徐 一 林夢(mèng)瑤 宮曉群

（天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 天津 300072）

在生命科學(xué)研究中，針對(duì)靶標(biāo)蛋白、核酸或小分子等的準(zhǔn)確識(shí)別及檢測(cè)具有重大意義和發(fā)展前景［1-3］，目前已經(jīng)發(fā)展出多種實(shí)驗(yàn)室或臨床檢測(cè)技術(shù)，如蛋白免疫印跡法（Western blot）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法（Real-time quantitative PCR， RT-qPCR）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry）等［4-7］。雖然這些檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究工作，但仍面臨著諸多限制，如操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)、檢測(cè)儀器精密昂貴、需要專業(yè)人員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室操作和結(jié)果分析等。為了克服這些缺陷，提高檢測(cè)技術(shù)的通用性，科研工作者們深入探究，發(fā)展了多種類操作簡(jiǎn)單、成本低廉和結(jié)果準(zhǔn)確的檢測(cè)方法［8-11］。

在多種檢測(cè)技術(shù)中，比色法是最直觀、最常用的一種。其原理是通過化學(xué)發(fā)光、酶促顯色或聚集顯色等反應(yīng)，肉眼直接觀察顏色變化進(jìn)行定性或半定量分析，也可借助儀器或軟件進(jìn)行快速定量分析。多數(shù)比色法具有便攜、快速和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，可以用于實(shí)驗(yàn)室快速判讀分析結(jié)果或在資源匱乏地區(qū)開展生物分析工作。但該技術(shù)也存在一些局限性，如主要依靠操作者的視覺感官進(jìn)行判讀，易受光線或個(gè)人的影響而對(duì)結(jié)果判讀產(chǎn)生誤差，且靈敏度相對(duì)較低，往往需使用昂貴儀器才可進(jìn)行定量分析［12-13］。

針對(duì)上述問題，科研工作者基于比色法平臺(tái)研究并開發(fā)了多種性能優(yōu)良的檢測(cè)技術(shù)，近期發(fā)展較快且應(yīng)用較廣泛的主要是多色比色法。相比于單色比色法，多色比色法有著更高的分辨率和肉眼辨識(shí)度、可進(jìn)行裸眼半定量和智能手機(jī)快速定量分析、可同時(shí)分析多個(gè)目標(biāo)物以及避免單色假陽性出現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn)［14-17］?；谝酝难芯?，本綜述基于多色小分子熒光、多色/熒光納米材料和多色酶促反應(yīng)3種不同的顯色機(jī)理，總結(jié)了近15年內(nèi)多色比色平臺(tái)的研究成果，分析了其在實(shí)際樣本檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)，并進(jìn)一步討論了其在新興領(lǐng)域的前景和挑戰(zhàn)。

1 多色熒光分子探針

熒光分子探針具有靈敏度高、成像分辨率高、生物相容性好和可進(jìn)行實(shí)時(shí)活體成像等優(yōu)點(diǎn)［18］。但常見的熒光分子探針多是由單光子激發(fā)的單響應(yīng)探針，這種探針的缺點(diǎn)是對(duì)目標(biāo)物含量變化不敏感，且激發(fā)波長(zhǎng)較短（350～550 nm），這限制了熒光分子探針在復(fù)雜生理環(huán)境和深層組織成像中的發(fā)展和應(yīng)用［19-20］。另一方面，由于熒光通道單一，通常一種熒光探針不能同時(shí)檢測(cè)2種目標(biāo)物，也無法準(zhǔn)確計(jì)算目標(biāo)物的含量。而多響應(yīng)熒光探針在多色成像模式下具有巨大的檢測(cè)潛力，但由于吸收/發(fā)射波長(zhǎng)短、顏色光譜易重疊和響應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，大多數(shù)多響應(yīng)熒光探針還局限于細(xì)胞成像研究。因此，基于多響應(yīng)熒光探針進(jìn)行的各類優(yōu)化研究的應(yīng)用前景十分可觀。

1.1 多響應(yīng)雙光子熒光分子探針

雙光子熒光分子探針基于雙光子激發(fā)原理，如圖1A所示，在強(qiáng)激光光源的激發(fā)下，分子可以同時(shí)吸收2 個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，通過1 個(gè)虛擬的中間態(tài)躍遷到高能態(tài)，從而發(fā)射出1 個(gè)波長(zhǎng)較短的光子［21］。這一原理使得雙光子熒光分子探針有著較長(zhǎng)的激發(fā)光波長(zhǎng)（650～950 nm），該波長(zhǎng)處于生物光學(xué)透明窗口的范圍內(nèi)，可以有效提高信號(hào)的組織穿透深度（＞500 μm）［22-23］； 同時(shí)，雙光子激發(fā)現(xiàn)象只會(huì)發(fā)生在激發(fā)光源的焦點(diǎn)平面處，可以保證長(zhǎng)時(shí)間成像的光穩(wěn)定性［24］和空間選擇性［25］。

圖1 雙光子熒光分子探針原理及應(yīng)用Fig.1 Principles and applications of two-photon fluorescent probes

