李凱璇 陳晉榮 鄒倩倩 時鵬飛 劉麗賞* 張書圣*

（1臨沂大學醫(yī)學院， 臨沂 276000）

（2臨沂市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科， 臨沂 276000）

目前，生化分析技術可以對蛋白、糖、核酸、毒素和金屬離子等多種靶標進行定量檢測，已經(jīng)在藥品檢驗、法醫(yī)鑒定和臨床診斷等多個領域發(fā)揮重要作用。隨著社會的發(fā)展，生化分析技術也迎來了新的挑戰(zhàn)，很多情況下，均需要對靶標進行現(xiàn)場即時檢測（POCT）［1-3］。但這些靶標往往具有尺寸小、含量低的特點［4］，直接且準確檢測及定量十分困難，而實驗室中的技術往往依賴專業(yè)儀器，存在體積龐大、操作復雜和不方便攜帶等缺點，導致無法實現(xiàn)現(xiàn)場即時檢測［5］。因此，降低檢測成本，提高檢測效率，減少儀器依賴，進而實現(xiàn)現(xiàn)場即時檢測是生化分析研究的重要方向［6］，尤其是新型冠狀病毒感染的肺炎疫情的爆發(fā)使得即時生化分析技術的開發(fā)成為需求熱點［7-8］。開發(fā)出如驗孕試紙條、血糖計等便攜以及不依賴專業(yè)儀器的方法一直有迫切的需求和廣闊的市場前景［9］，可視化檢測方法的發(fā)展提供了一種新穎的解決方案，視覺傳感系統(tǒng)可以聯(lián)合智能手機，尤其是在資源有限的地區(qū)具有巨大的應用潛力［10-14］。近年來，基于多種讀取信號的可視化分析傳感技術已經(jīng)開發(fā)，如基于顆粒計數(shù)的可視化檢測方法，可以直觀地看到檢測結果，并進行簡單的計數(shù)定量檢測［15］，基于顏色變化的比色分析法，通過檢測體系的顏色變化達到檢測效果［16］，基于液晶傳感的光學檢測方法，在偏光下觀察液晶基底的顏色變化來檢測靶標［17］，基于距離變化的可視化檢測方法通過微流控等裝置，可以直接定量檢測結果［18］，以及基于側向流動試紙條的檢測方法，操作簡便，結果直觀，可適用性強［19］。這些新方法不僅具有良好的檢測性能，同時滿足簡便經(jīng)濟等實用性； 因此這些新技術的開發(fā)推動了可視化生物檢測的發(fā)展與進步，并為今后現(xiàn)場即時檢測的實現(xiàn)奠定了技術基礎。

1 基于顆粒計數(shù)的可視化技術

顆粒計數(shù)是免疫分析的前沿技術，可以實現(xiàn)早期診斷，對生物標志物在1 amol/L～1000 fmol/L 范圍內(nèi)實現(xiàn)定量分析，理論上顆粒計數(shù)方法可以實現(xiàn)對單個分子的檢測［20］。Zhou 等［21］首先提出了一種使用金納米顆粒（GNP）探針輔助夾心的技術，利用GNP 探針制成抗體功能化芯片，與抗原結合后通過掃描電子顯微鏡（SEM）對金納米顆粒計數(shù)來實現(xiàn)靶標的檢測，并以標準癌胚抗原為例進行了驗證。如圖1A所示，首先使用抗癌胚抗原（CEA）抗體標記GNP，并將抗體修飾到硅片上，當CEA 與硅片上的抗體結合后，加入GNP 修飾的二抗與其復合物形成三明治夾心結構，通過SEM 掃描后即可觀測計數(shù)。此方法需要借助SEM儀器才能實現(xiàn)計數(shù)檢測，無法實現(xiàn)在條件有限區(qū)域的即時檢測。Zhou等［22］隨后嘗試利用T7噬菌體斑點作為讀取信號，進行肉眼定量檢測如圖1B 所示，此方法依賴于2種探針，一種是同時固定有T7 噬菌體和與目的基因互補寡核苷酸的金納米顆粒T7-GNP，另一種探針為能與目的基因互補的寡核苷酸修飾的磁性微粒（MNP）。靶miRNA 的存在使得上述2 種探針形成類似于“三明治”結構的復合物，引入競爭性金結合肽與GNP結合，將T7噬菌體從復合物中釋放，磁分離T7噬菌體后將其接種到宿主細菌培養(yǎng)基上，通過對培養(yǎng)基上的斑點進行計數(shù)即可量化目標基因，此方法對單靶點和雙靶點miRNA 的檢出限分別是3和5 amol/L。在此方法基礎上，Xu等［23］又使用不同噬菌體對不同靶標（H9N2病毒）實現(xiàn)了可視化檢測。如圖1C所示，用抗噬菌體抗體和抗禽流感病毒（AIV）抗體修飾的M13噬菌體與GNP結合，得到M13-GNP探針，用抗AIV抗體修飾磁性微粒得到M13-MNP探針。2種探針均可結合H9N2病毒的血凝素蛋白形成具有夾層結構的復合物，夾層結構復合物經(jīng)過磁分離處理后接種到宿主細胞（ER2738）的瓊脂板上，M13噬菌體上攜帶大腸桿菌LacZα 基因，經(jīng)過培養(yǎng)可以產(chǎn)生色澤明顯、肉眼可見的亮藍色斑塊。通過對培養(yǎng)皿上的斑塊計數(shù)即可實現(xiàn)對靶標簡便的、直觀的和靈敏的定量，具有對檢測設備要求低、易操作和可用肉眼觀察等優(yōu)點。

