趙欣雨 秦作佳 張曉兵 袁 林

（湖南大學化學化工學院， 化學生物傳感與計量學國家重點實驗室， 長沙 410082）

熒光成像技術(shù)得益于其高靈敏度、良好的空間分辨率和非侵入性等特點，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學領(lǐng)域［1-2］。根據(jù)發(fā)射波長可以將熒光成像分成3個區(qū)域： 可見光區(qū)（400～700 nm）、近紅外一區(qū)（NIR-Ⅰ，700～900 nm）和近紅外二區(qū)（NIR-Ⅱ，1000～1700 nm）。通常情況下，生物組織在可見光區(qū)和近紅外一區(qū)有較強的光吸收和散射以及自發(fā)熒光，這在一定程度上會影響成像的質(zhì)量。相比之下，近紅外二區(qū)受到生物組織的干擾較小，能夠?qū)崿F(xiàn)組織的深層穿透，具有良好的空間分辨率和信背比［3-5］。

目前，很多用于生物成像的近紅外二區(qū)熒光探針如碳納米管［6］、量子點［7］、稀土摻雜納米粒子［8］、有機半導體聚合物［9］和有機小分子熒光探針［10］被開發(fā)出來，其中有機小分子熒光探針由于具有結(jié)構(gòu)易修飾、光學性能可調(diào)和生物毒性小等優(yōu)點得到廣泛應(yīng)用［11］。然而大部分有機小分子熒光探針屬于常亮型，即不管它們身處何地，只要有激發(fā)光源的照射，就可以產(chǎn)生熒光信號。它們對于目標組織的成像是通過富集和滯留實現(xiàn)的，具有較差的特異性和較低的信背比，容易產(chǎn)生假陽性信號［12］。相比之下只有當特定的生物標志物存在情況下才會產(chǎn)生熒光信號變化的激活型探針具有良好的選擇性、較高的信背比以及在一定程度上降低假陽性信號的能力等優(yōu)點，能夠很好地區(qū)分病變組織與正常組織，實現(xiàn)不同疾病模型的精準成像與傳感［7，13-14］?；诖?，本文根據(jù)疾病模型分類系統(tǒng)地總結(jié)了近5 年所報道的近紅外二區(qū)激活型小分子探針，并對探針的設(shè)計思路、響應(yīng)機理以及生物應(yīng)用進行重點介紹。同時，本文還提出了目前近紅外二區(qū)激活型有機熒光探針存在的問題及今后的發(fā)展方向，為新型近紅外二區(qū)激活型探針的開發(fā)提供一定思路。

1 激活型有機熒光探針的生物成像應(yīng)用

近紅外二區(qū)激活型熒光探針由于具有選擇性好、信背比高等特點，在疾病診斷及手術(shù)導航方面有較大的應(yīng)用潛力［15-17］。通常，激活型探針本身不具有或僅具有非常微弱的熒光信號，當其與疾病標志物作用后，探針被激活并產(chǎn)生強烈的熒光信號，實現(xiàn)疾病標志物的跟蹤及成像，為疾病的診斷提供依據(jù)。因此，在這一部分中主要介紹了用于不同疾病標志物成像的NIR-Ⅱ激活型熒光探針及其響應(yīng)機理。

1.1 炎癥

炎癥是一種免疫系統(tǒng)被激活以保護宿主免受傷害的過程［18］。當病原體侵入體內(nèi)并導致組織損傷時，將會引起急性炎癥［19］。如果不加以治療，病情將會進一步加重甚至導致死亡［20］，所以對相關(guān)炎癥疾病的早期診斷尤為重要。近年來，很多對炎癥標志物有響應(yīng)的NIR-Ⅱ熒光探針被開發(fā)出來并成功實現(xiàn)疾病的早期診斷。下面將對這些探針進行詳細介紹。

1.1.1 肝炎

肝臟作為主要的代謝器官，在人體新陳代謝過程中起到了重要作用。當肝臟受到外界某種因素如病毒、藥物的作用導致肝臟損傷時，會導致發(fā)炎，在一定程度上影響肝臟的功能，進而威脅人的生命健康安全。研究表明，常見的一些活性氧物種（?OH、H2O2、ONOO－）、生物小分子（如腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）、生物硫醇）和生物酶等與肝炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［21］。

羥基自由基（?OH）被證明參與體內(nèi)炎癥如肝炎等病理過程［22］，是急性肝臟炎癥的生物標志物之一，故對?OH 的檢測有助于我們了解肝臟炎癥的病理過程，實現(xiàn)肝臟炎癥的可視化。眾所周知，剛性平面結(jié)構(gòu)和大共軛體系對于構(gòu)建熒光團十分必要，基于此，劉志洪課題組Feng 等［23］通過破壞/恢復共軛結(jié)構(gòu)和剛性平面控制熒光信號的開啟/關(guān)閉，設(shè)計了一種對羥基自由基響應(yīng)的NIR-Ⅱ探針Hydro-1080（圖1A）。由于分子一側(cè)的C—N 單鍵上C 原子為sp3雜化，所以該側(cè)的二氫苯并吲哚環(huán)與聚甲川鏈不在一個平面上，Hydro-1080分子的共軛體系被破環(huán)，導致該分子在近紅外二區(qū)沒有熒光信號。當體系中存在?OH 時，探針分子中的C—N 單鍵被?OH 氧化成C= = N 雙鍵，恢復完整的共軛結(jié)構(gòu)和剛性平面，開啟近紅外二區(qū)熒光信號（圖1B）。進一步實驗表明該探針對?OH 具有良好的選擇性和靈敏度（LOD 為0.5 nmol/L），可以用于肝臟炎癥的監(jiān)測（圖1C）。

圖1 用于肝臟炎癥成像的代表性探針。 （A）探針Hydro-1080 的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理［23］。 （B）Hydro-1080 和Et-1080 的吸收和發(fā)射光譜圖［23］。 （C）患有肝炎小鼠NIR-Ⅱ熒光成像［23］。 （D）探針TC-H2O2的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理［24］。 （E）小鼠肝損傷模型的MOST和熒光成像［24］。 （F）探針I(yè)R-990的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理［26］。 （G）HepG2細胞及APAP誘導的肝損傷模型中H2O2的NIR-Ⅱ熒光成像［26］Fig. 1 Representative probe for liver inflammation imaging. （A） Structure and response mechanism of Hydro-1080［23］.（B） Absorption and fluorescence spectra of Hydro-1080 and Et-1080 in DMSO［23］.（C） NIR-Ⅱ fluorescence images of mice liver injury［23］. （D） Structure and response mechanism of probe TC-H2O2［24］. （E） MOST and fluorescence imaging of mice liver injury model［24］. （F） Structure and response mechanism of IR-990［26］. （G） NIR-Ⅱfluorescence imaging of H2O2 in HepG2 cells and APAP-induced mice liver injury models［26］

為了檢測過氧化氫（H2O2）在肝炎過程中的表達情況，吳水珠課題組Chen等［24］構(gòu)建了一種對H2O2有響應(yīng)的探針TC-H2O2，并將其用于藥物誘導的肝損傷（DILI）模型成像。該探針采用哌嗪修飾的花菁染料作為熒光報告單元［25］，其中哌嗪的引入降低了花菁染料分子的平面性，一定程度上削弱熒光團在液態(tài)環(huán)境中聚集導致的熒光猝滅，與此同時，可以方便引入H2O2的識別基團構(gòu)建熒光探針。當該探針通過尾靜脈注射進入抗結(jié)核藥物誘導的肝損傷小鼠體內(nèi)并到達肝臟部位時，在過量H2O2作用下，識別基團硝基苯氧乙酰胺將會從TC-H2O2中脫離，探針變?yōu)樵?20 nm 處有強烈熒光發(fā)射的TC-NN（圖1D），該過程也伴隨著光聲信號的產(chǎn)生。進一步利用熒光成像和多光譜光聲斷層掃描（MOST）成像技術(shù)，探針TC-H2O2被成功用于抗結(jié)核藥物誘導的肝損傷模型的可視化點亮成像（圖1E）。然而，上述用于監(jiān)測肝損傷的可激活探針發(fā)射波長在920 nm 左右，并且斯托克斯位移較小，一定程度上可能影響生物成像的效果。針對這一問題，熊虎課題組Tian 等［26］開發(fā)了一種具有較大斯托克斯位移（200 nm），發(fā)射波長在990 nm的可激活型探針I(yè)R-990用于監(jiān)測活體內(nèi)DILI。作者通過在聚甲川骨架上引入2個吸電子端基苯并［cd］吲哚，以及H2O2的識別位點苯硼酸酯構(gòu)建了探針I(yè)R-990。該探針具有受體-π-受體（A-π-A）類型結(jié)構(gòu)，處于非熒光狀態(tài)。當H2O2存在時，探針結(jié)構(gòu)中的苯硼酸酯被氧化生成羥基，并發(fā)生1，6 分子內(nèi)自消除和π電子重排，生成具有供體-π-受體（D-π-A）類型的熒光團IRO-990。其發(fā)射波長位于990 nm（圖1F），且對H2O2具有良好的選擇性和靈敏度，檢測限低至0.59 μmol/L，該探針被成功用于 HepG2 細胞和對乙酰氨基酚（APAP）誘導的小鼠肝損傷模型中H2O2的實時監(jiān)測（圖1G）。除了藥物，食品添加劑也是誘導肝臟炎癥的因素之一。亞硝酸鹽作為一種常見的食品添加劑，廣泛用于抑制肉類和海產(chǎn)品中有害微生物的生長［27］。然而，在食品加工過程中，亞硝酸鹽與胺反應(yīng)會生成劇毒物亞硝胺，因此，長期攝入含有亞硝胺食品易引起肝臟炎癥［28］。為此，吳水珠課題組Zeng等［29］基于生物標志物觸發(fā)熒光團和藥物同時釋放的策略，通過硼酸鍵將治療藥物木犀草素與熒光團偶聯(lián)，開發(fā)了一種診療一體化探針BHC-Lut。當探針BHC-Lut 被H2O2激活后，硼酸鍵將會發(fā)生斷裂，釋放出熒光團BHC-OH 和藥物木犀草素，其中釋放出的熒光團可以產(chǎn)生強烈的光聲信號和NIR-Ⅱ熒光信號，實現(xiàn)食品添加劑誘導的小鼠肝損傷的成像，同時原位釋放的藥物木犀草素可以用于治療肝臟炎癥。