與單響應(yīng)探針相比，多色輸出的多響應(yīng)熒光分子探針可以在生理環(huán)境中同時(shí)檢測(cè)2 種及以上的目標(biāo)物，并獲取不同的信息，這對(duì)于探索及研究多種生物分子的作用機(jī)理具有重要的生物學(xué)意義。Li等［26］設(shè)計(jì)了一種基于黃酮醇-硼酸鹽結(jié)合物的雙光子熒光分子探針，在檢測(cè)H2O2的同時(shí)進(jìn)行光響應(yīng)的CO 精準(zhǔn)釋放。如圖1B 所示，在H2O2存在的環(huán)境下探針會(huì)在480 和585 nm 處出現(xiàn)2 個(gè)熒光發(fā)射峰，通過計(jì)算紅綠熒光比值可對(duì)H2O2實(shí)現(xiàn)檢測(cè)限（LOD）低至66 nmol/L 的定量檢測(cè)； 與H2O2發(fā)生反應(yīng)后的熒光分子會(huì)響應(yīng)800 nm 的光照射并釋放CO，起到擴(kuò)張血管平滑肌作用。在斑馬魚活體實(shí)驗(yàn)中，該CO 釋放可以可視化拮抗血管緊張素Ⅱ的血管收縮作用。為了對(duì)癌細(xì)胞中線粒體硝基還原酶（NTR）和細(xì)胞內(nèi)粘度變化同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，Du 等［27］設(shè)計(jì)了一種雙光子熒光探針（CQ-1），如圖1C 所示，該探針的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)會(huì)受到體系粘度的限制進(jìn)而影響其熒光強(qiáng)度，CQ-1還會(huì)與NTR發(fā)生相互作用導(dǎo)致分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT），使分子熒光發(fā)射峰藍(lán)移至580 nm，從而對(duì)粘度（710 nm成像通道）和NTR（580 nm 成像通道）表現(xiàn)出無干擾的原位熒光信號(hào)響應(yīng)。Jiao等［28］將哌嗪-香豆素-羅丹明B母核連接硫內(nèi)酯和疊氮基，提出了一種可以同時(shí)檢測(cè)H2S 和HClO 的雙光子熒光分子探針RPC。如圖1D 所示，當(dāng)單獨(dú)加入H2S 后，RPC 在445 nm 處的熒光逐漸增強(qiáng)，而單獨(dú)加入HClO 會(huì)導(dǎo)致580 nm 處的熒光逐漸增加。該探針可在750 nm 的雙光子激發(fā)下對(duì)RAW264.7細(xì)胞中內(nèi)源性生成的H2S和HClO分別進(jìn)行成像檢測(cè)。

1.2 多響應(yīng)靶向型熒光分子探針

對(duì)細(xì)胞器等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行定位成像可更直觀地闡明不同生物分子之間的相互作用機(jī)理，通過改造熒光分子探針的結(jié)構(gòu)或增加靶向功能基團(tuán)，可以將不同顏色的熒光分子探針靶向到細(xì)胞膜蛋白、線粒體、溶酶體和脂滴等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在增加成像分辨率的同時(shí)還可以分析它們?cè)诨罴?xì)胞內(nèi)的相對(duì)位置，研究其生物學(xué)功能。Wu 等［29］設(shè)計(jì)了一種高親脂性的半菁花熒光團(tuán)分子（StatoMerocyanines， SMCy），這種熒光分子在親水性溶劑中會(huì)形成可溶性聚集體從而猝滅自身熒光，在親油性溶劑中則發(fā)出非常強(qiáng)的熒光?；诖薟u 等將SMCy 設(shè)計(jì)成靶向脂肪細(xì)胞中脂滴的多色熒光分子探針，圖2A 和2B 為該探針對(duì)脂滴進(jìn)行的高亮度、無背景的2D和3D多色成像，從而可以觀察到脂質(zhì)囊泡在肝組織中的分布及細(xì)胞間的脂滴交換。通過點(diǎn)擊化學(xué)偶聯(lián)SMCy還可以使其攜帶不同靶向特異性的熒光探針。

圖2 多響應(yīng)靶向型熒光分子探針應(yīng)用Fig.2 Applications of multi-response targeted fluorescent probes

Piatkevich等［30］設(shè)計(jì)了2種基于斯托克斯位移大的紅色和藍(lán)色熒光蛋白探針LSS-mKate1和GalT-ECFP，在蛋白表達(dá)時(shí)融合靶向蛋白可以賦予其靶向不同細(xì)胞器的能力。通過將這些熒光探針應(yīng)用于乳腺癌模型小鼠進(jìn)行多色熒光顯微成像時(shí)，可以觀察到乳腺癌細(xì)胞在活體小鼠血管中具有明顯的極化作用，即LSS-mKate1 標(biāo)記的紅色細(xì)胞核和GalT-ECFP 標(biāo)記的藍(lán)色高爾基體的腫瘤細(xì)胞（如圖2C 中黃色箭頭所示）共同遷移并通過成像平面。Li 等［31］利用吡啶陽離子靶向線粒體的特性設(shè)計(jì)了一種名為Mito-LX 的熒光分子探針，如圖2D 所示，在檢測(cè)線粒體中H2O2水平的同時(shí)還可以對(duì)線粒體粘度變化作出響應(yīng)。在Mito-LX 靶向進(jìn)入線粒體后，可以與H2O2反應(yīng)生成pre-Mito 并在580 nm 處發(fā)出綠色熒光，而在線粒體外生成的pre-Mito因失去了吡啶陽離子，喪失了其線粒體靶向性，從而有效地在線粒體外的體系中保護(hù)了Mito-LX的熒光； 而粘度降低時(shí)Mito-LX的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受到限制，從而使其紅色熒光亮度發(fā)生變化。

1.3 多響應(yīng)熒光壽命分子探針

熒光壽命是指當(dāng)組成物質(zhì)的分子在受到光脈沖的激發(fā)躍遷到高能級(jí)后， 回到基態(tài)前在激發(fā)態(tài)的平均停留時(shí)間， 一般為ns量級(jí)， 常用τ表示［32］。熒光壽命是熒光分子自身的固有屬性， 與激發(fā)光的波長(zhǎng)、強(qiáng)度和光照時(shí)間等因素?zé)o關(guān)， 而與分子自身所處微環(huán)境及其自身的結(jié)構(gòu)等條件有關(guān)。因此，通過對(duì)熒光分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，可以利用熒光壽命成像技術(shù)提供強(qiáng)度、光譜更清晰的成像結(jié)果，這一技術(shù)被稱為熒光壽命成像顯微技術(shù)（Fluorescence lifetime imaging microscopy， FLIM）。目前，F(xiàn)LIM 成像技術(shù)仍處于發(fā)展期，主要用于解決需要對(duì)高精度和高維度目標(biāo)進(jìn)行生物學(xué)成像的情況，其有著高時(shí)空分辨率、適用于活細(xì)胞成像和結(jié)果易于分析的優(yōu)點(diǎn)［32-33］。