圖1 （A） GNP 探針輔助SEM 計數(shù)芯片原理圖［21］； （B） 以噬菌體-金納米生物材料為探針進行靶miRNA 的計數(shù)［22］； （C） 利用噬菌體-金納米顆粒為探針進行靶病毒的肉眼計數(shù)［23］Fig. 1 （A） Schematic of GNP probe-assisted SEM-counting chip［21］；（B） The phage-gold nanobiological material was used as a probe for gross enumeration of target miRNA［22］； （C） Macroscopic counting of target viruses using phage-gold nanoparticles as probes［23］

Chen 等［15］嘗試將氣泡作為識別信號，通過智能手機拍照并計數(shù)從而實現(xiàn)對靶蛋白分子的定量，原理如圖2所示，首先利用捕獲抗體修飾磁性微球，捕獲靶蛋白分子后形成“捕獲抗體-磁性微球-靶蛋白分子”復合物，進一步與鉑納米顆粒（PtNPs）結合后形成夾心復合物。使用外磁場將夾心復合物與過氧化氫溶液一起沉入微泡芯片上的方形微孔陣列內(nèi)，GNP 可以催化過氧化氫分解產(chǎn)生氧氣，方形微孔陣列中因為氧氣的積累而出現(xiàn)明顯的微泡，借助智能手機上配備的移動鏡頭（9倍放大）可以清晰的觀察到。借助圖像分析程序，對智能手機拍攝的在各種條件下產(chǎn)生的微氣泡進行計數(shù)，從而實現(xiàn)定量分析。使用此方法用于前列腺切除術后前列腺特異性抗原（PSA）的檢測，其檢測檢出限為2.1 fmol/L。同時使用此方法來檢測人絨毛促性腺激素β亞基（β-HCG）的含量以此來判斷是否存在早期妊娠，其檢出限為0.034 U/mL。

圖2 基于鉑納米粒子的微氣泡分析原理圖［15］Fig.2 Schematic of platinum nanoparticle based microbubbling assay［15］

Kim 等［24］提出了一種基于原位生成多面體銅納米殼的可視化DNA 檢測方法，原理如圖3 所示。將目標DNA 捕獲在玻片上后，與修飾互補DNA 的金納米顆粒形成三明治復合物，然后將玻片浸入銅多面體納米殼（CuP）增強溶液中，借助在金納米顆粒（AuNPs）上的聚乙烯亞胺（PEI）的作用，使CuP在金納米顆粒上以一種可控的形式生成，并且不會有明顯的非特異性生長。在10 min內(nèi)，就可檢測載玻片上的銅多面體的橙色可見斑點。這種方法不需要分析儀器的輔助就可以檢測到低至8×10-15mol/L 的DNA（炭疽序列）以及2700 個病毒拷貝（臨床糞便樣本中的諾如病毒）。此方法在檢測限度、動態(tài)范圍、易操作性、成本、檢測時間以及樣品總量等方面表現(xiàn)優(yōu)越。

圖3 基于CuP增強的裸眼DNA檢測方法原理圖［24］Fig.3 Schematic of the CuP-enhanced naked eye DNA detection method［24］

2 基于液晶傳感器的可視化檢測

液晶（Liquid crystal）是介于晶體與液體之間的中間狀態(tài)，同時具有晶體和液體的特性，比如靈敏的反應取向、彈性應變和雙折射的性質(zhì)［25］。在液晶表面發(fā)生的化學或生物相互作用會導致內(nèi)部液晶分子的取向變化，而液晶分子取向的變化會導致宏觀的液晶光學信號改變［26］，液晶分子的這一獨特性質(zhì)被應用于生物分子的可視化分析。Shen 等［27］開發(fā)了一種以液晶的表面固定化為基礎的DNA 檢測方法，發(fā)現(xiàn)適當長度的單鏈DNA（ssDNA）作為探針固定在三乙氧基甲硅烷基丁醛（TEA）修飾的固體表面時可以導致液晶的同向取向，檢測原理如圖4 所示。作者將不同濃度的ssDNA 探針固定在有TEA 修飾的玻片上，液晶的同向取向可由含有22 個堿基且濃度為20 nmol/L 的ssDNA 探針經(jīng)過表面固定處理后實現(xiàn)。液晶形成同向取向后的光學圖像是灰暗的，一旦靶DNA 與ssDNA 特異性結合，就會破壞LC的同向取向狀態(tài)，進而產(chǎn)生明亮的光學外觀，這一光學信號可以通過交叉偏振器被肉眼觀測到，其檢測限約為0.1 nmol/L。這種DNA 測定方法具有較強的特異性，不需要熒光等特殊標記并且操作簡便［27］。

圖4 基于液晶的表面固定單鏈DNA雜交檢測［27］Fig. 4 Liquid crystal-based detection of DNA hybridization using surface immobilized single-stranded DNA［27］

