當(dāng)目標(biāo)生物分子與適配體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，會(huì)阻塞通過(guò)納米通道-離子通道的離子流動(dòng)，同時(shí)表面電荷和空間位阻效應(yīng)也會(huì)影響傳質(zhì)性能的變化，利用電化學(xué)檢測(cè)器可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)傳質(zhì)性能的變化。 在最佳pH 值條件下，凝血酶的檢測(cè)限可以低至0.22 fmol/L。 同樣，Kuang 等［35］通過(guò)對(duì)金納米顆粒進(jìn)行功能化修飾粘蛋白1（MUC1）適配體和自組裝，制備了具有高比表面積的離子通道（圖4b）。 通過(guò)調(diào)控金納米膜陽(yáng)極氧化鋁離子通道的最佳層數(shù)，并在層間編碼適配體，建立了離子整流比與MUC1濃度之間的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)了對(duì)MUC1的高靈敏檢測(cè)。 隨著2019年冠狀病毒的爆發(fā)，快速、高度特異性和靈敏性的檢測(cè)試劑盒的研發(fā)成為研究熱點(diǎn)。 現(xiàn)有的綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）檢測(cè)方法主要基于酶促反應(yīng)，需要昂貴的試劑，限制了在資源匱乏地區(qū)的普及使用。 基于此，Li等［36］設(shè)計(jì)了一種新的即時(shí)檢測(cè)工具。 如圖4c 所示，使用S1 適配體對(duì)多孔陽(yáng)極氧化鋁（PAA）進(jìn)行功能化，以特異性捕獲和檢測(cè)SARS-CoV-2 刺突S1 蛋白。 當(dāng)靶標(biāo)被適配體捕獲時(shí)，納米通道表面的空間阻礙和電荷密度的變化將影響離子傳輸，導(dǎo)致電流大幅下降。 結(jié)合電化學(xué)技術(shù)，SARS-CoV-2 刺突S1 蛋白無(wú)需酶促反應(yīng)，一步靈敏地檢測(cè)SARS-CoV-2，檢測(cè)限低至1 fmol/L，且檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR 結(jié)果完全一致，實(shí)現(xiàn)了快速、簡(jiǎn)便和高靈敏檢測(cè)。

圖4 （a）凝血酶識(shí)別檢測(cè)原理示意圖［34］； （b）基于Au-AAO 離子通道檢測(cè)MUC1 的示意圖［35］； （c）用于檢測(cè)SARS-CoV-2的適配體功能化納米通道示意圖［36］Fig.4 （a） Schematic diagram of the principle of thrombin recognition detection［34］； （b） Schematic illustration of the detection of MUC1 based on the Au-AAO ion channel［35］； （c） Schematic illustration of the aptamer-functionalized nanochannels for one-step detection of SARS-CoV-2［36］

蛋白質(zhì)水解是指用酶將蛋白質(zhì)分解成多肽和氨基酸，是一種不可逆的翻譯后修飾過(guò)程［37］。 當(dāng)納米通道上的探針被蛋白酶水解后，由于固態(tài)納米通道的“限域效應(yīng)”，引起表面電荷或者空間位阻變化導(dǎo)致固態(tài)納米通道的離子電流發(fā)生顯著的變化，從而有“信號(hào)放大”的作用［38-39］。 基于此，Li 等［40］構(gòu)建了非對(duì)稱納米通道原位自組裝肽，用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）（圖5a）。 在固態(tài)納米通道的表面修飾短肽單元，建立仿生細(xì)胞/細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)界面，當(dāng)MMP 與多肽連接位點(diǎn)發(fā)生反應(yīng)時(shí)，離子電流發(fā)生變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中MMPs 的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。 此外，Xia 等［41］提出了一種利用納米通道外表面的潤(rùn)濕性變化來(lái)檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的策略。 研究人員在納米通道的外表面修飾了一種含有親水部分（CRRRR）、MMP-2 切割部分（PLGLAG）和疏水部分（Fn）的兩性肽探針（圖5b）。 在MMP-2 的作用下，由于疏水部分的釋放，外表面的親水性會(huì)增加，從而導(dǎo)致離子電流的增加。 研究人員還通過(guò)調(diào)節(jié)親疏水部分中苯丙氨酸（F）的數(shù)量（n），將檢測(cè)限降低到1 ng/mL（n=6），相比于n=2 時(shí)提高了50 倍。除了高靈敏的檢測(cè)MMP-2，該研究還證明了MMP-2 的表達(dá)與細(xì)胞周期有關(guān)，在G1/S 期表達(dá)水平最高。 除以上2 種策略，Majumdar 等［42］通過(guò)調(diào)控固態(tài)納米通道的表面電荷進(jìn)行蛋白酶的檢測(cè)（圖5c）。選擇胰蛋白酶作為檢測(cè)方案的示范，當(dāng)胰蛋白酶切割涂在二氧化硅納米通道表面的聚-L-賴氨酸時(shí)，納米通道表面電荷密度發(fā)生改變，通過(guò)監(jiān)測(cè)納米通道的離子導(dǎo)電性，實(shí)現(xiàn)對(duì)胰蛋白酶的靈敏檢測(cè)，結(jié)果表明納米通道傳感器的靈敏度可達(dá)到5 ng/mL。