如圖3A 所示，Long 等［33］利用FLIM 技術(shù)結(jié)合熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）原理，闡述了SHR、SCR 和JKD 這3 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥根尖不同細(xì)胞系中的相互作用模式，揭示了三者調(diào)控?cái)M南芥根尖細(xì)胞分化和發(fā)育的分子機(jī)理。Saari 等［34］利用FLIM 成像技術(shù)，研究了裝載經(jīng)俄勒岡綠（OG）標(biāo)記的紫杉醇（PTX）在不同胞外囊泡（EV）亞型、微囊泡和外泌體三者間不同的細(xì)胞攝取機(jī)制，如圖3B 所示，證明了FLIM 是在細(xì)胞水平上示蹤EV 介導(dǎo)的藥物遞送的有效方法。除外源性染料外，內(nèi)源性的還原型輔酶Ⅰ（NADH）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）也可以作為FLIM 熒光壽命分子探針進(jìn)行檢測(cè)［35］。圖3C 為Cong等［36］對(duì)細(xì)胞中NADH 和FAD 同時(shí)進(jìn)行的FLIM 成像，發(fā)現(xiàn)與單層培養(yǎng)的細(xì)胞相比，在三維膠原蛋白培養(yǎng)基中培養(yǎng)的癌細(xì)胞的NADH 熒光壽命更長(zhǎng)，這是由于三維培養(yǎng)時(shí)NADH 與酶有著更大的結(jié)合面積。Angelika 等［37］從能量代謝角度研究人正?？谇火つぜ?xì)胞和癌變口腔黏膜細(xì)胞，由于癌細(xì)胞中游離的NADH相比于正常細(xì)胞有所減少，因此癌變的口腔黏膜細(xì)胞在FLIM成像下的平均熒光壽命更長(zhǎng)。

圖3 多響應(yīng)熒光壽命探針應(yīng)用Fig.3 Applications of multi-response fluorescent lifetime probes

2 多色比色納米材料

隨著納米材料的形貌、大小及組成成分的變化，其光學(xué)性質(zhì)、理化性質(zhì)及催化活性等方面也會(huì)產(chǎn)生差異，因此應(yīng)用納米材料的比色平臺(tái)已經(jīng)成為快速、便捷測(cè)定各類目標(biāo)物的重要分析技術(shù)之一。顯色機(jī)理包括直接顯色比色、熒光比色、FRET 比色和表面生長(zhǎng)蝕刻顯色比色等，但單一顏色發(fā)生改變?nèi)菀讓?dǎo)致檢測(cè)人員誤判結(jié)果或出現(xiàn)假陰性［38］。因此，使納米粒子產(chǎn)生多種顏色變化可以有效降低主觀因素導(dǎo)致的誤判幾率。在目前開發(fā)的納米材料中，基于貴金屬納米粒子、量子點(diǎn)和上轉(zhuǎn)換納米粒子等多色材料的檢測(cè)平臺(tái)具有肉眼辨識(shí)度高、可進(jìn)行可視化半定量檢測(cè)、材料易于制備且穩(wěn)定性高以及可用智能手機(jī)定量分析結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2.1 基于聚集顯色的多色比色平臺(tái)

在各種納米材料中，金和銀納米顆粒廣泛用于聚集顯色比色檢測(cè)。單分散狀態(tài)的AuNPs 或AgNPs的溶液分別為紅色及黃色，而在發(fā)生聚集時(shí)分別變?yōu)樗{(lán)紫色及紅色。通過對(duì)納米材料表面進(jìn)行功能化修飾，使檢測(cè)到目標(biāo)物時(shí)的納米粒子發(fā)生聚集，從而改變?nèi)芤侯伾?9］。這一方法適用于對(duì)金屬離子［40］、小分子［41］、大分子［42］和手性分子［43］等多種目標(biāo)物的檢測(cè)。

Ghasemi 等［41］開發(fā)了一種快速檢測(cè)并分類硫醇的多色比色平臺(tái)，如圖4A 和4B 所示，利用3 種不同的功能化AuNPs聚集及顯色特點(diǎn)，可以同時(shí)檢測(cè)半胱氨酸、谷胱氨酸和谷胱甘肽二硫化物這3種硫醇化合物。He等［44］基于聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和Cr6+反應(yīng)生成強(qiáng)配位鍵原理，用PVP功能化的AgNPs對(duì)Cr6+進(jìn)行裸眼超靈敏檢測(cè)，當(dāng)溶液由亮黃色變?yōu)槌燃t色時(shí)說明有Cr6+使AgNPs 發(fā)生了聚集，LOD 可以達(dá)到34 nmol/L。Gao 等［45］合成了一種粒徑可調(diào)節(jié)的Au@Ag NPs 來檢測(cè)巴馬汀，帶負(fù)電的Au@Ag NPs 會(huì)在巴馬汀季銨基團(tuán)的正電荷誘導(dǎo)下迅速聚集并發(fā)生配體交換，使顏色由黃色變?yōu)榫G色，肉眼LOD 可達(dá)到0.13 μmol/L。然而，聚集顯色比色平臺(tái)在應(yīng)用中經(jīng)常面臨假陰性或假陽性問題，因?yàn)榧{米顆?？赡苡稍S多其它因素引起自發(fā)聚集，例如，溶劑、pH值、溫度和離子等［46］，這一缺點(diǎn)使得其在實(shí)驗(yàn)室以外的環(huán)境下可能不穩(wěn)定并難以規(guī)模化生產(chǎn)。因此，如何解決這一難題是未來研究的關(guān)鍵點(diǎn)。

圖4 聚集顯色多色比色平臺(tái)應(yīng)用Fig.4 Applications of aggregated chromogenic multicolor platforms