本課題組Qin 等［30］開發(fā)了一系列含有羥基調(diào)控基團的染料NIRII-HDs，其中NIRII-HD5 具有良好的穩(wěn)定性、高熒光量子產(chǎn)率和適宜的pKa等優(yōu)點。為了探究過氧亞硝酸根離子（ONOO－）在肝臟炎癥中的表達情況，通過在NIRII-HD5 上引入ONOO－響應(yīng)基團苯硼酸酯，構(gòu)建了探針NIRII-HD5-ONOO－（圖2A）。苯硼酸酯的修飾導致氧原子的給電子能力下降，使得探針幾乎沒有熒光。當ONOO－存在時，苯硼酸酯被氧化并釋放出具有強給電子能力的羥基，探針產(chǎn)生895/936 nm的比率發(fā)射熒光信號，并且隨著ONOO－含量的升高，該熒光強度比值逐漸增強（圖2B）。此外，探針對ONOO－具有良好的選擇性（圖2C），基于此作者進一步利用該探針監(jiān)測小鼠肝損傷模型中ONOO－的變化。如圖2D所示，當探針注射進入APAP處理的小鼠體內(nèi)后，肝臟區(qū)域有明顯的熒光信號產(chǎn)生，而經(jīng)藥物N-乙酰半胱氨酸（NAC）治療后的小鼠肝臟部位的熒光強度與未經(jīng)治療的小鼠相比顯著降低。上述實驗結(jié)果表明，該探針可以實時監(jiān)測小鼠肝臟中ONOO－含量的變化，為藥物誘導肝損傷的診斷提供可能。此外，張凡課題組Li 等［31］也開發(fā)了一種ONOO－激活型探針I(yè)RBTP-B 用于監(jiān)測藥物誘導的肝損傷。如圖2E 所示，該探針由苯并硫代吡喃花菁骨架和ONOO－的識別基團苯硼酸酯構(gòu)成，其中苯硼酸酯的引入使探針分子的共軛體系被破壞，導致IRBTP-B 沒有NIR-Ⅱ區(qū)吸收和發(fā)射。當ONOO－存在時，苯硼酸酯被分解，隨后探針發(fā)生電子重排反應(yīng)，生成具有完整共軛體系、發(fā)射波長位于NIR-Ⅱ的熒光團IRBTP-O。進一步實驗表明探針具有高選擇性和靈敏度，檢測限低至55.9 nmol/L，可以用于藥物誘導的小鼠肝損傷成像。

圖2 用于肝臟炎癥成像的代表性探針。 （A）探針NIRII-HD5-ONOO－的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理［30］。 （B） NIRII-HD5-ONOO－探針（5 μmol/L）與不同濃度ONOO－共孵育后的熒光光譜［30］。 （C） NIRII-HD5-ONOO－對不同分析物的熒光響應(yīng)［30］。 （D）經(jīng)APAP 處理后小鼠肝臟臟的NIR-Ⅱ熒光成像［30］。 （E）探針I(yè)RBTP-B 的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理［31］。 （F） NIR-Ⅱ Cy3-988探針的響應(yīng)機理［33］。 （G）隨HClO（0～15 μmol/L）和H2S（0～3.5 μmol/L）濃度的變化NIR-ⅡCy3-988 探針（5 μmol/L）熒光強度的變化［33］。 （H）小鼠肝臟損傷/修復模型的NIR-Ⅱ熒光成像［33］。 （I）探針NIRII-RT-ATP的結(jié)構(gòu)［34］。 （J）NIRII-RT-ATP探針（5 μmol/L）與不同濃度ATP共孵育后的熒光光譜［34］。 （K）經(jīng)APAP處理后小鼠肝臟的NIR-Ⅱ熒光成像［34］。 （L）探針TTX-P的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理 ［35］。 （M）小鼠肝臟的NIR-Ⅱ熒光成像［35］。 （N）探針NIR-Ⅱ-LAP的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理［36］。 （O）經(jīng)APAP處理后小鼠肝臟的NIR-Ⅱ熒光成像［36］Fig.2 Representative probes for liver inflammation imaging. （A） Structure and response mechanism of NIRII-HD5-ONOO－［30］. （B） NIR-Ⅱ fluorescence spectra of NIRII-HD5-ONOO－ （5 μmol/L） after reaction with various concentrations of ONOO－. （C） NIR-Ⅱ fluorescence response of NIRII-HD5-ONOO－ （5 μmol/L） toward different analytes［30］.（D） NIR-Ⅱ fluorescence imaging of liver injury after APAP treatment［30］.（E） Structure and response mechanism of IRBTP-B［31］. （F） Response mechanism of probe NIR-Ⅱ Cy3-988［33］. （G） Fluorescence intensity changes of NIR-Ⅱ Cy3-988 （5 μmol/L） after reaction with various concentrations of HClO （0～15 μmol/L） and H2S（0～3.5 μmol/L）［33］. （H） NIR-Ⅱ fluorescence imaging of mice liver injury and repair［33］. （I） Structure of probe NIRII-RT-ATP［34］. （J） NIR-Ⅱ fluorescence spectra of NIRII-RT-ATP （5 μmol/L） after reaction with various concentrations of ATP［34］. （K） Fluorescence imaging of liver injury after APAP treatment［34］. （L） Structure and response mechanism of TTX-P［35］.（M） NIR-Ⅱ fluorescence imaging of liver injury［35］.（N） Structure and response mechanism of NIR-Ⅱ-LAP［36］. （O） Fluorescence imaging of liver injury after APAP treatment［36］

氧化還原穩(wěn)態(tài)對于生物系統(tǒng)的正常運作至關(guān)重要，生物體內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變與其生理和病理過程密切相關(guān)［32］。生物系統(tǒng)的氧化-還原狀態(tài)主要來自于活性氧（ROS）水平和活性硫（RSS）水平之間的平衡。例如，炎癥組織內(nèi)HClO 等ROS 過表達，導致氧化損傷。當使用相應(yīng)的抗炎藥物治療后，炎癥組織中的RSS 上調(diào)而HClO 等ROS 下調(diào)。然而，雖已有一些NIR-Ⅱ熒光探針用于活體氧化-還原狀態(tài)的評估，但幾乎所有的探針均是基于對NIR-Ⅱ染料的結(jié)構(gòu)破壞、或通過氧化還原釋放染料進行的設(shè)計。因此，上述探針均表現(xiàn)出不可逆的響應(yīng)，不能用于氧化還原失衡的動態(tài)監(jiān)測。針對該問題，本課題組He等［33］通過在三亞甲基骨架中引入富電子1，4-二乙基-十氫喹喔啉（DQ）苯并吡喃端基及其衍生物，開發(fā)了一系列具有良好穩(wěn)定性的NIR-Ⅱ Cy3 染料用于可逆監(jiān)測HClO/RSS 介導的氧化還原環(huán)境的變化。其中DQ 的引入不僅可以起到延長吸收和發(fā)射波長的作用，還可以提供特定標志物的反應(yīng)位點。以吸收及發(fā)射波長最長的NIR-Ⅱ Cy3-988 為例，在HClO 的存在下，富電子的喹喔啉基團被氧化成氮氧化物（圖2F），使得1040 nm 發(fā)射峰降低，熒光信號減弱； 當再向體系中加入H2S 后，氮氧化物又會被還原，1040 nm 發(fā)射峰恢復（圖2G）。作者利用NIR-Ⅱ Cy3-988 探針成功實現(xiàn)了急性炎癥和藥物性肝損傷的原位檢測，以及急性炎癥治療藥物的療效評估（圖2H）。