圖5 （a） PAA 上的肽自組裝用于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)仿生細(xì)胞/細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)界面的MMP 示意圖［40］； （b）多肽探針功能化的固態(tài)納米通道檢測(cè)MMP-2的示意圖［41］； （c）胰蛋白酶裂解胰蛋白酶-聚-L-賴氨酸反應(yīng)實(shí)驗(yàn)程序示意圖［42］Fig. 5 （a） Schematic diagram showing the peptide self-assembly on the block layer of PAA for dynamic monitoring of MMP activities at the biomimetic cell/ECM interface［40］； （b） Schematic of the solid-state nanochannel detection of MMP-2 by peptide probe functionalization［41］； （c） Schematic drawing of experimental procedures for the trypsin-PLL cleavage reaction［42］

除以上提及的非共價(jià)識(shí)別和酶水解多肽外，利用蛋白質(zhì)上富含的巰基基團(tuán)也可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的檢測(cè)和蛋白質(zhì)狀態(tài)的鑒定。 具體來(lái)說(shuō)，近來(lái)Lou等［43］開(kāi)發(fā)了一種含馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)的四苯乙烯基（MI-TPE）外表面探針修飾的納米通道陣列傳感平臺(tái)通過(guò)輸出光電雙信號(hào)實(shí)現(xiàn)未折疊蛋白質(zhì)的檢測(cè)，此外，根據(jù)單個(gè)硫醇基團(tuán)的變化還可以用來(lái)區(qū)分蛋白質(zhì)的折疊和未折疊狀態(tài)的能力（圖6）。 半胱氨酸是最少暴露在折疊蛋白質(zhì)表面的殘基，蛋白質(zhì)的展開(kāi)將增加暴露的半胱氨酸硫醇基團(tuán)，通過(guò)在納米孔道外表面修飾可以與硫醇結(jié)合的MI-TPE探針，當(dāng)納米通道陣列外表面探針MI-TPE與硫醇結(jié)合后，由于MI-TPE的光致電子轉(zhuǎn)移淬滅以及分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)的抑制，外表面上的MI-TPE熒光團(tuán)被激活。 同時(shí)，外表面增加的表面電荷密度也導(dǎo)致了跨膜離子電流的增強(qiáng)。 通過(guò)這種機(jī)制，該平臺(tái)能夠識(shí)別含有不同巰基數(shù)量的模型蛋白質(zhì)的折疊和未折疊狀態(tài)，且2種信號(hào)的整合為特定蛋白質(zhì)構(gòu)象提供了一個(gè)明顯的信號(hào)，從而提高識(shí)別的可靠性。 基于對(duì)細(xì)胞中未折疊蛋白含量的高靈敏度檢測(cè)，有望實(shí)現(xiàn)正常細(xì)胞和亨廷頓病突變細(xì)胞的準(zhǔn)確區(qū)分。

圖6 用于鑒定未折疊蛋白的外表面功能化納米通道陣列的示意圖［43］Fig.6 Schematic representation of POS functionalized nanochannel array used to identify unfolded proteins［43］

2.3.2 多糖的檢測(cè)