2.2 基于表面生長(zhǎng)蝕刻顯色的多色比色平臺(tái)

典型的金屬核殼結(jié)構(gòu)由配體殼及金屬芯組成，二者均可以作為反應(yīng)平臺(tái)對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)。目標(biāo)物一方面可以與金屬核作用，沉積在金屬上或溶解金屬核［47-50］； 另一方面目標(biāo)物還能夠通過酶促反應(yīng)、簇聚集等途徑與配體殼發(fā)生特異性反應(yīng)［51-52］。通過在核或殼上發(fā)生反應(yīng)，繼而產(chǎn)生顏色或熒光發(fā)光的信號(hào)變化，從而構(gòu)建多色比色傳感平臺(tái)。

具有還原性的目標(biāo)物可以與金屬離子反應(yīng)形成納米顆粒，在存在另一種金屬核的情況下，納米顆粒傾向于吸附到金屬核表面生長(zhǎng)而不是自成核形成新的納米粒子，而新生長(zhǎng)的金屬殼會(huì)引起SPR 光譜的變化，從而使溶液顏色發(fā)生變化［53-54］。Xu 等［49］合成了一種大小均勻的金納米雙錐體（AuNBPs），用于檢測(cè)H5N1 病毒。在堿性磷酸酶（ALP）作用下水解4-氨基苯基磷酸酯生成4-氨基苯酚，后者將Ag+還原成Ag 原子并沉積在AuNBPs 上。這一沉積的銀殼會(huì)改變AuNBPs 的折射率，從而導(dǎo)致縱向局部表面等離子體共振（LSPR）的藍(lán)移，并伴隨溶液由粉色到綠色再到深紅色的顯著顏色變化，可在肉眼下對(duì)H5N1進(jìn)行半定量檢測(cè)。如圖5A 所示，該方法由于AuNBPs 尖端的高折射率表面，表現(xiàn)出比其它金納米材料（如金納米棒）更高的靈敏度， LOD 可低至1 pg/mL。Wang 等［48，50］也利用相同原理檢測(cè)鞣花酸（EA）和維生素C。如圖5B所示，EA 可以還原Ag+沉積到金納米棒（AuNRs）上，使溶液從紫紅色變?yōu)榫G色； 后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)維生素C 還原Ag+得到的Ag 單質(zhì)傾向于沉積到金納米籠上形成Au@Ag 納米盒，而不是自成核形成AgNPs。這2種方法的LOD分別為40和24 nmol/L。

具有高氧化還原電位或充當(dāng)金屬離子絡(luò)合物配體的目標(biāo)物可以通過納米粒子蝕刻法進(jìn)行檢測(cè)。Lee等［55］基于金納米棒（AuNRs）尖端會(huì)被水中氰化物選擇性蝕刻的機(jī)理，設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)水中氰化物的檢測(cè)平臺(tái)，如圖5C 所示，AuNRs 被氰化物蝕刻會(huì)導(dǎo)致AuNRs 的體積發(fā)生變化，使溶液顏色從藍(lán)色變?yōu)樽仙詈笞優(yōu)榉奂t色。對(duì)水中氰化物的LOD可達(dá)到0.5 nmol/L。Wang等［56］提出了一種將AuNBPs蝕刻為球形AuNPs來檢測(cè)HeLa細(xì)胞中端粒酶活性的方法，將端粒酶提取物與磁珠探針在端粒酶延伸反應(yīng)緩沖液中孵育后，探針末端發(fā)生延伸，使磁珠可以偶聯(lián)辣根過氧化物酶包封的脂質(zhì)體（HRP-Ls），在加入3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和H2O2后氧化蝕刻AuNBPs，溶液顏色如圖5D所示，隨細(xì)胞數(shù)量的增多溶液顏色會(huì)由紅色依次變?yōu)樽厣?、灰色、綠色、藍(lán)色、紫色和粉紅色（0～2000 cells）。這一系列鮮明對(duì)比的多色結(jié)果能對(duì)細(xì)胞數(shù)量實(shí)現(xiàn)可視化半定量，視覺LOD 為20個(gè)Hela細(xì)胞，經(jīng)軟件處理后的LOD 可達(dá)到1 個(gè)HeLa 細(xì)胞。Zhang 等［57］還基于蝕刻生物傳感器提出了一種可擴(kuò)增超低濃度外泌體［58］信號(hào)的方法：使用生物素化的CD63 適配體連接到鏈霉親和素功能化的磁珠上，以作為堿性磷酸酶（ALP）的錨定位點(diǎn)。在加入1分子外泌體后可以競(jìng)爭(zhēng)性地與磁珠結(jié)合并釋放2分子ALP，磁分離除去磁珠后ALP可以催化L-抗壞血酸-2-磷酸水解生成抗壞血酸，從而蝕刻金納米雙錐體表面的MnO2納米片（AuNBP@MnO2NSs），如圖5E 所示，該蝕刻反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致溶液顏色由黃棕色變?yōu)榛疑罱K變?yōu)樗{(lán)色，LOD 可以低至135 個(gè)外泌體/μL。另一方面，金屬納米粒子也可以通過拮抗蝕刻作用對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)和定量，基于MoO2-4催化H2O2和KI 蝕刻AuNRs 的原理，Liu 等［59］提出了一種檢測(cè)腫瘤相關(guān)酶： 聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（RARP-1）的方法：在沒有RARP-1 的情況下，AuNRs 很快被腐蝕并使溶液顏色由棕色變?yōu)闇\藍(lán)色； 在RARP-1 存在下，其結(jié)構(gòu)中的PO3-4會(huì)和MoO2-4反應(yīng)，形成PMo12O3-42，導(dǎo)致蝕刻作用受到抑制。該方法可以對(duì)PARP-1活性進(jìn)行可視化監(jiān)測(cè)且靈敏度較高，LOD為0.02 U。

2.3 基于發(fā)光/熒光顯色的多色比色平臺(tái)