許多陽離子尤其對液晶的錨定作用有很大的影響［28-29］，尤其是Na+，只需要少量吸附就可以達到破壞液晶取向的目的［30］?；贒NA 帶負電荷的特性，可利用DNA 與金屬離子形成絡合物來改變液晶的取向［31］，這種現(xiàn)象可被用來反映DNA 的存在，但無法保證鈉離子-DNA 絡合物中的DNA 是特異性的靶DNA 還是非特異DNA。Liu 等［32］引入了可以特異識別靶標DNA 的肽核酸（PNA），與DNA 帶負電荷不同的是，肽核酸是電中性的，不會與金屬離子結合形成絡合物，從而不會影響液晶的方向。如圖5 所示，PNA 可以被用為特異性探針，固定在反應表面，使其與靶DNA 互補雜交，而不會與非特異DNA 分子雜交，以此來影響液晶方向判斷是否為靶DNA，此方法可檢測到600 bp的靶DNA，達到10 fmol/L的檢測限［32］。

圖5 液晶法檢測DNA 的原理（紅色探針代表DNA 而藍色探針代表PNA）［32］Fig. 5 Principles for detection of DNA by using LC（Red probes represent DNA whereas blue probes represent PNA）［32］

赭曲霉毒素（OTA）是一種可以侵害動物肝臟與腎臟的真菌毒素，對人體具有極其致命的危害，可能存在于人們?nèi)粘Ｊ秤玫氖称放c飲料中。為了能夠高靈敏檢測低濃度的OTA，Khoshbin 等［33］探索了一種液晶型核酸適配體傳感器。在OTA 存在的條件下，DNA 在三乙氧基硅烷/N，N-二甲基-N-（3（三甲氧基硅基）丙基）-1-十八胺氯（APTES/DMOAP）修飾的玻璃基板表面上形成π型結構，會誘導液晶分子發(fā)生取向變化，這一現(xiàn)象是本技術的基礎。在沒有OTA 存在的情況下，DNA 鏈會呈現(xiàn)π型結構。一旦體系內(nèi)存在OTA，那么π型結構就會與OTA 結合，進而導致DNA 鏈與特定適配體的結合受到干擾。此時液晶的取向由會發(fā)出亮光的隨機取向狀態(tài)轉(zhuǎn)換為光亮灰暗的同向取向狀態(tài)。在偏振光學顯微鏡的觀測下，適配體傳感器的光學圖像由明亮變灰暗。如圖6所示，液晶型核酸適配體傳感器在各個不同濃度的OTA 溶液中存在時發(fā)出的亮度不同，該傳感器可以在低至0.63 amol/L 的超痕量水平下檢測OTA，該傳感器還可以靈敏地檢測存在于葡萄汁、咖啡，甚至人血清內(nèi)的OTA［33］。

圖6 適配體液晶傳感器在不同濃度OTA存在下的偏振光圖像［33］Fig.6 The polarized images of the LC-based aptasensor in the presence of the various concentrations of OTA［33］

3 基于比色法的可視化檢測方法

比色傳感器通過使用納米酶或納米酶樣材料來催化伴隨顏色變化的化學反應，從而實現(xiàn)檢測。此外，化學或生物分析物的比色識別也可以通過金屬納米顆粒獨特的顏色特性來實現(xiàn)?；诒壬治龅臋z測方法因其低成本、便攜和易操作等優(yōu)勢，可通過肉眼實現(xiàn)對靶標的定量，廣泛適用于POCT［1，34-35］。

3.1 基于金納米顆粒的比色分析方法

金納米顆粒具有獨特的局部表面等離子共振性質(zhì)，且其與金納米顆粒的形狀、尺寸、顆粒間距和表面性質(zhì)相關，因此可以將金納米顆粒開發(fā)為顯色底物，達到肉眼識別的效果［36-37］。例如，金納米棒長度改變會導致其溶液顯示出顏色變化并被肉眼識別，基于這一現(xiàn)象，Ma 等［38］利用待分析物引發(fā)的刻蝕使金納米棒縮短，呈現(xiàn)出不同的顏色。如圖7A 所示，不同濃度的過氧化氫在Fe2+存在的條件下產(chǎn)生自由基，可以使金納米棒發(fā)生蝕刻而縮短從而顯示出不同的顏色，覆蓋了從400～760 nm 的可見范圍。將其與傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA）相結合，可實現(xiàn)蛋白質(zhì)生物標志物的檢測，如圖7A所示，附著在抗體-抗原-二抗夾心復合物表面的過氧化氫酶催化過氧化氫分解，產(chǎn)生的自由基，使金納米棒發(fā)生蝕刻，從而可視化檢測蛋白質(zhì)分子?；谕瑯釉恚麄冞M一步對小分子及miRNA-21進行了可視化檢測（圖7B），溶液的最終顏色與目標蛋白的濃度密切相關。

圖7 （A） NEQ法用于H2O2的可視化定量。 （B）提出的NEQ-ELISA蛋白質(zhì)可視化半定量檢測的原理［38］Fig.7 （A） Naked-eye semiquantitative （NEQ） assay for visual quantification of H2O2. （B） Principle of the proposed NEQ-ELISA for visual quantification of proteins［38］