多糖在大多數(shù)生物過(guò)程和事件的發(fā)展和維持中起著重要作用，包括細(xì)胞間相互作用、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和免疫系統(tǒng)活動(dòng)［44］。 某些疾病的產(chǎn)生和發(fā)展通常也伴隨著蛋白質(zhì)糖基化［45］。 目前，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一些用于檢測(cè)細(xì)胞表面多糖的方法，例如質(zhì)譜［46］、核磁共振［47］、色譜法［48］、光譜測(cè)定法［49］和電化學(xué)技術(shù)［50］，上述方法大部分需要預(yù)富集，并且通常需要大量樣品。 當(dāng)樣品資源稀缺且昂貴時(shí)，分析將變得具有挑戰(zhàn)性。因此，非常需要開(kāi)發(fā)檢測(cè)簡(jiǎn)單、小型化、靈敏高和特異性強(qiáng)的傳感器。 基于此，Wang等［51］設(shè)計(jì)了基于納米通道-離子通道的超靈敏、無(wú)標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞表面糖類的方法（圖7）。 研究利用PAA 的非對(duì)稱納米通道-離子通道以及由納米通道陣列引起的放大離子電流和由非對(duì)稱幾何引起的離子電流整流效應(yīng)，賦予PAA 靈敏的離子電流響應(yīng)。 固定在納米通道-離子通道表面的刀豆蛋白A 能與多糖特異性結(jié)合，基于此原理構(gòu)建的納米流體器件可用于實(shí)時(shí)和無(wú)標(biāo)記的選擇性識(shí)別和檢測(cè)糖基。 此外，由于離子通道的亞納米尺寸，探針固定和糖類識(shí)別在PAA 的外表面上進(jìn)行，避免了樣品對(duì)PAA 納米通道的堵塞。 結(jié)果表明，可以成功檢測(cè)濃度在10 fmol/L～10 nmol/L 范圍內(nèi)的糖類，檢測(cè)限約為10 amol/L，明顯低于大多數(shù)先前的工作。

圖7 PAA膜表面改性檢測(cè)多糖原理示意圖［51］Fig.7 Schematic diagram of the principle of PAA membrane surface modification detection of polysaccharides［51］

2.3.3 核酸的檢測(cè)

核酸包括脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），是由許多核苷酸單體組成的生物大分子化合物，是生命中最基本的物質(zhì)之一。 微小RNA（miRNA）被認(rèn)為是癌癥診斷和預(yù)后中的一種生物標(biāo)志物［52］，近幾年發(fā)展的檢測(cè)方法通常需要大量的樣本，對(duì)于一些樣本稀缺或價(jià)格昂貴的樣本的檢測(cè)是非常困難的［53］。 因此，開(kāi)發(fā)用于miRNA 檢測(cè)的小型化、高靈敏度和特異性的生物傳感器仍然具有挑戰(zhàn)性以及重要的臨床意義。 Xia 等［54］開(kāi)發(fā)了一種生物仿生納米通道-離子通道雜交系統(tǒng)，結(jié)合電化學(xué)檢測(cè)器，用于無(wú)標(biāo)記、超靈敏地檢測(cè)細(xì)胞中的miRNA（圖8a）。 首先，在納米通道-離子通道雜交膜的外表面固定了單鏈DNA（ssDNA）作為探針，ssDNA 可以與細(xì)胞中的目標(biāo)miRNA 雜交。 由于雜交系統(tǒng)的獨(dú)特傳質(zhì)特性，可以使用電化學(xué)技術(shù)實(shí)時(shí)、靈敏地監(jiān)測(cè)DNA-miRNA 雜交動(dòng)力學(xué)。 該系統(tǒng)可以輕松檢測(cè)到0.1 fmol/L～0.1 μmol/L的miRNA，檢測(cè)限為15.4 amol/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于大多數(shù)報(bào)道的工作。 更重要的是，由于離子通道的超小尺寸，DNA 探針的固定和雜交過(guò)程可以在離子通道的外表面進(jìn)行，有效避免通道的阻塞和損壞，從而顯著提高了可重用性和準(zhǔn)確性。

圖8 （a）納米通道-離子通道雜化物表面改性和檢測(cè)miRNA示意圖［54］； （b） DNA靶標(biāo)通過(guò)T4多核苷酸激酶反應(yīng)觸發(fā)的RCA過(guò)程示意圖［57］Fig. 8 （a） Illustration of surface modification and miRNA detection on the nanochannel-ionchannel hybrid［54］； （b） Schematic illustration of the RCA process triggered by DNA targets through the T4 polynucleotide kinase reaction illustration of surface modification and miRNA detection on the nanochannel-ionchannel hybrid［57］