除了活性氧探針，研究人員也發(fā)展了一些熒光探針用于肝炎相關(guān)生物小分子的檢測。例如，Ren等［34］基于羧基的螺環(huán)化設(shè)計了探針NIRII-RT-ATP，成功實現(xiàn)了藥物誘導肝毒性的實時監(jiān)測。如圖2I所示，由于探針具有分子內(nèi)螺環(huán)結(jié)構(gòu)使其處于非熒光狀態(tài)。當探針被ATP 激活后，分子內(nèi)螺環(huán)被打開，該過程在918 nm 處產(chǎn)生一個新的發(fā)射峰，并且隨著體系中ATP 含量的增多，918 nm 處的熒光信號逐漸增強（圖2J）?；诖?，作者進一步將探針用于APAP 誘導的小鼠肝毒性模型中。如圖2K 所示，當探針被注射進入小鼠體內(nèi)后，經(jīng)APAP 處理的小鼠肝臟部位有明顯的熒光信號產(chǎn)生，并且隨著APAP 處理時間的延長，熒光信號將會隨之增強，表明該探針可以實現(xiàn)小鼠肝毒性的監(jiān)測。堿性磷酸酶（ALP）作為體內(nèi)一類重要的水解酶，在生命活動中起到重要作用。當肝臟受到損傷時，該酶將會過表達，故可以作為肝臟疾病的標志物。基于此，吳水珠課題組Chen 等［35］設(shè)計了探針TTX-P 用于監(jiān)測糖尿病誘導的肝損傷。在ALP 存在的情況下，探針分子中的磷酸基團將會被水解，使得羥基的供電子能力得以恢復，生成能夠發(fā)射出強烈的NIR-Ⅱ區(qū)信號的熒光團TTX-OH（圖2L）。該探針對ALP 有良好的選擇性和靈敏度，并成功實現(xiàn)糖尿病誘導的肝損傷的檢測（圖2M）。近紅外二區(qū)探針的水溶性也是目前有待解決的問題。為了改善探針水溶性的問題，馬會民課題組Zhang 等［36］提出通過引入水溶性基團羧基來構(gòu)建了一系列水溶性明顯改善的熒光團F1-4，并在此基礎(chǔ)設(shè)計探針NIR-Ⅱ-F2LAP（圖2N），并成功實現(xiàn)藥物誘導小鼠肝炎的診斷（圖2O）。

1.1.2 腎炎

腎臟作為人體的重要器官，在清除代謝廢物，維護體內(nèi)酸堿平衡方面發(fā)揮了重要作用。常見的腎臟疾病如急性腎臟損傷和慢性腎臟炎癥在全球范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率和死亡率，目前主要通過檢測血液或尿液中相關(guān)物質(zhì)的含量來進行疾病診斷，但這些方法靈敏度較低，對于疾病早期的診斷能力較弱［37］。研究表明，當腎臟受到損傷時，腎臟上皮細胞的溶酶體將分泌N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（NAG），造成腎臟區(qū)域NAG 含量升高，因此NAG 可以作為腎臟疾病的生物標志物之一［38］。基于此，古險峰課題組Tan等［39］通過自消除連接體將NAG 酶的底物N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖殘基引入二吡咯亞硼（BODIPY）骨架中，開發(fā)了一種NAG 可激活的探針BOD-Ⅱ-NAG。當NAG 存在時，它可以催化N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖殘基的水解，隨后連接體發(fā)生1，6自消除，釋放熒光團BOD-Ⅱ-NAG-SH，導致探針在900～1200 nm范圍內(nèi)的熒光信號明顯增強（圖3A）。為了提高探針的水溶性和生物相容性，作者將探針BOD-Ⅱ-NAG 包裹在兩親性聚合物mPEG-DSPE 中，并將其用于小鼠腎臟疾病的成像，發(fā)現(xiàn)藥物誘導的急性腎臟損傷小鼠腎臟區(qū)域的熒光信號顯著增強（圖3B 和3C）。此外，作者還評估了探針BOD-Ⅱ-NAG 早期診斷急性腎臟損傷的能力，發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有的檢測方法（檢測小鼠血液中血肌酐、尿素氮和胱抑素C 的含量）相比，利用該探針可以更早地檢測出急性腎臟疾病（圖3D）。

圖3 用于腎臟炎癥成像的代表性探針。 （A） BOD-Ⅱ-NAG探針的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理［39］。 （B）在靜脈注射BOD-Ⅱ-NAGNP（16 μmol/kg）后活鼠的NIR-Ⅱ熒光成像圖［39］。 （C）經(jīng)不同處理的小鼠在不同時間點靜脈注射BOD-Ⅱ-NAGNP 后腎臟的熒光強度變化［39］。 （D） 經(jīng)不同處理的小鼠體內(nèi)KIM-1、NGAL、NAG、Cyst C、sCr 和BUN 含量的變化［39］。 （E） HP-N 系列染料及探針HP-H2O2的結(jié)構(gòu)及設(shè)計策略［40］。 （F）探針HP-H2O2（10 μmol/L）與不同濃度的H2O2孵育后的NIR-Ⅱ熒光光譜圖［40］。 （G）探針HP-H2O2在937 nm 處的熒光強度隨時間變化關(guān)系圖［40］。（H）對照組小鼠和AKI小鼠靜脈注射HP-H2O2后NIR-Ⅱ熒光圖像［40］Fig. 3 Representative probes for imaging kidney inflammation. （A） Structure and response mechanism of BOD-Ⅱ-NAG［39］. （B） NIR-Ⅱ fluorescence images of living mice after injection of BOD-Ⅱ-NAG-NP （16 μmol/kg） at different time［39］. （C） The fluorescence intensity in different groups after intravenous injection of BOD-Ⅱ-NAGNP［39］. （D） Changes in KIM-1， NGAL， NAG， Cyst C， sCr and BUN in living mice after different treatment［39］.（E） Structure and design strategy of HP-N dyes and HP-H2O2［40］（F） NIR-Ⅱ fluorescence spectra of HP-H2O2 after reaction with various concentrations of H2O2（10 μmol/L）［40］. （G） Fluorescence intensities of the probe HP-H2O2 at different time［40］. （H） NIR-Ⅱ fluorescence images of control mice and AKI mice［40］

引發(fā)腎損傷的因素除了藥物外，腎臟缺血/再灌注損傷也是導致腎臟炎癥的重要因素之一。腎臟的缺血/再灌注損傷是由特定流向腎臟的血液突然中斷造成的，容易引起急性腎臟炎癥，導致腎臟功能障礙。因此，開發(fā)高性能的NIR-Ⅱ熒光探針，通過NIR-Ⅱ熒光實現(xiàn)缺血/再灌注誘導的急性腎炎的早期診斷具有重要意義?；诖?，Ouyang 等［40］通過對七甲川花菁染料的理性改造，構(gòu)建出一系列染料HP-N1/2/3（圖3E），并在此基礎(chǔ)上設(shè)計探針HP-H2O2用于缺血/再灌注損傷誘導急性腎臟炎癥的診斷。光譜實驗表明，這3種染料均具有良好的光穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性，與此同時，隨著氨基取代基的供電子能力增強，染料的熒光量子產(chǎn)率也在隨之升高。作者在HP-N1 染料的基礎(chǔ)上引入苯基硼酸基團構(gòu)建了一種對H2O2響應(yīng)的探針HP-H2O2，隨著體系中H2O2的增加，937 nm 處的熒光強度隨之增強并在10 min之內(nèi)達到最大值（圖3F 和3G）。作者進一步將探針HP-H2O2用于腎臟缺血/再灌注誘導小鼠急性腎損傷模型中內(nèi)源性H2O2含量變化的監(jiān)測。成像結(jié)果顯示，急性腎損傷小鼠腎臟部位的熒光信號顯著增強，并且熒光強度與腎損傷程度正相關(guān)（圖3H）。該結(jié)果表明，探針HP-H2O2不僅可以實現(xiàn)小鼠腎損傷成像，還可以通過熒光亮度的強弱評估腎損傷的嚴重程度。