與傳統(tǒng)熒光分子探針相比，熒光納米材料因其有著靈敏度高、穩(wěn)定性好和泛用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，在比色傳感平臺(tái)的研發(fā)和應(yīng)用中表現(xiàn)出卓越的檢測(cè)性能及應(yīng)用前景。使用多色比色的熒光傳感平臺(tái)可以減少傳統(tǒng)單色熒光在光漂白性、假陰性及單靶標(biāo)分析等方面的缺點(diǎn)，從而表現(xiàn)出更強(qiáng)的功能性及檢測(cè)靈活性。

量子點(diǎn)（QD）是一種半導(dǎo)體納米晶體，其特點(diǎn)是有著寬且連續(xù)的吸收光譜和窄且對(duì)稱的可調(diào)控發(fā)射光譜，以及抗光漂白性和高光化學(xué)穩(wěn)定性。通過將QD 與各種其它熒光團(tuán)或淬滅劑互相反應(yīng)，或是在表面上進(jìn)行功能化修飾，其在體內(nèi)外標(biāo)記、成像及治療等方面均表現(xiàn)出良好的的應(yīng)用前景［60-62］。He等［63］利用QD 優(yōu)異的熒光穩(wěn)定性，建立了一種在-20 ℃下快速標(biāo)記多個(gè)免疫細(xì)胞，從而可視化其在肝切片上空間分布的新技術(shù)。結(jié)果如圖6A所示，QD有著其它納米材料不具有的低溫穩(wěn)定性及高亮度，其熒光性能在低溫下得到顯著提高，QD偶聯(lián)不同抗體后，可以同步標(biāo)記小鼠肝冷凍切片上的肝巨噬細(xì)胞（藍(lán)色）、肝星狀細(xì)胞（綠色）和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（紅色）并在冰點(diǎn)以下進(jìn)行單激發(fā)波長(zhǎng)成像，且QD 不會(huì)與其它肝臟細(xì)胞發(fā)生非特異性結(jié)合現(xiàn)象。He 等［64］通過組合碳量子點(diǎn)（CD）和不同尺寸的QD 制備了一種比率傳感系統(tǒng)，用于肉眼比色檢測(cè)Hg2+、Cu2+和Ag+，只需要對(duì)比溶液從粉色到紫色到黃色間的變化即可得知溶液中是否存在各類離子，LOD 分別為22、57 和45 nmol/L。Goldman 等［65］則利用4 種不同顏色QD 的發(fā)射峰互不干擾的特點(diǎn)，開發(fā)了一種在單孔中同時(shí)檢測(cè)霍亂毒素、蓖麻毒素、志賀樣毒素1 及葡萄球菌腸毒素B的方法。如圖6B 所示，通過對(duì)混合熒光信號(hào)進(jìn)行去卷積計(jì)算，可以同時(shí)定量4 種毒素。但這種方法仍需要熒光分光光度計(jì)對(duì)樣品溶液進(jìn)行掃描分析后得出數(shù)據(jù)。為了適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)（POCT）的需要，Liu等［66］使用紅、橙、黃和綠這4種不同顏色的量子點(diǎn)開發(fā)了同時(shí)檢測(cè)4 種硝基呋喃代謝物的免疫層析試紙條（Lateral flow strip， LFT），圖6C 為該LFT 在10 min 內(nèi)對(duì)真實(shí)樣品進(jìn)行快速靈敏的可視化檢測(cè)結(jié)果，LOD為50 ng/mL。Chen等［67］合成了多色硅量子點(diǎn)（SiQDs）并構(gòu)建了便攜式檢測(cè)平臺(tái)，如圖6D所示，該平臺(tái)可以用智能手機(jī)在紫外照射下直接分析樣品紅綠藍(lán)（RGB）數(shù)值，從而對(duì)人血液樣本中血紅蛋白（Hb）進(jìn)行快速比色檢測(cè)。

圖6 QDs多色比色平臺(tái)應(yīng)用Fig.6 Applications of multicolor colorimetric platform based on the QDs

稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子（UCNP）是繼傳統(tǒng)有機(jī)染料及半導(dǎo)體量子點(diǎn)之后研發(fā)的第3種新型熒光材料，UCNP 的特點(diǎn)為熒光激發(fā)波長(zhǎng)較長(zhǎng)而發(fā)射波長(zhǎng)較短，這一特點(diǎn)使其可以在紅外（IR）或近紅外（NIR）處被激發(fā)，從而增加組織成像穿透深度［68-69］。多色UCNP具有獨(dú)立的發(fā)射峰，可減少光譜串?dāng)_，并能夠同時(shí)檢測(cè)多種不同目標(biāo)物，顯著改善檢測(cè)時(shí)間和成本。為拓展UCNP 的多色應(yīng)用，Zhang 等［70］制備了摻雜鍺酸鉛的UCNP 并用不同功率的紅外激光照射，通過調(diào)節(jié)激發(fā)光功率，可以改變紅綠色發(fā)光強(qiáng)度比，進(jìn)而將熒光顏色在黃色-綠色間轉(zhuǎn)換。如圖7A 所示，Ma 等［71］合成了Er@Lu（紅色）及Y∶Nd@Lu（藍(lán)色）2 種UCNP，并使用短波紅外（SWIR）結(jié)合濾光片進(jìn)行了體內(nèi)多色正交成像，該方法可以有效降低不同顏色信號(hào)間的干擾。Wang 等［72］將核酸適配體功能化的UCNP 結(jié)合在單黑磷納米片表面，基于FRET 效應(yīng)實(shí)現(xiàn)高效的上轉(zhuǎn)換熒光猝滅，在檢測(cè)百草枯及多菌靈（CBD）農(nóng)藥時(shí)，適配體會(huì)優(yōu)先與二者結(jié)合，從而分別釋放藍(lán)色（百草枯）及綠色（CBD）熒光。該方法檢測(cè)范圍較寬（1.0～1.0×105ng/mL），百草枯及CBD 的LOD分別為0.18及0.45 ng/mL。