除金納米棒長度的變化外，金納米顆粒的聚集和分散行為使其表現(xiàn)出依賴距離的光學信號，導致溶液發(fā)生從紅色到紫色的顏色變化并可被肉眼識別［39-42］。Liu 等［43］設計了一種以金納米顆粒比色檢測和雜交鏈反應（HCR）擴增為基礎的DNA 測定方法，如圖8 所示，他們設計了兩個發(fā)夾式輔助探針H1 和H2，H1 末端的片段Ⅰ（藍線）與H2 的片段Ⅰ′（藍線）互補，H2 的端片段Ⅱ′（紅線）可以與H1 的片段Ⅱ（紅線）雜交，且H1的片段Ⅰ也可以與目標DNA雜交（綠線）而打開發(fā)卡H1，進而雜交H2，每個靶基因均可以引發(fā)H1和H2發(fā)夾之間雜交鏈式反應，形成缺口雙螺旋。形成的缺口雙螺旋dsDNA 較硬不容易彎折，與帶負電荷的AuNPs 之間的產(chǎn)生強烈排斥，導致金納米顆粒在鹽作用下聚集。因此，在膠體溶液中觀察到淡紫色到藍色的顏色變化，從而實現(xiàn)靶DNA的肉眼觀測。該檢測系統(tǒng)除具有金納米粒子比色法的傳統(tǒng)優(yōu)點外，還具有以下優(yōu)點： 1）避免了酶的引入，操作簡單易行； 2）具有超高的檢測靈敏度，儀器檢測的比色檢測限為50 pmol/L，肉眼檢測的比色檢測限為100 pmol/L； 3）它對完全匹配的目標寡核苷酸和單堿基對錯配的目標具有高度的區(qū)分度。

圖8 使用金納米粒子和雜交鏈式反應擴增的高靈敏度比色檢測DNA的示意圖［43］Fig. 8 Schematic of high sensitive colorimetric detection of DNA by using gold nanoparticles and hybridization chain reaction amplification［43］

基因編輯技術可以在定點修飾和編輯生物體的基因或轉(zhuǎn)錄物，通過識別測試樣本中的特定序列來實現(xiàn)檢測病原體的功能［44］，簇狀規(guī)則間隔的短回文重復序和相關蛋白（CRISPR-Cas）系統(tǒng)可以對DNA/RNA識別并編程，在互補靶標存在的條件下可以將ssDNA 或ssRNA 反式切割［45-46］。該系統(tǒng)為檢測DNA 提供了一個全新的思路： 同時向細胞內(nèi)遞送靶向該DNA 的CRISPR-Cas 系統(tǒng)和非特異性ssDNA 熒光報告基因（即熒光劑與猝滅劑雙標記的序列），一旦檢測到目的DNA，CRISPR-Cas 系統(tǒng)將啟動，與此同時，熒光報告基因也會被剪切，從而釋放出熒光信號，達到診斷的目的［47］。Yuan 等［48］提出了一種以CRISPR/Cas系統(tǒng)為基礎的AuNPs比色基因傳感平臺策略，如圖9所示。在該檢測平臺中，通用連接子ssDNA或ssRNA被設計為Cas12a或Cas13a系統(tǒng)的反式裂解底物。此外，設計了一對通用的金納米粒子-DNA探針，用于與連接ssDNA 或ssRNA 雜交，在沒有靶點的情況下，反式裂解不會被激活，因此連接ssDNA 或ssRNA 在反應系統(tǒng)中保持完整。AuNPs-DNA 探針對將經(jīng)歷雜交誘導的交聯(lián)以形成聚集狀態(tài)； 當Cas12a/crRNA 和Cas13a/crRNA分別識別其靶DNA和RNA時，連接子ssDNA和ssRNA將被降解。AuNPs-DNA探針對失去了雜交的連接子，因此變得分散，導致肉眼可見的顏色變化，從而實現(xiàn)了裸眼基因檢測?；贑IRSPR/Cas的比色平臺具有探針的廣泛適用性、高靈敏度、可用于現(xiàn)場檢測以及能與等溫反應條件兼容等優(yōu)點。

圖9 基于CRISPR/ Cas的比色基因檢測原理圖［48］Fig.9 Schematic diagram of colorimetric gene detection based on CRISPR/Cas［48］

以AuNPs 為基礎的銀信號增強檢測方法也是一種可視化檢測方法。Taton 等［49］研究了一種利用納米顆粒來標記寡核苷酸并使用常規(guī)平板掃描儀來分析DNA的方法。首先，用寡聚核苷酸分別修飾透明平面和金納米顆粒，接著將靶DNA 與修飾后的AuNPs 放入反應緩沖液中，因為靶DNA 與寡聚核苷酸可以互補雜交，那么將會在反應平面形成三組分夾心結構。在較高濃度（1 nm）靶DNA 存在的條件下，反應平面因雜交較多AuNPs 呈現(xiàn)淺粉色。而在較低濃度（100 pmol/L）靶DNA 存在的條件下，顏色變化較小，難以肉眼觀測。因此他們將銀離子放入反應體系，銀離子被AuNPs 表面存在的苯二酚還原為金屬銀，此時就會產(chǎn)生可視化的現(xiàn)象。使用納米粒子還原銀離子的信號放大方法后，該體系檢測的靈敏度比類似的熒光檢測方法高出2個數(shù)量級。

Ji等［50］將汞離子介導的構象分子信標（MB）和AuNPs聚集等方法相結合，設計了一款用于檢測DNA分子的新方法。如圖10 所示，在靶DNA 不存在的條件下，連接DNA 將會與汞離子發(fā)生結合，從而導致MB形成非活性環(huán)狀結構。此過程將不會使聚腺苷功能化的AuNP（A-AuNP）發(fā)生聚集，而是處于分散狀態(tài)，通過加入還原劑催化銀還原反應，反應平面上將會出現(xiàn)肉眼可分辨的黑斑。而當靶DNA存在時，由于靶DNA 對連接DNA 的親和度要大于汞離子對靶DNA的親和度，所以靶DNA會優(yōu)先與連接DNA發(fā)生雜交反應，從而使MB 解開非活性的環(huán)狀結構。雜交后的鏈狀DNA 的多胸腺末端可以與A-AuNP 發(fā)生反應，從而導致金納米顆粒聚集，從反應表面上表現(xiàn)為斑點上銀沉積減少，即斑點顏色變淡。此種檢測DNA的方法操作簡便，無需標記DNA，并且具有高靈敏度和高特異性等優(yōu)點。