1.1.3 膀胱炎

在生命體中不同的器官具有不同的pH 值，作為堿性器官膀胱承載著將代謝廢物排出體外的職責，當細菌侵染膀胱或患有腎臟疾病將會導致膀胱炎癥的發(fā)生，影響生活質(zhì)量［41］?；诖?，張凡課題組Zhang 等［42］開發(fā)了一種在堿性環(huán)境中對H2O2/ONOO－有響應(yīng)的NIR-Ⅱ探針PN910，用于監(jiān)測小鼠體內(nèi)膀胱炎。如圖4A 所示，在一系列含有羥基的部花菁染料Chrodol-1/2/3 中，Chrodol-3 染料具有最長的吸收發(fā)射波長和最高的熒光量子產(chǎn)率，因此被選擇構(gòu)建探針PN910。如圖4B 所示，在pH=8.0 的堿性環(huán)境下，H2O2/ONOO－將氧化硼酸芐基并釋放出具有良好光穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性的熒光團Chrodol-3，該熒光團在900～1200 nm 范圍內(nèi)具有強烈的熒光信號（圖4C）。此外，該探針具有良好的選擇性，并且可以在50 s內(nèi)對較低水平的H2O2/ONOO－做出響應(yīng)（圖4D）?；诖?，作者進一步探索該探針的活體成像潛力。當探針經(jīng)尿路注射進入患有膀胱炎的小鼠體內(nèi)后（小鼠尿液pH=8.0），膀胱區(qū)域有明顯的熒光信號產(chǎn)生，與此同時成像后收集到的小鼠尿液在808 nm 激光照射下發(fā)出熒光，其最大發(fā)射波長為902 nm，與Chrodol-3熒光團相同。進一步證明了PN910探針對膀胱炎疾病監(jiān)測的可靠性。

圖4 用于膀胱炎癥成像的代表性探針。 （A） Chrodol 系列染料的結(jié)構(gòu)及光物理性質(zhì)［42］。 （B）雙激活型探針PN910的響應(yīng)機理［42］。 （C） PN910及Chrodol-3的吸收和發(fā)射光譜［42］。 （D）在H2O2（左）和ONOO－（右）存在下探針的熒光隨時間的變化［42］。 （E） BTPE-NO2@F127 探針的結(jié)構(gòu)和響應(yīng)機制［43］。 （F）對照組和患有間質(zhì)性膀胱炎小鼠在注射BTPE-NO2@F127后MOST成像圖（左）和NIR-Ⅱ熒光成像圖（右）［43］Fig. 4 Representative probe for imaging cystitis. （A） Structure and photophysical properties of Chrodol［42］.（B） Response mechanism of dual-activatable probe PN910［42］.（C） Absorption and fluorescence spectra of PN910 and Chrodol-3［42］.（D） Fluorescence intensity upon addition of H2O2（left） and ONOO－ （right）［42］.（E） Structure and response mechanism of BTPE-NO2@F127 probe［43］. （F） MOST images （left） and NIR-Ⅱ fluorescence images（right） of the control and the interstitial cystitis model［43］

此外，吳水珠課題組Chen 等［43］以苯并噻二唑為骨架開發(fā)了一種用于監(jiān)測間質(zhì)性膀胱炎的探針BTPE-NO2（圖4E）。苯并噻二唑類染料由于具有良好的光穩(wěn)定性，發(fā)射波長較容易擴展到NIR-Ⅱ等特點，受到了人們的廣泛關(guān)注［44］。但其在水溶液中容易聚集導致熒光猝滅，一定程度上限制了該類染料的應(yīng)用。為了解決上述問題，作者利用苯并噻二唑基團在水溶液中的聚集效應(yīng)，在分子結(jié)構(gòu)中引入2個旋轉(zhuǎn)體四苯基乙烯基團，使得該探針具有聚集誘導發(fā)光（AIE）的特性。此外，作者還向苯并噻二唑環(huán)兩端引入2 個硝基苯氧乙酰胺基團，它不僅是生物標志物H2O2的識別基團，同時還起到猝滅探針熒光的作用，降低探針的背景信號。最后，作者為了提高探針的生物相容性，利用兩親性聚合物Pluronic F127 將分子探針BTPE-NO2包裹其中構(gòu)成探針BTPE-NO2@F127。體外實驗表明，該探針對H2O2具有良好的響應(yīng)，并且在響應(yīng)后還保持良好的穩(wěn)定性?；诖?，作者進一步利用該探針監(jiān)測小鼠的間質(zhì)性膀胱炎疾病。當探針被注射進入膀胱內(nèi)，在過量產(chǎn)生的H2O2作用下猝滅基團硝基苯氧乙酰胺從探針分子中脫落，生成熒光團BTPE-NH2并產(chǎn)生強烈光聲信號和NIR-Ⅱ熒光信號，利用熒光成像和MOST 成像系統(tǒng)成功實現(xiàn)間質(zhì)性膀胱炎疾病的診斷（圖4F）。

1.1.4 關(guān)節(jié)炎

關(guān)節(jié)炎是一種常見的致殘疾病，患者主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、發(fā)紅和腫脹［45］。目前，用于關(guān)節(jié)炎的成像手段如X 射線、計算機斷層掃描（CT）和核磁共振（MRI）具有較低的分辨率，對疾病的早期診斷能力較差。為了解決上述問題，Wu 等［46］構(gòu)建探針PTA 用于風濕性關(guān)節(jié)炎的早期診斷。該探針是由連接聚乙二醇鏈的三苯胺和噻吩嗪基團構(gòu)筑，當體系中存在HClO 時，具有供電子能力的噻吩嗪基團被氧化成具有接受電子能力的酚噻嗪-5-陽離子，增強了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移過程（ICT），使得熒光團的發(fā)射波長紅移至NIR-Ⅱ（圖5A）。體外實驗表明，該探針具有良好的選擇性和光穩(wěn)定性，能夠利用熒光成像實現(xiàn)活細胞的外源性和內(nèi)源性ClO－水平的監(jiān)測（圖5B）。當探針注射進入類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA）小鼠體內(nèi)5 min 后，與正常組織相比，患有類風濕性關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)處的熒光信號增強至正常組織的4.3 倍（圖5C），表明探針PTA 可以快速地對小鼠體內(nèi)HClO 響應(yīng)并成功實現(xiàn)類風濕性關(guān)節(jié)炎的診斷。此外，宋繼彬課題組Ge 等［47］也開發(fā)了一種HClO 響應(yīng)的比率型探針DNCP@SeTT 用于兔子關(guān)節(jié)炎模型中HClO 的實時監(jiān)測。如圖5D 所示，該探針通過分子探針SeTT 包裹下轉(zhuǎn)換納米粒子DNCP 得到，其中分子探針SeTT 是具有1150 nm 發(fā)射的熒光團，它對HClO 的穩(wěn)定性較差，容易被HClO 氧化生成SeoTT，導致位于1150 nm 的發(fā)射峰降低。相反下轉(zhuǎn)換納米粒子DNCP 對HClO 較穩(wěn)定，可以持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)射出波長為1550 nm 的熒光信號。因此，可以利用1150 和1550 nm 波長處的熒光強度變化來實現(xiàn)對HClO 的檢測。體外實驗表明，隨著體系中HClO 含量的增多，比率熒光信號I1150nm/I1550nm逐漸下降，并且二者之間符合良好的線性關(guān)系，能夠?qū)崿F(xiàn)HClO 的定量檢測。此外，該探針對HClO 有高選擇性和靈敏度，檢測限低至0.4 μmol/L ，并成功實現(xiàn)關(guān)節(jié)炎兔子中HClO 的定量檢測。與此同時，吳水珠課題組She 等［48］在七甲川花菁染料的基礎(chǔ)上構(gòu)建一種用于急性關(guān)節(jié)炎成像的探針HC-N，并通過控制分子中基團的吸電子和供電子能力來實現(xiàn)NIR-Ⅱ熒光信號的開啟和關(guān)閉（圖5E）。當急性關(guān)節(jié)炎的生物標志物NO 存在時，供電子的仲胺基團將會發(fā)生N-亞硝化反應(yīng)生成吸電子基團烷基-N-亞硝基，最大發(fā)射波長被紅移至923 nm，并且隨著體系中NO 水平的升高，923 nm 處的熒光信號逐漸增強（圖5F）。此外該探針還具有良好的選擇性和靈敏度，對于NO 的檢測下限可達0.18 μmol/L 。

圖5 用于關(guān)節(jié)炎成像的代表性探針。 （A）探針PTA 的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理［46］。 （B） HeLa 細胞外源性和內(nèi)源性HClO 的熒光成像圖［46］。（C） RA 小鼠模型中HClO 的熒光成像圖［46］。（D）探針DNCP@SeTT 的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理［47］。 （E）探針HC-N 的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理［48］。 （F）探針HC-N（5 μmol/L）與不同濃度NO 響應(yīng)后的NIR-Ⅱ熒光光譜圖（左）和位于923 nm處熒光強度（右）［48］Fig. 5 Representative probes for imaging joint inflammation. （A） Structure and response mechanism of probe PTA［46］. （B） Fluorescence images of exogenous and endogenous HClO in HeLa cell［46］. （C） Fluorescence imaging of HClO in RA mouse model［46］. （D） Structure and response mechanism of DNCP@SeTT［47］. （E） Structure and response mechanism of probe HC-N［48］. （F） NIR-Ⅱ fluorescence spectra （left） and fluorescence intensity at 923 nm（right） of HC-N （5 μmol/L） after reaction with various concentrations of NO［48］