圖7 UCNP和MOF多色比色平臺(tái)應(yīng)用Fig.7 Applications of multicolor colorimetric platforms based on the UCNP and MOF

在POCT方面，Chen等［73］構(gòu)建的紅綠雙色試紙條可以同時(shí)檢測(cè)赭曲霉毒素A（OTA）及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），標(biāo)記抗體的AuNPs會(huì)和標(biāo)記抗原的UCNP結(jié)合并猝滅其熒光，進(jìn)行檢測(cè)時(shí)目標(biāo)物會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合AuNPs-抗體復(fù)合物從而釋放UCNP 熒光，對(duì)OTA 及DON 的LOD 分別為2.30 及2.33 μg/kg，也可依據(jù)此原理檢測(cè)多種其它目標(biāo)物。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)具有心力衰竭病史的家庭進(jìn)行早期診斷及實(shí)時(shí)預(yù)后等目的，You 等［74］提出了一種基于智能手機(jī)讀取分析的家用試紙條平臺(tái)（UC-LFT），該平臺(tái)由如圖7B 所示的1個(gè)電源、1個(gè)980 nm近紅外激光源及1個(gè)光學(xué)處理器組成，將藍(lán)綠雙色UCNP偶聯(lián)心衰抗原并制備試紙條，可以通過智能手機(jī)收集結(jié)果圖像進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)在試紙條上對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制因子2（ST2）及B 型鈉尿肽（BNP）的定量檢測(cè)（LOD 分別為5 ng/mL 和2 pg/mL），結(jié)果上傳后還可及時(shí)與專業(yè)醫(yī)護(hù)人員進(jìn)行溝通及預(yù)后跟進(jìn)，從而對(duì)高危人群進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)或預(yù)后跟進(jìn)。

除上述熒光材料外，還有許多低毒、低成本和高光穩(wěn)定性的熒光材料可以作為多色比色平臺(tái)的探針使用。金屬有機(jī)骨架（MOF）是由金屬離子/團(tuán)簇和通過配位鍵連接的有機(jī)配體共同制備的多孔熒光納米材料，通過在MOF 孔中包封其它熒光材料還可以實(shí)現(xiàn)雙熒光發(fā)射。Mohammed 等［75］設(shè)計(jì)了一種將藍(lán)色CDs 包封在紅色MOF 中的多色比色傳感器，其在水溶液和有機(jī)溶劑中均具有優(yōu)異的穩(wěn)定性，可以用于復(fù)雜環(huán)境下Ag+和半胱氨酸（Cys）的同時(shí)檢測(cè)，結(jié)果如圖7C 所示，Ag+會(huì)猝滅CDs 熒光使溶液變?yōu)榧t色，而Cys 可以恢復(fù)CDs 熒光使溶液變回藍(lán)色，并由智能手機(jī)對(duì)結(jié)果進(jìn)行RGB 分析。Wu 等［76］則通過將紅、綠和藍(lán)3 種顏色的熒光染料包封在MOF 中，并用莖環(huán)結(jié)構(gòu)核酸封閉MOF 表面。如圖7D 所示，當(dāng)目標(biāo)DNA 存在時(shí)會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合MOF 表面莖環(huán)并觸發(fā)熒光染料釋放，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA 低至20 fmol/L LOD的多色檢測(cè)。

3 多色比色酶促反應(yīng)

3.1 基于蛋白酶類催化的多色比色平臺(tái)

自然界中存在的各類天然蛋白酶具有高特異性和高催化效率，在生化反應(yīng)過程中起著至關(guān)重要的作用。經(jīng)典的酶促顯色反應(yīng)是通過催化底物產(chǎn)生顏色變化以進(jìn)行比色檢測(cè)，目前生物傳感平臺(tái)常用的蛋白酶如辣根過氧化物酶（HRP）、葡萄糖氧化酶（GOD）和堿性磷酸酶（ALP）等不僅可以通過催化顯色底物產(chǎn)生顏色變化，還可以將催化產(chǎn)物作為另一種酶的底物從而實(shí)現(xiàn)酶的級(jí)聯(lián)催化，從而有效地放大檢測(cè)信號(hào)［77-78］。

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是一種簡(jiǎn)單、可靠的檢測(cè)手段，然而基于HRP及TMB的傳統(tǒng)ELISA系統(tǒng)僅會(huì)使TMB 變?yōu)樯顪\不一的黃色，因此需要酶標(biāo)儀等專業(yè)設(shè)備測(cè)量吸光度進(jìn)而計(jì)算目標(biāo)物的具體含量，難以進(jìn)行可視化檢測(cè)。如圖8A所示，Liu等［79］建立了一種多色信號(hào)ELISA，對(duì)CBD進(jìn)行可視化半定量檢測(cè)，基于HRP氧化產(chǎn)生TMB+可以蝕刻AuNRs的原理，不同濃度的CBD在孔中會(huì)出現(xiàn)從淺粉色到綠色到深紫色的明顯變。通過與比色卡進(jìn)行對(duì)比，視覺下可以輕松區(qū)分0.08到100 ng/mL含量范圍內(nèi)的CBD。同樣的原理也可以用于檢測(cè)傳染病，Ma 等［80］在紙基聚合物微流控裝置上設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)丙肝抗原（HCV）的POCT裝置，可以在50 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)LOD為9.1 ng/μL的多色快速檢測(cè)。Alhogail等［81］設(shè)計(jì)了一種使用D-氨基酸底物來檢測(cè)李斯特菌蛋白酶的比色試紙條，試紙條T線為連接了半胱氨酸殘基的金單質(zhì)，磁球偶聯(lián)D-氨基酸后會(huì)與T線結(jié)合使其變?yōu)楹谏Ｈ鐖D8B所示，當(dāng)存在李斯特菌蛋白酶時(shí)其會(huì)切割特定的肽序列，使T線由黑色變?yōu)榻鹕?，LOD為2.1×102CFU/mL。