DNA被認(rèn)為是納米通道分析中強(qiáng)大的探針，能夠解決特定目標(biāo)識(shí)別和高效信號(hào)轉(zhuǎn)換的問(wèn)題，這是由于DNA具有可編程和可預(yù)測(cè)的Watson-Crick堿基配對(duì)。 因此，它可以通過(guò)已驗(yàn)證的擴(kuò)增技術(shù)，如PCR和滾環(huán)擴(kuò)增（RCA），被植入到具有數(shù)百到數(shù)千個(gè)堿基對(duì)的DNA擴(kuò)增子中［55-56］。 Gao等［57］提出了一種集成的納米通道分析策略，通過(guò)將高負(fù)電荷的RCA擴(kuò)增子固定在納米通道外表面上，實(shí)現(xiàn)了通過(guò)空間電荷效應(yīng)增強(qiáng)離子信號(hào)的目標(biāo)識(shí)別（圖8b）。 由于高負(fù)電荷的RCA擴(kuò)增子具有100 nm的尺寸，離子電流急劇增加了7454%。 在孔徑（26±8） nm的聚對(duì)苯二甲酸乙二酯膜的單個(gè)納米通道的外表面上，由miRNA-21觸發(fā)的RCA擴(kuò)增子實(shí)現(xiàn)了對(duì)miRNA-21的單堿基錯(cuò)配檢測(cè)，靈敏度達(dá)到了6 fmol/L。 理論和實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，離子信號(hào)隨著每個(gè)納米通道的局部表面電位的增加而增加，并通過(guò)降低納米通道的孔隙率密度而進(jìn)一步增強(qiáng)。 該體系利用DNA作為識(shí)別分子，構(gòu)建了一個(gè)高靈敏度和特異性的傳感平臺(tái)，對(duì)于操縱離子傳輸，離子電路的潛在邏輯門控和滲透能量轉(zhuǎn)換的潛在離子篩選方面具有應(yīng)用前景。

2.4 細(xì)胞的檢測(cè)

癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，90%的癌癥相關(guān)死亡是由癌癥轉(zhuǎn)移引起的［58］。 當(dāng)腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤部位轉(zhuǎn)移到外周血時(shí)，它們將成為循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）。 因此，在早期發(fā)現(xiàn)CTCs對(duì)癌癥的有效治療具有重要意義［59-60］。 Wang 等［61］提出了一種利用納米通道-離子通道雜交體與電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)CTCs 的高效捕獲和靈敏檢測(cè)（圖9a）。 通過(guò)在孔徑～50 nm 的AAO 離子通道表面固定可以選擇性地與CCRF-CEM（一種CTC）細(xì)胞膜上高表達(dá)的跨膜受體蛋白酪氨酸激酶7 結(jié)合的適配體探針sgc8c，實(shí)現(xiàn)對(duì)CTCs的選擇性捕獲。 被捕獲的CTCs有效地覆蓋離子通道入口，從而阻塞了納米通道-離子通道雜交體中的離子流動(dòng)，導(dǎo)致傳質(zhì)特性的變化。 此外，由于陣列通道相對(duì)于單一通道具有放大響應(yīng)的特點(diǎn)，檢測(cè)靈敏度可以大幅提高。 對(duì)于急性白血病CCRF-CEM，該體系成功檢測(cè)到1×102～2×106個(gè)cell/mL，檢測(cè)限為100 個(gè)cell/mL。 本方法為CTCs 的捕獲、檢測(cè)和釋放提供了一種簡(jiǎn)單、靈敏和無(wú)標(biāo)記的技術(shù)，在癌癥的早期臨床診斷和治療中具有巨大的潛力。

圖9 （a）納米通道-離子通道雜化體上CTC 捕獲和釋放過(guò)程的示意圖［61］； （b） CTC 捕獲和釋放過(guò)程的示意圖以及DAN/AAO混合體的相應(yīng)I-V曲線［62］Fig. 9 （a） Diagrammatical illustration of the CTCs capture and release process on the nanochannel-ion channel hybrid［61］； （b） Schematic demonstration of the CTCs capture and release processes and the corresponding I-V curves of the DAN/AAO hybrid［62］