1.1.5 結(jié)腸炎

潰瘍性結(jié)腸炎是由免疫系統(tǒng)異常導致的一種自身免疫性疾病，患者通常會出現(xiàn)血性腹瀉，嚴重的還將導致結(jié)腸癌［49］。目前，通常利用腸鏡對結(jié)腸炎患者進行檢查，但這種手段通常會讓患者感到痛苦，并且需要操作者具備相應(yīng)技能。為了解決上述問題，吳水珠課題組Zeng 等［50］開發(fā)了一種ROS 探針BODXT-DHM（圖6A），進一步通過酸響應(yīng)聚合物包裹，構(gòu)建了pH/ROS 雙激活型納米探針BM@EP，并將其用于潰瘍性結(jié)腸炎的治療。該探針由熒光團-藥物二聯(lián)體和溶腸包衣構(gòu)成的，其中溶腸包衣可以靶向結(jié)腸，因為其只有在結(jié)腸液的條件下（pH＞7）可溶，從而釋放熒光團-藥物二聯(lián)體。熒光團是在具有良好穩(wěn)定性和高熒光量子產(chǎn)率的BODIPY骨架上構(gòu)建的，為了解決BODIPY熒光團容易在水溶液中聚集的問題，作者進一步向分子中引入二苯胺基團，得到具有聚集誘導發(fā)光特性的熒光團BOD-XT。隨后藥物DHM 通過硼酸酯鍵與BOD-XT偶聯(lián)構(gòu)成BOD-XT-DHM 二聯(lián)體，其中季胺化的吡啶基由于具有較強的吸電子能力產(chǎn)生光誘導電子轉(zhuǎn)移效應(yīng)（PET），起到猝滅熒光的作用。所以當該探針通過口服進入小鼠體內(nèi)并到達結(jié)腸部位時，包裹在BOD-XT-DHM 二聯(lián)體外部的溶腸包衣將會溶解，釋放出二聯(lián)體BOD-XTDHM。在過量產(chǎn)生的H2O2作用下，硼酸酯鍵會發(fā)生破裂并釋放出熒光團BOD-XT 和藥物DHM，實現(xiàn)結(jié)腸炎的成像（圖6B）和治療（圖6C和6D）。用于炎癥模型的NIR-Ⅱ激活性探針如表1所示。

表1 用于炎癥模型的NIR-Ⅱ激活型探針Table 1 NIR-Ⅱ activatable probes for inflammation models

圖6 用于潰瘍性結(jié)腸炎成像的代表性探針［50］。 （A）探針BOD-XT-DHM 的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理。 （B）小鼠口服探針BM@EP（50 mg/kg）后的熒光成像圖。 （C）經(jīng)不同處理后的小鼠體重變化。 （D）經(jīng)不同處理的小鼠在口服BM@EP探針（43.6 mg/kg）后的NIR-Ⅱ熒光成像圖（左）和結(jié)腸區(qū)域的熒光強度（右）Fig.6 Representative probe for imaging ulcerative colitis［50］. （A） Structure and response mechanism of probe BODXT-DHM. （B） NIR-Ⅱ fluorescent images of mice after oral administration of BM@EP （50 mg/kg）. （C） Changes in body mass of different groups′ mice. （D） NIR-Ⅱ fluorescence images of mice （left） and average fluorescent intensities at mice′s colon region （right） after oral dosing of BM@EP （43.6 mg/kg）

1.2 癌癥

癌癥也稱惡性腫瘤，作為世界上最致命的一種疾病，嚴重危害人們的生命健康安全。研究表明，癌癥的早期診斷不僅可以盡早干預，阻止病情的進一步惡化，也能一定程度上提高存活率。此外，目前通常依賴X射線、正電子發(fā)射斷層掃描和核磁共振等成像方法對腫瘤進行檢測，但這些方法具有空間分辨率低、靈敏度差等特點，而熒光成像正好彌補了這些缺點。因此，近年來開發(fā)了很多高靈敏度、能夠?qū)崟r監(jiān)測癌癥標志物實現(xiàn)癌癥早期診斷的熒光探針。

1.2.1 肝癌

肝癌作為一種常見的癌癥具有潛伏期長、預后差和死亡率高等特點［51］。根據(jù)其性質(zhì)可分為原發(fā)性和繼發(fā)性。其中原發(fā)性肝癌是指惡性腫瘤起源于肝臟，與繼發(fā)性肝癌相比，原發(fā)性肝癌更為常見。對于肝癌患者來說，通常采用手術(shù)切除腫瘤組織來治療。但是，目前手術(shù)切除主要通過視覺辨別腫瘤組織與正常組織，無法準確判斷腫瘤邊緣，同時對于較小的腫瘤識別能力較差，導致腫瘤切除不完全影響治療效果。為此，Ouyang 等［52］構(gòu)建了一種可激活納米探針BH-NO2@BSA，它可以對肝腫瘤細胞中高度表達的硝基還原酶響應(yīng)，實現(xiàn)肝腫瘤的清晰成像（圖7A）。該探針由分子探針BH-NO2和胎牛血清白蛋白組成，其中分子探針BH-NO2由二苯基氧雜蒽基團（電子給體）和β 二酮二氟化硼類化合物（電子受體）構(gòu)成，位于電子給體側(cè)的硝基由于具有強烈的吸電子效應(yīng)，猝滅分子探針BH-NO2的熒光； 而胎牛血清白蛋白起到了提高分子探針生物相容性的作用。當探針注射進入肝癌小鼠中，被肝腫瘤中過度表達的硝基還原酶激活，吸電子的硝基將會被還原成供電子氨基，同時產(chǎn)生強烈的光聲信號和NIR-Ⅰ/NIR-Ⅱ熒光信號，利用MOST和NIR-Ⅱ熒光成像系統(tǒng)可以實現(xiàn)腫瘤的準確定位和腫瘤邊緣清晰成像（圖7B），為腫瘤的術(shù)中切除提供指導。

圖7 用于肝癌成像的代表性探針［52］。（A）探針BH-NO2@BSA 的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理。 （B）小鼠肝腫瘤的3D MOST成像（中）和NIR-Ⅱ熒光成像導航的肝腫瘤切除（右）Fig. 7 Representative probe for liver cancer imaging［52］. （A） Structure and response mechanism of probe BH-NO2@BSA. （B） 3D MOST imaging of mouse liver tumors （middle） and NIR-Ⅱ fluorescence image-guided resection of liver tumors （right）

1.2.2 乳腺癌

乳腺癌是一種嚴重威脅女性生命健康的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率。研究表明，乳腺癌的早期診斷及治療會在一定程度上降低死亡率。林靜課題組Pan等［53］設(shè)計開發(fā)了谷胱甘肽（GSH）探針LET-7，并成功實現(xiàn)乳腺癌的早期診斷。探針LET-7由陰離子聚甲川氰化物骨架和熒光猝滅基團3，5-二（三氟甲基）苯硫酚構(gòu)成。如圖8A 所示，當體系中含有谷胱甘肽時，它將與探針LET-7 發(fā)生親核取代反應(yīng)，使得猝滅基團3，5-二（三氟甲基）苯硫酚從分子中離去，生成最大發(fā)射波長為928 nm、穩(wěn)定性良好的熒光團LET-G，并且隨著體系中谷胱甘肽含量的升高，928 nm 處的熒光強度也在逐漸增強，二者之間符合良好的線性關(guān)系（圖8B）。當探針通過瘤內(nèi)注射進入小鼠體內(nèi)，在GSH 的作用下探針LET-7被激活并發(fā)出強烈熒光，實現(xiàn)小鼠乳腺腫瘤的成像（圖8C）。