圖10 用視覺掃描策略檢測DNA分子信標（MB）方法的原理圖［50］Fig.10 Schematic of the DNA molecular beacon （MB） detection method using the visual scanning strategy［50］

3.2 其它比色分析法

基于比色法在即時檢測領域的巨大潛力，除基于金納米材料的比色方法，多種其它原理的比色方法得以開發(fā)，例如氧化還原反應、礦化反應和染料控釋等。Hao等［51］以4種不同顏色的染料為信號指示劑，通過調(diào)節(jié)pH 值克服染料相互干擾，開發(fā)了一種pH 分辨比色生物傳感器，用于同時檢測赭曲霉毒素A（OTA）、黃曲霉毒素B1（AFB1）、伏馬菌素B1（FB1）和微囊藻毒素-LR（MC-LR），策略如圖11 所示。探針1和探針2與適配體是部分互補鏈，并與適配子同時雜交形成氧化石墨烯組裝體。靶點的存在會與適配子結合并導致組裝的解離，在生物識別和磁分離之后，pH 值作為一個新的維度來控制從石墨烯中釋放染料的順序，以量化目標，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值可以依次獲得4個靶點的濃度。同時，氧化石墨烯的DNA 導向自組裝和磁分離相結合也避免了生物傳感器制造過程中繁瑣且高成本的化學修飾過程。這種生物傳感器為多靶點檢測提供了一種簡單、快速、準確和低成本的新策略。

圖11 用于同時多目標檢測的pH分辨比色生物傳感器策略［51］Fig.11 Schematic of pH-resolved colorimetric biosensor for simultaneous multiple targets detection［51］

Long 等［11］設計了一種基于納米纖維膜和3 種不同擴增方法的超靈敏疾病DNA 標志物的多擴增納米纖維傳感比色技術，檢測原理如圖12 所示。多重擴增反應包括催化發(fā)夾自組裝（CHA）擴增、脫氧核酶催化比色反應和葡萄糖氧化酶（GOx）生物催化。納米纖維膜作為電位傳感界面的材料，將DNA 酶催化的比色反應、葡萄糖氧化酶生物催化反應以及催化發(fā)夾組裝擴增反應結合到一起，用來檢測艾滋病毒（HIV） DNA靶標序列。當靶DNA不存在時，多功能納米纖維膜不會發(fā)生顏色變化。當反應系統(tǒng)中加入418 nmol/L 的靶標DNA 時，發(fā)生CHA 擴增反應，具體表現(xiàn)為： 靶DNA 作為啟動子，觸發(fā)級聯(lián)雜交反應，此時被生物素標記且固定在纖維納米膜表面的H2 與H1 形成雙螺旋結構。H2 DNA 片段在G-四鏈體與血紅素結合時會形成DNA 酶，在葡萄糖氧化酶生物催化產(chǎn)生的過氧化氫存在的條件下，DNA 酶可以催化無色的2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）離子ABTS2-氧化為綠色的ABTS-。反應體系的顏色由無色變?yōu)榫G色，通過顏色變化就可以實現(xiàn)靶DNA 的肉眼觀測。此種檢測方法經(jīng)濟實惠、能夠裸眼檢測目標DNA，可實現(xiàn)人體血清樣本痕量DNA的檢測與單堿基錯配的辨別。

圖12 基于多重擴增納米纖維傳感平臺的目標HIV可視化檢測原理圖［11］Fig.12 Schematic diagram of targeted HIV visual detection based on a multiplex amplification nanofiber sensing platform［11］

Nicholas 等［52］利用酶-DNA 納米結構組成的集成電路來直接檢測感染細胞中的病原體核酸，系統(tǒng)內(nèi)設置的酶級聯(lián)反應可以快速產(chǎn)生肉眼可見的顏色變化，原理如圖13所示。該集成電路含有酶輔助的納米復合物，由一系列酶-DNA納米結構組成。適配體與從水生棲熱菌提取的（Taq） DNA聚合酶結合并使其失活，當互補靶DNA 存在時，適配體發(fā)生解離并激活Taq DNA 聚合酶。被激活的Taq DNA 聚合酶以一種不依賴靶點的方式延長作為信號的頸環(huán)序列，生物素標記的脫氧核苷酸（dNTP）被添加到信號納米結構上并進一步固定辣根過氧化物酶（HRP），從而產(chǎn)生的視覺信號可以通過肉眼觀測，并通過智能手機量化，該方法具有測定速度快（2 h）、靈敏度高（10 amol/L）等優(yōu)點。

圖13 病原體核酸的可視化和模塊化檢測原理圖［52］Fig.13 Schematic diagram of visualization and modular detection of pathogen nucleic acids［52］