然而，納米孔道小的表面積和相對(duì)光滑的表面是有效捕獲細(xì)胞的一個(gè)大挑戰(zhàn)。 離子通道的超小尺寸可能會(huì)阻止相對(duì)較大的藥物分子或帶負(fù)電荷的分子不能通過(guò)，這會(huì)限制其在細(xì)胞下游分析中的應(yīng)用，如藥物分析運(yùn)輸、篩查和癌癥治療。 Li 等［62］構(gòu)建了靈敏的多模態(tài)（化學(xué)、電和光學(xué)）平臺(tái)來(lái)研究細(xì)胞原位行為。 通過(guò)樹(shù)狀聚合物（聚酰胺，PAMAM）和二硫化碳連接AuNPs，形成樹(shù)枝狀聚合物-Au 納米顆粒網(wǎng)絡(luò)（DAN）薄膜，原位自組裝到孔徑～40 nm AAO 的表面形成了DAN/AAO 雜交膜（圖9b）。 由于AuNPs的高表面-體積比和PAMAM 的高密度結(jié)合位點(diǎn)，形成的網(wǎng)絡(luò)形成更大的表面積，從而暴露更多的功能基團(tuán)，導(dǎo)致DAN/AAO 雜交膜上更加不對(duì)稱的結(jié)構(gòu)和表面電荷密度分布，從而導(dǎo)致明顯的整流離子（ICR）輸運(yùn)。 DAN/AAO 雜化表面上氨基的存在使陰離子選擇性雜化膜能夠產(chǎn)生ICR 現(xiàn)象，也能促進(jìn)陰離子選擇性。 此外，ICR 性質(zhì)可以通過(guò)電解質(zhì)溶液的離子價(jià)態(tài)和pH 值來(lái)調(diào)控。 ICR 增強(qiáng)了制備的DAN/AAO 雜交膜生物分析的能力，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)CTCs的靈敏捕獲和檢測(cè)，檢測(cè)限為80個(gè)cell/mL，并具有良好的可重用性。

3 結(jié)論與展望

綜上所述，隨著固態(tài)納米通道的進(jìn)步，基于外表面功能化固態(tài)納米通道的生物傳感器可以在基于離子信號(hào)的變化下實(shí)現(xiàn)對(duì)離子、小分子、蛋白質(zhì)、多糖、核酸和細(xì)胞等一系列靶標(biāo)的高靈敏檢測(cè)。

毫無(wú)疑問(wèn)，基于外表面功能化固態(tài)納米通道在生物標(biāo)志物檢測(cè)方面取得了重大進(jìn)展。 然而，在生物標(biāo)志物檢測(cè)方面仍然存在一些挑戰(zhàn)。 例如，實(shí)際樣品中的檢測(cè)通常需要進(jìn)行繁瑣的預(yù)處理，希望外表面功能化固態(tài)納米通道的檢測(cè)能夠?qū)崿F(xiàn)簡(jiǎn)化甚至消除對(duì)樣本的預(yù)處理。 此外，復(fù)雜環(huán)境中生物標(biāo)志物產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)，導(dǎo)致對(duì)生物過(guò)程的錯(cuò)誤判斷或相關(guān)疾病的誤診，希望外表面功能化固態(tài)納米通道可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜環(huán)境中那個(gè)多樣本的同時(shí)檢測(cè)，從而顯著提高診斷準(zhǔn)確性。 最后，基于納米通道傳感器的傳感原理尚不清楚，當(dāng)靜電效應(yīng)、尺寸排阻效應(yīng)和潤(rùn)濕性變化3種效應(yīng)同時(shí)影響靶標(biāo)與探針?lè)肿酉嗷プ饔脮r(shí)的離子電流時(shí)，目前的技術(shù)無(wú)法判斷哪種效果在目標(biāo)識(shí)別中起主要作用。 無(wú)論如何，基于外表面功能化固態(tài)納米通道的研究遠(yuǎn)未結(jié)束。 隨著先進(jìn)的微納米加工和表征技術(shù)的快速發(fā)展，我們相信在不久的將來(lái)，基于外表面功能化固態(tài)納米通道可以取得令人振奮的成就。