圖8 用于乳腺癌成像的代表性探針。（ A）探針LET-7的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理［53］。（ B）探針LET-7（2 μmol/L）與不同濃度GSH 響應(yīng)后的NIR-Ⅱ熒光光譜圖（左）及相應(yīng)的線性關(guān)系（右）［53］。（ C）小鼠的NIR-Ⅱ熒光成像圖［53］。（D）探針BP-A 的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理［55］。（ E）經(jīng)不同處理的小鼠的在注射探針LET-7（200 μmol/L）后的NIR-Ⅱ熒光成像圖［55］。（ F）比例型探針Rap-N的設(shè)計策略［57］。（ G）探針與NTR（10 μg/mL）共孵育后熒光強度（左）和比例熒光信號I1010 nm/I940 nm（右）隨時間的變化情況［57］。（ H）乳腺癌小鼠模型（左側(cè)腫瘤被注射NTR 抑制劑雙香豆素）的比例熒光成像（左）和信號強度（右）［57］。（ I）分子探針Q-NO2的結(jié)構(gòu)［59］。（ J）小鼠乳腺腫瘤局部轉(zhuǎn)移和遠端轉(zhuǎn)移的NIR-Ⅱ成像和（K）MOST成像［59］Fig.8 Representative probes for breast cancer imaging.（ A） Structure and response mechanism of probe LET-7［53］.（B） NIR-Ⅱ fluorescence spectra of probe LET-7（ 2 μmol/L） after reaction with various concentrations of GSH（ left）and corresponding linear relationships （right）［ 53］. （C） NIR-Ⅱ fluorescence images of mice［53］. （D） Structure and response mechanism of probe BP-A［55］.（ E） Different groups′ mice′s NIR-Ⅱ fluorescence images after intratumoral injection of BP-A（ 200 μmol/L）［55］.（ F） Design strategy of the ratiometric probe Rap-N［57］.（ G） Time dependence of fluorescence spectra（ left） and I1000 nm/I940 nm ratio of Rap-N（ right） incubation with NTR（ 10 μg/mL）［57］.（ H） Ratiometric fluorescence images（ left） and signal intensity（ right） of mice bearing breast tumors（ the left tumor injected with the NTR inhibitor dicoumarol）［57］. （I） Structure of the molecular probe Q-NO2［59］.（J）NIR-Ⅱ images and （K） MOST images of regional and distant breast cancer metastases in mice［59］

H2S作為活性硫物質(zhì)，具有促進乳腺細胞和結(jié)腸細胞增殖的作用。乳腺癌細胞中H2S的水平有明顯上調(diào)［54］，與此同時不同濃度的H2S對乳腺癌細胞的作用也截然不同——較低水平的H2S可以促進乳腺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移，而較高水平的H2S反而會導致癌細胞死亡。所以細胞內(nèi)H2S實時監(jiān)測有助于了解乳腺癌的病理生理學特性，實現(xiàn)乳腺癌診斷?；诖耍蜗嘀菊n題組Yang 等［55］開發(fā)了一種激活型探針BP-A用于乳腺腫瘤中H2S水平變化的監(jiān)測。由于對疊氮芐基存在，探針BP-A具有受體-π-受體（A-π-A）類型結(jié)構(gòu)，處于非熒光狀態(tài)。如圖8D 所示，在H2S存在的情況下，疊氮基團會被還原并發(fā)生亞胺中間體的自消除和π電子重排過程，生成具有供體-π-受體（D-π-A）的熒光團BP-O，其發(fā)射峰位于1032 nm。探針BP-A不僅可以實現(xiàn)體外H2S的快速響應(yīng)，還成功監(jiān)測小鼠乳腺腫瘤中H2S水平變化（圖8E）。

缺氧是腫瘤組織的普遍特征，研究表明腫瘤的缺氧程度與硝基還原酶表達直接相關(guān)［56］。因此，硝基還原酶不僅可以作為腫瘤的標志物之一，用于疾病診斷，同時可以衡量腫瘤的缺氧程度，為治療提供幫助。為此，張凡課題組Lan等［57］開發(fā)出NIR-Ⅱ分子平臺Py-2，并基于此成功構(gòu)建比率熒光探針Rap-N，實現(xiàn)乳腺腫瘤內(nèi)硝基還原酶的可視化（圖8F）。其中，Py-2由聚甲川和羅丹明6G 骨架構(gòu)成，其最大吸收和發(fā)射波長分別為915和1010 nm。當Py-2分子被4-硝基芐基修飾構(gòu)成探針Rap-N后，由于硝基的吸電子效應(yīng)，Rap-N 分子的最大吸收和發(fā)射波長將會藍移至805 和940 nm。在硝基還原酶作用下，4-硝基芐基發(fā)生1，6消除，釋放出熒光團Py-2，導致940 nm 發(fā)射峰逐漸降低，1010 nm 發(fā)射峰逐漸升高，比率熒光信號I1010nm/I940nm隨反應(yīng)時間的延長而增強，并在45 min內(nèi)達到最大值（圖8G）?；诖?，作者進一步將探針用于乳腺癌小鼠模型中，探索Rap-N 對活體中硝基還原酶的檢測能力。探針通過原位注射進入小鼠乳腺腫瘤，被過表達的硝基還原酶激活，探針產(chǎn)生的比率熒光信號（F1000LP/F900LP）與注射有硝基還原酶抑制劑的腫瘤相比顯著增強（圖8H），表明該探針可以實現(xiàn)腫瘤內(nèi)硝基還原酶的可視化。

對于處于早期的乳腺癌來說，腫瘤通常位于乳房內(nèi)，但如果沒有及時對乳腺癌進行診斷和良好的治療，癌癥將會發(fā)展到中晚期，惡性腫瘤可能會擴散到最近的淋巴結(jié)甚至是更遠的器官如肺部。目前，對于腫瘤轉(zhuǎn)移的檢測手段較耗時，準確性較差［58］。針對上述問題吳水珠課題組Ouyang等［59］開發(fā)了一種納米探針NP-Q-NO2用于乳腺癌轉(zhuǎn)移成像（圖8I）。該探針由分子探針Q-NO2分散在水介質(zhì)中得到。探針Q-NO2對硝基還原酶的響應(yīng)機理同上述探針。當探針注射進入乳腺癌轉(zhuǎn)移小鼠體內(nèi)并被腫瘤內(nèi)過量表達的硝基還原酶激活后，得到具有聚集誘導發(fā)光特性的熒光團Q-OH。該熒光團能產(chǎn)生增強的NIR-Ⅱ熒光信號和強烈的光聲信號，因此可以基于MOST 和熒光成像成功實現(xiàn)乳腺腫瘤以及其局部轉(zhuǎn)移和遠端轉(zhuǎn)移的可視化（圖8J和8K）。

1.2.3 肺癌

肺癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，平均每年將會有200 萬新增病例和176 萬死亡病例［60］，具有較高的發(fā)病率和死亡率。基于此，趙春常課題組Wang等［61］基于ICT（分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移）機理構(gòu)建了系列酶激活型探針用于腫瘤成像（圖9A）。這些探針通過連接基團芐基硫醚將BODIPY 熒光團與酶的底物偶聯(lián)構(gòu)成。此外，為了進一步延長BODIPY 熒光團的吸收和發(fā)射波長，通過乙烯基將吸電子基團3-乙基-1，1，2-三甲基-1H-苯并［e］吲哚引入熒光團中。以硝基還原酶探針NTR-InD為例，當探針被腫瘤內(nèi)過表達的硝基還原酶激活時，硝基將會被還原，隨后發(fā)生分子內(nèi)自消除，釋放出硫代BODIPY 熒光團InD-BOD-S。其中，硫原子的供電子能力提高，增強了ICT過程，導致熒光團InD-BOD-S的發(fā)射波長紅移至900 nm（圖9B），因此具有強烈的NIR-Ⅱ熒光信號，利用該信號可以實現(xiàn)小鼠肺部腫瘤的成像（圖9C）。此外，馬會民課題組Zhang 等［62］也設(shè)計了一種硝基還原酶激活探針RHC-NO2（圖9D），該探針由羅丹明骨架及聚甲川整合而成，當探針特異性與硝基還原酶作用后，將會生成發(fā)射波長位于921 nm 的熒光團RHC-NH2，并且隨著硝基還原酶含量的升高，位于921 nm熒光強度也隨之增強（圖9E）。此外，該探針與其他硝基還原酶探針相比，檢測限顯著降低（LOD=5.9 ng/mL），并成功實現(xiàn)小鼠肺腫瘤的成像（圖9F）。

圖9 用于肺癌成像的代表性探針。 （A）酶激活型探針的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理［61］。 （B）探針與NTR（20 mg/mL）共孵育后熒光強度隨時間變化情況［61］。 （C）經(jīng)不同處理的小鼠的在注射探針NTR-InD（30 nmol）后的NIR-Ⅱ熒光成像［61］。 （D）探針RHC-NO2的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理［62］。 （E）探針RHC-NO2（10 μmol/L）與不同濃度NTR 響應(yīng)后的NIR-Ⅱ熒光光譜圖［62］。 （F）尾靜脈注射RHC-NO2（500 μmol/L）后小鼠的NIR-Ⅱ熒光成像圖［62］Fig. 9 Representative probes for lung cancer imaging. （A） Structure and response mechanism of enzyme-activated probes［61］. （B） Time dependence of fluorescence spectra of Rap-N （20 mg/mL） incubation with NTR［61］. （C） Different groups′ mice′s NIR-Ⅱ fluorescence images after injection of the probe NTR-InD（30 nmol）［61］. （D） Structure and response mechanism of probe RHC-NO2［62］.（E） NIR-Ⅱ fluorescence spectra of probe RHC-NO2（10 μmol/L） after reaction with various concentrations of NTR［62］. （F） NIR-Ⅱ images of lung tumor-bearing mice after tail vein injection of RHC-NO2 （500 μmol/L）［62］