Zhou 等［53］設計了一種應用生物礦化輔助擴增（BMA）技術靈敏檢測DNA 的方法。該方法利用AuNPs探針可以誘導硅酸鹽的生物礦化的特性，將二氧化硅形成、放大的過程應用于生物芯片的視覺信號讀取上，策略如圖14所示。第1種探針（AuNP-S）是一種同時具有目標識別寡核苷酸DNA 1和生物礦化能力硅酸鹽蛋白功能化的AuNP。第2 種探針（AuNP-O 探針）是低聚乙二醇（OEG）衍生物封蓋在AuNP 表面制成。當被修飾的反應表面與靶DNA、AuNP-S 探針結合后，AuNP-S 探針上的硅酸鹽就會催化SiO2的合成，同時可以捕捉AuNP-O 探針。最后，銀金屬就會在AuNP-S與AuNP-O 結合的位置上發(fā)生沉積，銀金屬的選擇性沉積使信號的可視化檢測更加靈敏。

圖14 生物礦化輔助擴增（BMA）策略的示意圖［53］Fig.14 Schematic representation of the biomineralization-assisted amplification （BMA） strategy［53］

Piao等［54］提出了一種基于聚合二氧化硅納米粒子探針光散射的人乳頭瘤病毒（HPV）DNA芯片檢測方法。HPV靶DNA被夾在固定于芯片上的捕獲DNA和固定在普通二氧化硅納米顆粒上的探針DNA之間，三者形成“三明治”夾心結構。發(fā)生DNA 雜交的部位會呈現(xiàn)亮白色，可以輕易被肉眼和簡便檢測平臺檢測到。而雜交方法有2 種，分別為兩步DNA 雜交和三步DNA 雜交法，其中三步法比兩步雜交法光散射信號更強，更易被捕捉到。此種檢測方法無需使用復雜的檢測儀器就可以實現(xiàn)可視化檢測，其操作簡便和性價比高的優(yōu)點為便攜式檢測試劑盒的開發(fā)提供了基礎。

4 基于距離變化的可視化檢測

通過精巧設計，可以將分析信號轉(zhuǎn)換為距離變化來構建一個傳感系統(tǒng)，從而實現(xiàn)對目標分子的實時可視化檢測。這種方法可以結合微流控的分析器件或者紙基平臺來構建，通常將距離的顯著變化作為傳感信號，以提供可見的定量讀數(shù)，而無需昂貴的儀器或復雜的數(shù)據(jù)處理。基于距離的可視化檢測方法本節(jié)以Yang Chaoyong團隊的研究進展為例進行了介紹。

Song等［55］設計了一種多路容量條形圖芯片（MV-Chip）用來對DNA進行定量檢測。該方法利用過氧化氫酶催化過氧化氫分解產(chǎn)生的氧氣，可以推動有色墨水沿著通道涌動形成墨水柱，根據(jù)墨水柱運動的距離實現(xiàn)可視化定量靶標，全過程無需附屬儀器、數(shù)據(jù)處理或計算機的圖形繪制的輔助。如圖15所示，采用了“火箭式”推進裝置對信號進行放大，以此提高檢測靈敏度。靶DNA 雜交過氧化物酶探針，進入反應系統(tǒng)后，會引入過氧化氫酶作為引發(fā)劑使推進劑發(fā)生響應，并借助反應中沉積的金屬鉑膜對信號進行放大，經(jīng)過級聯(lián)放大后，系統(tǒng)會產(chǎn)生更多的氧氣，從而使墨條走得更遠，此時就可以通過墨條對靶標進行可視化檢測?；谌壖壜?lián)放大反應，該芯片的靈敏度比未放大的芯片提高了約1000 倍，血清等復雜基質(zhì)對信號強度的干擾可以忽略不計。

Zhu 等［56］利用酶包埋、適配體交聯(lián)等技術，可制得響應型水凝膠，在刺激物作用下可以調(diào)節(jié)流體流動性質(zhì)。進一步將容量條形圖芯片（V-Chip）與響應水凝膠相結合，如圖16所示，首先將Au核/Pt殼納米顆粒（Au@PtNP）封裝在水凝膠中，當水凝膠與引入的靶標結合后，就會立即溶解并釋放內(nèi)部的Au@PtNPs，以此有效催化H2O2分解，產(chǎn)生大量的O2，移動V-Chip 中的墨條移動，通過讀取墨條的移動距離，可以直觀地量化靶標的濃度［56］。

圖16 Au@Pt納米顆粒封裝的目標響應水凝膠與容量條形圖芯片讀出定量即時檢測方法原理圖［56］Fig. 16 Au@Pt schematic diagram of nanoparticle-encapsulated target-responsive hydrogel and volumetric bar graph chip readout quantitative point-of-care detection method［56］

Wei 等［57］開發(fā)了一種通用的即時檢測平臺，可基于微流體紙質(zhì)分析設備（μPAD）同時檢測多個目標，并使用目標響應水凝膠介導流體流動和信號讀數(shù)。如圖17所示，在沒有靶標存在的情況下，流道中會形成水凝膠，從而導致μPAD 中的流動停滯，使彩色指示器無法到達最終的觀測點，最后產(chǎn)生“off”的信號。相反，在靶標存在時，由于靶標與適配體的優(yōu)先相互作用，系統(tǒng)中不會形成水凝膠。這使得自由流體在μPAD中流動，將彩色指示器帶到觀測點，并產(chǎn)生肉眼可見的“on”信號。

圖17 基于微流控紙基的分析裝置（μPAD）原理圖［57］Fig.17 Schematic diagram of a microfluidic paper-based Analysis Device （μPAD）［57］