圖8 蛋白酶催化的多色比色平臺(tái)應(yīng)用Fig.8 Applications of protease-catalyzed multicolor colorimetric platforms

除單一酶的催化作用外，酶級(jí)聯(lián)擴(kuò)增法通過聯(lián)用多種酶，可以達(dá)到顯著擴(kuò)增目標(biāo)物信號(hào)的目的，近年來已廣泛用于生物傳感等領(lǐng)域［82］。He等［83］提出了一種可穿戴式葡萄糖響應(yīng)級(jí)聯(lián)酶促多色比色平臺(tái)，原理如圖8C 所示，葡萄糖會(huì)在GOD 作用下氧化生成H2O2，在HRP 作用下H2O2將I-氧化為I2及，隨葡萄糖含量升高而升高的會(huì)定量蝕刻AuNRs 導(dǎo)致溶液產(chǎn)生由棕色到綠色到藍(lán)色最后到粉色的顏色變化。通過與比色卡進(jìn)行對(duì)比，可以可視化半定量0.02～2.4 mmol/L間的葡萄糖濃度； 使用智能手機(jī)RGB處理軟件分析則可以實(shí)現(xiàn)LOD 低至0.1 mmol/L 的定量檢測(cè)。Hu 等［84］基于級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng)設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏（DDVP）的多色碳點(diǎn)（CDs）比色平臺(tái)，檢測(cè)原理如圖8D所示，在沒有DDVP的體系中，乙酰膽堿酯酶（AChe）催化乙酰膽堿（ACh）生成膽堿，膽堿氧化酶（ChOx）氧化膽堿生成H2O2猝滅CDs 熒光； 而含有DDVP時(shí)因其抑制了Ache活性，會(huì)導(dǎo)致CDs熒光恢復(fù)?？傊?，這種高效的酶級(jí)聯(lián)催化為各類小分子檢測(cè)平臺(tái)的構(gòu)建提供了一個(gè)廣闊的平臺(tái)。

3.2 基于酶模擬物催化的多色比色平臺(tái)

酶模擬物通常是具有氧化酶樣［85］、過氧化物酶樣［86］、過氧化氫酶樣［87］或核酸酶樣［88］的小分子或納米結(jié)構(gòu)，與蛋白酶相比，它們的結(jié)構(gòu)、形態(tài)和功能在復(fù)雜環(huán)境中更加穩(wěn)定，并且相對(duì)容易制備。通過催化底物產(chǎn)生直接或間接顯色，這些酶模擬物在開發(fā)更靈敏、更穩(wěn)定的生物傳感平臺(tái)方面的應(yīng)用前景十分可觀［89-94］。

DNA 酶（DNAzyme）是以二價(jià)陽離子依賴性方式催化以實(shí)現(xiàn)切割RNA 或DNA 功能的一種DNA 鏈。目前，DNA 酶因其有著易于制備、穩(wěn)定性好、親和力高和空間柔韌性強(qiáng)等獨(dú)特性能，在納米結(jié)構(gòu)和生物傳感平臺(tái)的設(shè)計(jì)中得到了廣泛關(guān)注［95-96］。Wan 等［97］設(shè)計(jì)了一種自切割DNA 酶探針，用于HepG2 細(xì)胞中miRNA-222和miRNA-223的多色及同步信號(hào)放大成像。如圖9A所示，在沒有目標(biāo)miRNA時(shí)，DNA酶的催化活性受到抑制，5/6-羧基熒光素（ FAM）和四甲基羅丹明（TAMRA）的熒光分別被猝滅； 在目標(biāo)miRNA 存在時(shí)，miRNA 可以與DNA 酶探針的靶標(biāo)序列雜交生成活性DNA 酶結(jié)構(gòu)，進(jìn)而在Mg2+存在下切割底物核酸，從而使熒光染料與淬滅劑分開，恢復(fù)了FAM 和TAMRA 的綠色和紅色熒光。同時(shí)，目標(biāo)miRNA 被釋放參與下一個(gè)催化循環(huán)。Sang 等［98］使用DNA 酶設(shè)計(jì)了一種同時(shí)檢測(cè)牛奶中3 種污染物的多色ELISA 方法，LOD 可低至pmol 級(jí)別； 如圖9B 所示，Zhu 等［99］設(shè)計(jì)了一種含有DNA 酶結(jié)構(gòu)的DNA 正四面體結(jié)構(gòu)，可以對(duì)活細(xì)胞內(nèi)miRNA-21及miRNA-155實(shí)現(xiàn)特異性多色成像。除DNA酶的切割活性外，利用DNA 過氧化物酶樣活性進(jìn)行高靈敏度顯色檢測(cè)也在近期表現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。Li等［100］建立了一種便攜可視化半定量多色納米薄膜檢測(cè)平臺(tái)，該平臺(tái)用于檢測(cè)前列腺特異型抗原（PSA）。在PSA 與檢測(cè)體系中適配體結(jié)合后，會(huì)在催化發(fā)夾組裝（CHA）作用下自組裝成DNA 三叉體，在Hemin 及K+作用下每個(gè)DNA 三叉體的末端均會(huì)形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，其有著過氧化物酶樣活性，可以催化TMB 反應(yīng)生成TMB2+繼而蝕刻AuNRs 產(chǎn)生如圖9C 所示的豐富的顏色變化。為便于可視化半定量檢測(cè)，規(guī)定薄膜顏色變成紫色時(shí)為PSA臨界值（PSA=4 ng/mL），薄膜呈紅色時(shí)表明患前列腺癌可能性高（PSA＞10 ng/mL）。

圖9 基于DNA酶模擬物的多色比色平臺(tái)應(yīng)用Fig.9 Applications of a multi-color colorimetric platform based on DNA enzyme simulants