1.2.4 結(jié)腸癌

結(jié)腸癌作為三大常見的癌癥之一，具有較高的發(fā)病率和死亡率，每年平均有180萬新增病例和88.1萬死亡病例［63］。關(guān)于結(jié)腸癌的檢測，人們進行了一系列研究［64-67］。H2S作為一種活性硫物質(zhì)在腫瘤的發(fā)展中具有重要作用，研究表明過量產(chǎn)生的H2S可以作為腫瘤的標志物之一，用于癌癥的早期診斷。基于此劉志洪課題組Dou等［64］設(shè)計了一系列對H2S有良好響應(yīng)的探針WH-X用于結(jié)腸癌的早期診斷（圖10A）。其中，WH-1探針的結(jié)構(gòu)與上述探針NTR-InD相似，被激活后的發(fā)射波長較短均處于900 nm左右。為了進一步提高探針的吸收和發(fā)射波長，作者將苯并吲哚鹽替換成具有更大共軛平面的萘內(nèi)酰胺，與此同時還向BODIPY熒光團上引入不同的供電子基，構(gòu)成探針WH-2/3/4。當H2S存在于體系中時，將會與WH-X發(fā)生親核取代，導致熒光猝滅基團4-硝基苯硫酚從分子中離去并釋放出具有強供電子能力的硫醇，增強了ICT過程，使得探針發(fā)射波長紅移至NIR-Ⅱ。隨著分子共軛體系的延長和給電子基的給電子能力增強，激活后探針的最大發(fā)射波長將會從925 nm（WH-1）紅移至1205 nm（WH-4）（圖10B）。由于WH-3探針具有較長的發(fā)射波長（最大發(fā)射波長為1120 nm）和較理想的熒光量子產(chǎn)率（0.17%），被選作監(jiān)測活體內(nèi)H2S 的探針，并成功實現(xiàn)了結(jié)腸癌細胞和腫瘤中H2S 水平的變化（圖10C 和10D）。此外，趙春常課題組Xu 等［65］也開發(fā)了一種H2S 響應(yīng)的探針用于結(jié)腸腫瘤成像 。如圖10E 所示，將2 種熒光團（ZX-NIR 染料和氮雜BODIPY染料）包裹在納米復合材料的內(nèi)部進而構(gòu)建出探針NIR-Ⅱ@Si。其中發(fā)射波長位于600 nm的熒光團ZX-NIR 在H2S作用下會使吸電子基團4-硝基苯硫酚從分子中脫落，釋放出供電子能力增強的硫醇，產(chǎn)生發(fā)射波長紅移至900 nm 的熒光團。相反，氮雜-BODIPY 染料對H2S 較穩(wěn)定，可以持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)射出波長為700 nm的熒光信號。因此，當探針通過瘤內(nèi)注射進入小鼠體內(nèi)被過量存在的H2S激活后，會產(chǎn)生強烈的NIR-Ⅰ（氮雜-BODIPY 染料）/NIR-Ⅱ區(qū)熒光信號（激活后的ZX-NIR），該信號可用于腫瘤成像。與此同時，隨著體系中H2S含量的增高，比率熒光信號I700nm/I600nm將隨之增強，并且二者之間符合良好的線性關(guān)系，因此可以利用比率熒光信號的變化實現(xiàn)H2S的靈敏檢測。

圖10 用于結(jié)腸癌成像的代表性探針。 （A） WH-X系列探針的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理［64］。 （B） WH-X探針被H2S激活后的熒光光譜。 （C） 經(jīng)不同處理的細胞與探針WH-3（500 μmol/L）共孵育后的NIR-Ⅱ熒光成像［64］。 （D） 注射探針WH-3（20 μL， 1 mmol/L）后小鼠的NIR-Ⅱ熒光成像圖［64］。 （E） 探針NIRII@Si的結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理［65］。 （F） FRET供體NAB和受體NRh的結(jié)構(gòu)［67］。 （G） 探針pTAS在940和1026 nm處的熒光強度隨pH值變化關(guān)系圖［67］Fig. 10 Representative probes for colon cancer imaging. （A） Structure and response mechanism of WH-X probes［64］. （B） Fluorescence spectra of WH-X probe［64］. （C） Fluorescence images of different treated cells with probe WH-3 ［64］. （D） NIR-Ⅱ fluorescence images of mice. after injection of probe WH-3 （20 μL， 1 mmol/L）［64］.（E） Structure and response mechanism of NIRII@Si［65］. （F） The structure of FRET donor NAB and acceptor NRh［67］. （G） Fluorescence intensity at 940 and 1026 nm of probe pTAS as a function of pH［67］

此外，通過監(jiān)測微環(huán)境pH值變化也可以實現(xiàn)結(jié)腸腫瘤的診斷。腫瘤與其它正常組織相比能量代謝有較大不同，即癌細胞優(yōu)先攝取大量葡萄糖，并通過非氧化分解代謝將其轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，進而導致細胞外pH 值下降［66］。目前，pH 傳感器只能對固定的pH 區(qū)間進行響應(yīng)，響應(yīng)區(qū)間不可調(diào)節(jié)，一定程度上影響了對pH 值變化的實時監(jiān)測。為了解決上述問題，張凡課題組Zhao 等［67］基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）原理，通過改變FRET 供體和受體的比例構(gòu)建出一系列pH 響應(yīng)區(qū)間可調(diào)的探針pTAS。如圖10F 所示，F(xiàn)RET 供體NAB 是具有NIR-Ⅱ發(fā)射（最大發(fā)射波長為949 nm）的氮雜-BODIPY 染料，該染料對于pH 值的變化沒有響應(yīng)，可以提供參比熒光信號。FRET 受體NRh染料在羅丹明染料的基礎(chǔ)上構(gòu)建，作者通過控制NRh 染料中螺內(nèi)酰胺環(huán)的開環(huán)和閉環(huán)來實現(xiàn)NIR-Ⅱ熒光信號的開啟和關(guān)閉。當螺內(nèi)酰胺環(huán)處于閉環(huán)狀態(tài)時，NRh 染料在NIR-Ⅱ沒有熒光信號，在H+存在的情況下，螺內(nèi)酰胺環(huán)會發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，生成NRhH+熒光團，該熒光團激發(fā)和發(fā)射波長分別為986和1026 nm。當體系中pH值降低時，949 nm 的發(fā)射峰逐漸減弱，1026 nm 的熒光信號逐漸增強（圖10G）。為了提高探針的生物相容性，作者將不同比例的NAB 和NRh 包裹進入DSPE-PEG2000-OCH3中形成pTAS，構(gòu)成了具有不同pH 響應(yīng)區(qū)間的探針pTAS-1-3。此外，通過結(jié)合這3 種探針，pTAS 對pH 的響應(yīng)區(qū)間可以拓寬至其它pH 探針的2 倍，并成功實現(xiàn)結(jié)腸腫瘤的成像及其pH變化的監(jiān)測。

1.2.5 卵巢癌

卵巢癌作為一種常見的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率。由于卵巢癌處于早期時沒有明顯癥狀所以導致大部分患者在診斷出卵巢癌時就處于晚期［68］。研究表明，β-糖苷酶（β-Gal）水平的增加通常與卵巢癌的發(fā)生有關(guān)［69］，所以對β-Gal的實時監(jiān)測有助于實現(xiàn)卵巢癌的早期診斷。基于此，古險峰課題組Chen 等［70］構(gòu)建了一種NIR-Ⅱ熒光探針BOD-M-βGal用于活體內(nèi)β-Gal的成像。如圖11A 所示，該探針采用BODIPY 染料作為熒光報告基團，為了進一步延長共軛體系，作者通過乙烯基將吸電子基團3-乙基-1，1，2-三甲基-1H-苯并吲哚引入熒光團中。當探針通過瘤內(nèi)注射進入卵巢癌小鼠體內(nèi)后，在過表達的β-Gal 作用下，探針BOD-M-βGal 將會發(fā)生分子內(nèi)自消除，生成熒光團BOD-M-SH，進而產(chǎn)生強烈的NIR-Ⅱ熒光信號，實現(xiàn)卵巢腫瘤成像（圖11B）。此外，郭志前課題組Zhang 等［71］基于分子雜交策略構(gòu)建出一系列熒光團Flavchromenes（圖11C），并在此基礎(chǔ)上設(shè)計出對β-Gal有響應(yīng)的NIR-Ⅱ探針用于活體內(nèi)卵巢腫瘤的成像。其中Flavchromenes是將2種發(fā)色團（黃酮衍生物和色烯）通過聚甲川鏈偶聯(lián)構(gòu)成的具有D-π-A結(jié)構(gòu)的熒光團，該類熒光團不僅具有花菁染料高亮度的優(yōu)點，同時還具有較高的穩(wěn)定性和抗溶劑猝滅特性?；谏鲜鰺晒鈭F的優(yōu)良光學特性，作者在Flavchrom-2染料上引入β-Gal的識別基團，以此構(gòu)建探針Flavchrom-4（圖11D）。光譜實驗表明，探針Flavchrom-4 對β-Gal 有良好的響應(yīng)（圖11E），檢測限低至0.037 U/mL。此外，活體成像結(jié)果顯示，該探針可以成功實現(xiàn)卵巢腫瘤的定位和成像（圖11F）。用于癌癥模型的NIR-Ⅱ激活型探針如表2所示。