隨后Wei 等［58］又開發(fā)了含糖水凝膠集成紙基分析的裝置（μDiSH-PAD），如圖18 所示，以適配體為交聯(lián)劑合成了一種含有誘捕型葡糖淀粉酶（GA）的含糖水凝膠。當靶標存在時，水凝膠發(fā)生分解并釋放GA 到反應中，將淀粉水解為葡萄糖。將GOx 和無色的3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）作為底物，修飾在μPADs 上的親水通道，當葡萄糖通過毛細血管作用沿通道移動時，GOx 將葡萄糖轉(zhuǎn)化為H2O2。此外，DAB 被辣根過氧化物酶（HRP）轉(zhuǎn)化為棕色不溶性聚3，3-二氨基聯(lián)苯胺poly-（DAB），產(chǎn)生可視化的棕色條狀物，其長度與靶標濃度呈正相關，目標響應適配體水凝膠系統(tǒng)能夠?qū)Χ喾N目標進行靈敏的、具有選擇性的可視化檢測。本方法適用于多種不用類型的靶標，具有低成本、普適性強和操作簡易等特點，在多種檢測環(huán)境均可適用。

圖18 基于微流控距離讀出信號的含糖水凝膠集成紙基分析裝置原理圖［58］Fig. 18 Schematic diagram of an integrated paper-based analysis device for sugar-containing hydrogels based on microfluidic range readout signals［58］

基于以上基礎，Tian 等［59］開發(fā)了綜合折紙分析裝置（ID-oPAD），如圖19所示，該平臺將適配體/轉(zhuǎn)化酶功能化的瓊脂糖珠的視覺信號輸出、酶級聯(lián)反應和基于三維微流控紙基的距離讀出的分析設備綜合，實現(xiàn)了目標識別、信號放大和視覺信號輸出的集成。當引入靶標后，瓊脂糖珠會釋放轉(zhuǎn)化酶-DNA 偶聯(lián)物，該物質(zhì)尺寸較小，滲透到纖維素中后會流向底部的檢測區(qū)，而尺寸較大的瓊脂糖珠則無法進入底部檢測區(qū)外部，停留在上部檢測區(qū)。緊接著，被釋放的偶聯(lián)物會啟動三級級聯(lián)酶反應，從而將目標信號轉(zhuǎn)化為棕色條形圖中的讀數(shù)。通過簡單的操作，ID-oPAD 能夠在30 min 內(nèi)實現(xiàn)待檢樣品的可視化和定量讀數(shù)。在本策略中，結合/游離探針的分離是利用瓊脂糖珠和纖維素孔的大小差異來實現(xiàn)的，并且下游的酶擴增反應是以多種酶與相應底物的相容性為基礎來實現(xiàn)的。使用該裝置對可卡因進行檢測，檢測限低至1.8 μmol/L。ID-oPAD 具有成本低、一次性、操作簡單和可視化定量讀數(shù)等優(yōu)點，為即時檢測提供了理想的平臺。Yang Chaoyong 教授團隊在基于距離的可視化檢測方法上做出了非常具有創(chuàng)新性的研究，基于微流控紙基的分析裝置生產(chǎn)成本低，操作簡便，不需要任何輔助儀器，且具有檢測速度快、實時檢測等特點，在許多領域中具有重要的應用價值。為可視化檢測的后續(xù)研究奠定了堅實的基礎。

圖19 基于距離的綜合折紙分析裝置原理圖［59］Fig.19 Schematic diagram of a distance-based integrated origami analysis device［59］

5 基于橫向流動試紙條的檢測

橫向流動試紙條的分析可以將專用的實驗室儀器轉(zhuǎn)化為簡單的紙質(zhì)系統(tǒng)，具有操作簡單、方便攜帶和實時檢測等優(yōu)點，然而在靈敏度和定量性能方面仍需持續(xù)改進。Nurul等［60］設計了一種以環(huán)介導等溫擴增（m-LAMP）為基礎的橫向流動探針生物傳感方法，用來檢測致病性鉤端螺旋體，原理如圖20 所示。致病性鉤端螺旋體內(nèi)的靶擴增子被生物素和熒光素標記，而LAMP 內(nèi)控物則被地高辛和熒光素標記。二者均可以在相應檢測線被捕獲。而金納米顆粒與抗熒光素抗體結合后，將會在橫向流動試紙條上相應檢測線位置呈現(xiàn)出可視化的紅線。因此，檢測結果陽性會顯示3 條紅線，而檢測結果為陰性會顯示2條紅線。該檢測方法雖然成本略高于PCR-凝膠電泳法，但節(jié)省了檢測時間，仍可以認為是一種高靈敏度、高特異性和安全快速的檢測方法。

圖20 使用側向流動試紙進行LAMP擴增子的可視化原理示意圖［60］Fig.20 Schematic diagram of LAMP amplicon visualization using lateral flow dipstick［60］