納米酶是指基于納米材料的酶模擬物，大多數(shù)納米酶通過催化底物顯色進(jìn)行比色檢測(cè)［101-102］，也有某些納米酶會(huì)催化底物發(fā)出熒光從而放大檢測(cè)信號(hào)［103］。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)多色比色平臺(tái)可以進(jìn)一步降低比色背景并提高靈敏度，也可以開發(fā)便攜式檢測(cè)設(shè)備。如圖10A和10B 所示，Huang等［104］合成了具有多酶活性的氧化釩量子點(diǎn)（VO2-QD），并利用其在乙醇-TMB 溶液中對(duì)H2O2濃度的顏色響應(yīng)，構(gòu)建了一個(gè)顏色-反應(yīng)速度-吸光度3D坐標(biāo)系，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)H2O2濃度的快速可視化半定量檢測(cè)。Li等［105］合成了一種表面修飾MnO2和CeO2的鐵納米花（Fef NCs），原理如圖10C 所示，利用其兒茶酚氧化酶樣活性對(duì)復(fù)雜樣品中ALP 進(jìn)行雙熒光比率檢測(cè)，LOD 低至0.19 mU/mL。如圖10D 所示，F(xiàn)an 等［106］發(fā)現(xiàn)二氧化錳納米片（MnO2NS）不僅可以猝滅東莨菪素（SC）的藍(lán)色熒光，其氧化酶樣活性還可以大幅增強(qiáng)熒光紅染料（Amplex red， AR）的紅色熒光，但谷胱甘肽（GSH）會(huì)將MnO2NS 還原為Mn2+并失去氧化酶樣活性，從而使紅色熒光降低，藍(lán)色熒光恢復(fù)?；诖嗽硭麄?cè)O(shè)計(jì)了超靈敏檢測(cè)GSH 的比率雙熒光傳感器，LOD 低至6.7 nmol/L。Zhang等［107］合成了一種包封有紅色熒光團(tuán)的MOF結(jié)構(gòu)（CoZn ZIF@HTD），其過氧化物酶樣活性可以串聯(lián)檢測(cè)磷酸根（Pi）、鄰苯二胺（OPD）及苯甲醛（BA）。如圖10 E 所示，首先Pi 會(huì)促進(jìn)紅色熒光團(tuán)HTD 釋放使溶液變?yōu)榧t色，之后OPD 會(huì)被CoZn 的過氧化物酶樣活性氧化導(dǎo)致溶液由紅色變?yōu)辄S色，最后加入BA與OPD反應(yīng)生成席夫堿阻礙OPD氧化，溶液顏色由黃色逐漸變?yōu)闊o色。為了適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要，他們開發(fā)了基于紙張的傳感平臺(tái)，通過與比色卡對(duì)比顏色可對(duì)溶液中Pi、OPD 和BA實(shí)現(xiàn)可視化半定量分析。在免疫層析試紙條中，納米酶也可以通過催化底物發(fā)生顏色變化來增強(qiáng)測(cè)試線（T 線）上的信號(hào)。Song 等［108］設(shè)計(jì)了具有過氧化物酶樣活性的自組裝多色納米顆粒（SAN），可用于試紙條上同時(shí)檢測(cè)心肌鈣蛋白I和肌紅蛋白。如圖10F所示，SAN通過疏水作用將顯色底物TMB和3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）包封為納米顆粒，在T 線上發(fā)生免疫夾心反應(yīng)后會(huì)在Cu2+/H2O2作用下發(fā)生顏色變化，即T線分別變?yōu)榧t色（心肌鈣蛋白I）和藍(lán)色（肌紅蛋白），LOD分別為12 pg/mL和0.2 ng/mL。

圖10 基于納米酶的多色比色平臺(tái)應(yīng)用Fig.10 Applications of a nano-enzyme based multi-color colorimetric platform

4 結(jié)論與展望

本綜述總結(jié)了多種基于多色比色法的生物傳感平臺(tái)，多色熒光分子探針可以解決復(fù)雜生理環(huán)境下對(duì)多目標(biāo)物進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)及成像分辨率低的問題，也能對(duì)生物體內(nèi)多靶點(diǎn)進(jìn)行時(shí)空分辨率成像，進(jìn)而闡明各類生物分子間相互作用機(jī)理； 多色納米材料可以改進(jìn)經(jīng)典比色反應(yīng)，提高靈敏度并減少假陽性的出現(xiàn)，還可以通過顯著的顏色變化實(shí)現(xiàn)單色信號(hào)無法達(dá)成的裸眼可視化半定量檢測(cè)，簡(jiǎn)化了生物傳感平臺(tái)檢測(cè)過程； 多色酶促反應(yīng)在原有比色反應(yīng)基礎(chǔ)上，一方面可以通過各類信號(hào)放大反應(yīng)提高靈敏度，并基于顏色組合進(jìn)行裸眼可視化半定量，另一方面通過使用穩(wěn)定及高催化活性的納米酶代替天然蛋白酶，可以在復(fù)雜環(huán)境下進(jìn)行超靈敏檢測(cè)。在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方面，多色比色生物傳感平臺(tái)既可以與比色卡進(jìn)行對(duì)比從而判斷目標(biāo)物含量范圍，又可以基于智能手機(jī)、微流控芯片等微型設(shè)備實(shí)現(xiàn)即時(shí)定量分析，從而提高檢測(cè)效率，簡(jiǎn)化操作程序，降低成本。對(duì)于某些需要進(jìn)行分型診治的疾病如非小細(xì)胞肺癌、口腔鱗癌等，可以通過多色比色平臺(tái)快速檢測(cè)相關(guān)生物標(biāo)志物的含量范圍，從而降低疾病分型診斷成本并提高分型診斷速度，在提高門診鑒診效率的同時(shí)為治療結(jié)果及預(yù)后情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)； 也可以用于資源匱乏地區(qū)開展疾病快速篩查，進(jìn)而為真正有需要的患者更好地分配醫(yī)療資源?？傮w而言，多色比色生物傳感平臺(tái)是一個(gè)頗有前途的研究領(lǐng)域，并具有十分可觀的應(yīng)用前景。