表2 用于癌癥模型的NIR-Ⅱ激活型探針Table 2 NIR-Ⅱ activatable probes for cancer models

圖11 用于卵巢癌成像的代表性探針。 （A）BOD-M-βGal 結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理［70］。 （B）注射探針BOD-M-βGal（30 nmol）后小鼠的NIR-Ⅱ熒光成像圖［70］。 （C）熒光團Flavchromenes的結(jié)構(gòu)［71］。 （D）探針Flavchrom-4的響應(yīng)機理［71］。 （E）探針與β-Gal共孵育后吸收光譜和發(fā)射光譜［71］。 （F）注射探針Flavchrom-4后小鼠的NIR-Ⅱ熒光成像圖（左）和MOST成像圖（右）［71］Fig. 11 Representative probes for imaging ovarian cancer. （A） Structure and response mechanism of BOD-MβGal［70］. （B） NIR-Ⅱ fluorescence images of mice after injection of probe WH-3 （30 nmol）［70］. （C） Structure of Flavchromenes［71］. （D） Response mechanism of Flavchrom-4 probe［71］. （E） Absorption and fluorescence spectra of Flavchrom-4 after incubation with β-Gal［71］. （F） MOST images （left） and NIR-Ⅱ fluorescence images （right） of the ovarian cancer model after injection of Flavchrom-4［71］

1.3 神經(jīng)系統(tǒng)疾病

阿爾茲海默癥（AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，患者通常具有記憶力減退、認知障礙等臨床癥狀［72］。目前，對于阿爾茲海默癥的診斷手段主要為腦脊液檢測，但該檢測方法需要進行脊柱抽液，是一種侵入性手段，此外還具有耗時長，對操作技術(shù)要求高等缺點，進一步限制了該方法的發(fā)展。所以開發(fā)出一種靈敏度高，準確性好的非侵入性手段以實現(xiàn)對阿爾茲海默癥的診斷是十分必要的。淀粉樣蛋白-β（Aβ）斑塊被認為是AD 疾病的生物標志物，然而目前對于檢測Aβ斑塊的探針最大發(fā)射波長通常處于近紅外一區(qū)，具有較低的組織穿透深度和信背比，一定程度上影響成像效果。浦侃裔課題組Miao 等［73］基于TICT（扭轉(zhuǎn)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移）機理開發(fā)了一種NIR-Ⅱ可激活型探針DMP2 用于活體中Aβ斑塊的成像。其中，DMP2 由供電子基團N，N-二甲氨基苯基和吸電子基苯并［cd］吲哚構(gòu)成，此外為了延長共軛鏈，進一步向分子中引入噻吩基團（圖12A）。與作者構(gòu)建出的其他D-π-A 結(jié)構(gòu)探針DMP1、DMP3 和ECV 相比，DMP2 的給電子基團具有最強的供電子能力，從而導致供體和給體基團之間的電子推-拉效應(yīng)增強，熒光團的發(fā)射波長紅移至NIR-Ⅱ（圖12B）。此外，探針DMP2 還具有良好的血腦屏障穿透能力以及對Aβ斑塊親和性強的特點，被作者進一步用于AD 小鼠模型中Aβ斑塊的成像。當探針DMP2通過靜脈注射進入患有AD 的小鼠顱內(nèi)后，將會與Aβ斑塊特異性結(jié)合進而抑制探針TICT 狀態(tài)，產(chǎn)生強烈的NIR-Ⅱ熒光信號，并實現(xiàn)對AD小鼠模型中Aβ斑塊的成像（圖12C）。

圖12 用于阿爾茲海默癥成像的代表性探針［73］。 （A） DMP2 結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機理。 （B） DMP2 在不同極性溶劑中的熒光光譜。 （C）注射探針DMP2（2 mg/kg）后健康小鼠（左）和患有AD小鼠（右）的腦部NIR-Ⅱ熒光成像圖Fig. 12 Representative probes for imaging Alzheimer′s disease［73］. （A） Structure and response mechanism of DMP2. （B） Fluorescence spectra of DMP2 in different solvents. （C） NIR-Ⅱ fluorescence imaging of the brain of healthy mice （left） and AD-model mice （right） after injection of probe DMP2 （2 mg/kg）

2 結(jié)論與展望

本文根據(jù)疾病模型分類系統(tǒng)總結(jié)了近年來激活型NIRⅡ小分子探針在生物成像應(yīng)用中的研究進展，并對這些激活型探針的設(shè)計策略及響應(yīng)機理進行了重點介紹。與常亮型探針相比，激活型探針只對特定的生物標志物響應(yīng)后才產(chǎn)生熒光信號的變化，這極大地避免了假陽性信號、提高了信背比，使成像結(jié)果更為高效和精準，展現(xiàn)出良好的活體成像應(yīng)用潛力。雖然NIR-Ⅱ激活型小分子探針有了較大進展，但目前的開發(fā)仍然處于初級階段，還存在很多問題有待解決。

探針波長 近紅外二區(qū)范圍定義為1000～1700 nm，然而目前存在的大部分探針發(fā)射波長均集中在900～1000 nm 范圍內(nèi)，成像時使用探針的尾峰信號進行成像，亮度損失過多，導致信背比差。此外，多篇文章已報道，在1300 nm后波段的成像效果好于1000～1300 nm間的成像效果，然而目前報道的探針中并沒有發(fā)射波長超過（＞1300 nm）的激活型探針。對此，開發(fā)具有NIR-Ⅱa（1300～1400 nm）區(qū)和 NIR-Ⅱb（1500～1700 nm）區(qū)的激活型NIR-Ⅱ小分子探針意義重大。

探針亮度與穩(wěn)定性 亮度主要由摩爾吸光系數(shù)以及熒光量子產(chǎn)率2 個因素共同決定的，然而根據(jù)理論可知，小分子染料隨著發(fā)射波長的紅移，熒光量子產(chǎn)率將會隨之下降，所以具有NIR-Ⅱ發(fā)射的探針普遍亮度較低。提高熒光量子產(chǎn)率不僅可以降低激發(fā)光的功率進而減少組織照射受到損傷的概率，同時也可以進一步提高成像信背比，因此，未來對于高亮度的NIR-Ⅱ激活型探針的開發(fā)是十分必要的。此外，探針光化學穩(wěn)定性也是提高成像準確性以及質(zhì)量的重要因素。在成像過程中，一個對激發(fā)光以及體內(nèi)活性物質(zhì)穩(wěn)定的探針才能有效避免假陰性信號的產(chǎn)生。

探針靶向性 目前大部分有機小分子探針水溶性較差，通過靜脈注射后很容易富集在肝臟和脾臟等內(nèi)皮網(wǎng)狀組織中，難以到達其它所需病變組織。目前所報道的大部分激活性型探針基本均是被動靶向，因此進一步構(gòu)建具有主動靶向的激活型小分子探針對于拓寬其在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用范圍具有重要意義。

探針標志物以及識別基團的優(yōu)化 疾病標志物的選擇十分重要，然而目前很難有專一性極強的標志物，大多數(shù)標志物在不同疾病模型中均存在，這就存在誤判疾病類型的可能性。其次，目前探針識別基團的選擇性也存在局限性，在體內(nèi)復雜環(huán)境下很難不受其它物質(zhì)的干擾。為此，針對探針標志物，發(fā)現(xiàn)疾病模型中獨特性更強專一性更好的標志物十分重要。此外，設(shè)計特異性更好的識別基團，進一步構(gòu)建出可以同時對多種疾病標志物進行響應(yīng)的探針也可以有效避免假信號的產(chǎn)生，實現(xiàn)更精準的活體成像效果。