Yao 等［61］也開發(fā)了一種結合滾環(huán)擴增與AuNPs 的側向流（LFS-RCA）檢測平臺，可以同時檢測miRNA 21和miRNA let-7a。如圖21所示，在擴增產(chǎn)物不存在時，金納米探針復合物沿著反應膜移動，被對照線上的DNA 探針捕獲，陰性反應只會出現(xiàn)一條紅色條帶。當擴增產(chǎn)物存在時，擴增產(chǎn)物先于金納米探針復合物結合，沿著反應膜移動時，會被檢測線上的特異性探針捕獲。剩余的金納米探針復合物則會移到對照線上，此時陽性反應會出現(xiàn)3 條紅色條帶。該檢測方法實現(xiàn)了對miRNA 21 和miRNA let-7a的同時檢測，具有簡單、靈敏、特異性強和選擇性高等優(yōu)點，檢出限分別低至20和40 pmol/L。其中，滾環(huán)擴增對提高靈敏度和降低實驗成本起著至關重要的作用，此外，高特異性的掛鎖探針可以識別同時擴增的多個miRNAs靶標，節(jié)省了樣本量和檢測時間。在未來的進一步發(fā)展中，該技術有望成為臨床診斷中檢測miRNA的潛在工具。

圖21 采用滾環(huán)擴增結合側向流動條帶特異性、同時檢測miRNA 21和let-7a［61］Fig.21 Simultaneous detection of miRNA 21 and let-7a using rolling circle amplification combined with lateral flow band specificity［61］

Zheng等［62］設計了一種由多個生物素標記的DNA探針和側向流核酸生物傳感器相結合的用于金黃色葡萄球菌的可視化檢測的方法。如圖22所示，金黃色葡萄球菌（S.aureus）中含有的16S-rRNA 與被多個生物素標記的DNA 探針通過偶聯(lián)設置在同一個裝置中，用于側向流動的檢測。16S-rRNA 的二級結構可以被特異性捕獲探針和多個橋接探針解開，暴露出來的序列被作為啟動子使用。利用該啟動子，每個靶向16S-rRNA 與多個DNA 探針的復合物可以捕獲多個生物素分子，從而可以在橫向流動試驗中引入大量鏈霉親和素標記的金納米顆粒。顯示結果后，利用智能手機將檢測結果的圖像通過Wi-Fi 或藍牙傳輸?shù)接嬎銠C上，可通過ImageJ 進行定量。通過探究得出，該方法對食品中金黃色葡萄球菌的檢測具有較高的特異性和適用性。

圖22 基于多種生物素標記的DNA探針、側流和智能手機的金黃色葡萄球菌16S-rRNA的POCT示意圖［62］Fig. 22 Schematic POCT of Staphylococcus aureus 16S-rRNA based on multiple biotin-labeled DNA probes， side-stream，and smartphone［62］

Broughton 等［63］開發(fā)了一種基于CRISPR-Cas12 的橫向流動檢測方法，該方法用于從提取的患者樣本RNA 中檢測SARS-CoV-2，命名為SARS-CoV-2 DNA 內(nèi)切酶靶向的CRISPR 反式報告法（DETECTR）。如圖23所示，該方法在通用運輸介質(zhì)中使用環(huán)介導擴增將鼻咽或口咽拭子中提取的RNA同時進行轉(zhuǎn)錄和等溫擴增，然后使用Cas12檢測預定義的病毒序列，報告分子被切割后發(fā)生顏色變化即可確認病毒的存在。如果同時檢測到E 基因和N 基因，則認為SARS-CoV-2 DETECTR 檢測為陽性。經(jīng)過對大量樣本的檢測，該方法陽性預測符合率達到95%，陰性預測符合率達到100%。由于DETECTR檢測法使用的樣本采集和RNA 提取方法與美國疾病控制和預防中心（USCDC）的檢測法和其它使用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）的檢測法相似，因此該方法也存在局限性。然而，與qRT-PCR 相比，該方法具有無需升高或者降低溫度只需等溫擴增，檢測時間短、特異性強、方便觀察以及不需要復雜的實驗室基礎設施等優(yōu)點。

圖23 基于CRISPR Cas12的SARS-CoV-2檢測原理圖［63］Fig.23 Schematic diagram of a CRISPR Cas12-based SARS-CoV-2 assay［63］

6 結論與展望

血糖儀、免疫試紙條等便攜性檢測設備具有使用方便，不需要專業(yè)技術人員等優(yōu)點，已經(jīng)被廣泛投入到市場應用，在現(xiàn)場分析檢測領域發(fā)揮著巨大作用。隨著生物檢測領域?qū)Ρ銛y性檢測設備在高效、便捷和普適性等要求的提高，低成本、不依賴特殊儀器的可視化技術得到了快速發(fā)展。本文基于產(chǎn)生可視化信號的不同呈現(xiàn)方式對可視化檢測方法進行了分類與總結，包括基于顆粒計數(shù)法、比色法、液晶傳感、距離信號以及橫向流動試紙條等可視化方法，結合免疫分析、酶催化、氧化還原反應、染料控釋、滾環(huán)擴增和CRISPR-Cas基因編輯等技術實現(xiàn)可視化信號的產(chǎn)生，有操作簡便、成本較低和檢測速度快等優(yōu)點。這些檢測方法為未來發(fā)展綜合性能強大的生物即時檢測方法提供了全新的思路。盡管如此，可視化生物檢測的發(fā)展仍然面臨諸多挑戰(zhàn)，如其穩(wěn)定性、靈敏度、定量檢測以及適應多種檢測環(huán)境等方面的技術仍需要持續(xù)加強。在資源有限的地區(qū)，開發(fā)更簡單的生物傳感方法，不依賴于復雜的設備，以簡單、快速和廉價的方式提供準確的結果是一個新興的需求，我們相信通過整合各種新材料和新技術到可視化檢測系統(tǒng)中，可以持續(xù)產(chǎn)生新穎的傳感系統(tǒng)，以最先進的方式解決現(xiàn)有的挑戰(zhàn)。