路 遠(yuǎn)，唐 俊，李文川，許佐明，羅宗將，馬嘉盛，浦 澗

（右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000）

肝細(xì)胞癌是一種常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌，通常在不可切除的晚期被診斷，發(fā)病率和死亡率高，是癌癥相關(guān)死亡的第三大主要原因［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020 年，全球估計(jì)有90.57 萬(wàn)人確診肝癌，同時(shí)83.02 萬(wàn)人死于肝癌［2］。目前，肝細(xì)胞癌患者有多種治療選擇，大致可以分為治愈性治療（肝移植、手術(shù)切除或消融/細(xì)分性動(dòng)脈內(nèi)放射性微球）和非治愈性治療（動(dòng)脈化療栓塞（TACE）、全身性治療），但對(duì)于BCLC D 期患者仍無(wú)特異有效的治療方法［3，4］。

線粒體自噬是一種保守的細(xì)胞內(nèi)分解代謝過(guò)程，負(fù)責(zé)清除功能失調(diào)或多余的線粒體以維持細(xì)胞中的線粒體質(zhì)量和需要［5］。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞依賴(lài)健康的線粒體促進(jìn)其生長(zhǎng)［6］，并通過(guò)線粒體自噬更新決定癌癥功能和命運(yùn)［7］。例如，STOML2 可能通過(guò)促進(jìn)PINK1 介導(dǎo)的線粒體自噬，增加肝細(xì)胞癌的 轉(zhuǎn) 移 能 力，并 調(diào) 節(jié) 對(duì)Lenvatinib 的 敏 感 性［8］。此外，Ketoconazole 可能通過(guò)加劇線粒體自噬來(lái)誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌的凋亡［9］。因此，線粒體狀態(tài)對(duì)肝細(xì)胞癌的發(fā)展尤為重要。近幾年的研究表明，化療和靶向藥物介導(dǎo)的線粒體損傷因線粒體自噬增加而減弱，線粒體自噬與腫瘤治療耐藥性和復(fù)發(fā)密切相關(guān)［10-12］。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了線粒體自噬在肝細(xì)胞癌發(fā)展和治療中的重要性，也揭示了其作為潛在治療靶點(diǎn)的可能性。

可溶性載體家族6 成員8（Solute carrier family 6 member 8，SLC6A8）是一種編碼肌酸特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，其以Na+和Cl-依賴(lài)性的方式將肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)［13］。目前，SLC6A8基因在多種癌癥中的作用已被多次報(bào)道［14-16］，其中，在肝細(xì)胞癌中，SLC6A8基因已被發(fā)現(xiàn)其敲低可抑制人肝癌Huh-7和Hep3B 細(xì)胞侵襲和遷移［17］。而線粒體自噬受體BNIP3L（BCL2/adenovirus E1B interacting protein 3-like，BCL2/腺病毒E1B 相互作用蛋白3 樣）通過(guò)介導(dǎo)選擇性去除線粒體［18］。然而，SLC6A8 是否通過(guò)BNIP3L 調(diào)控線粒體自噬未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，值得進(jìn)一步探討。

本研究旨在通過(guò)轉(zhuǎn)染SLC6A8 過(guò)表達(dá)慢病毒，探討SLC6A8 過(guò)表達(dá)通過(guò)BNIP3L 調(diào)控線粒體自噬，及其在促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖中的作用，進(jìn)一步研究線粒體自噬在肝細(xì)胞癌中的調(diào)控機(jī)制和影響。這為深入理解SLC6A8 和BNIP3L 在肝細(xì)胞癌中的作用及其相互作用的機(jī)制提供了理論依據(jù)，同時(shí)深入對(duì)線粒體自噬的研究，有助于揭示肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制，并為肝細(xì)胞癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞株Huh-7、Hep3B 購(gòu)自上海生物科學(xué)研究所。在體外低氧條件下，人肝癌Huh-7 使用DMEM 培養(yǎng)基（HyClone，SH30243.01B）添加10%胎牛血清（Gibco，42F7180K）進(jìn)行培養(yǎng)，Hep3B 細(xì)胞則使用MEM 培養(yǎng)基（HyClone，SH30024.01B）加入10%胎牛血清培養(yǎng)。隨后，這些細(xì)胞在無(wú)血清的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。為模擬低氧環(huán)境，細(xì)胞被分別置于一個(gè)設(shè)置為1% O2、5% CO2和94% N2平衡氣體環(huán)境中，并在37 ℃溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，均持續(xù)培養(yǎng)20 h。完成培養(yǎng)后收樣以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。作為實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照，細(xì)胞以等量的磷酸鹽游離生理鹽水（PBS）處理12 h。

1.2 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析

利用仙桃學(xué)術(shù)（https：//www.xiantaozi.com/），通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析SLC6A8在正常人體組織和肝癌組織中的表達(dá)，以及SLC6A8與BNIP3L表達(dá)相關(guān)性，同時(shí)進(jìn)行肝癌組織中SLC6A8與線粒體自噬相關(guān)基因的相關(guān)性分析。

1.3 RT-PCR 檢 測(cè)SLC6A8 和BNIP3L 的 表 達(dá)

首先使用Trizol 試劑盒（Invitrogen，GT1402）按照說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。接著使用RNeasy Mini 試劑盒（Qiagen，74104）對(duì)提取的總RNA 進(jìn)行純化處理。然后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript ⅣReverse Transcriptase（Invitrogen，18090010）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA 轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用GoScript Reverse Transcription System 試 劑 盒（Promega，A5000）進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。表達(dá)數(shù)據(jù)分析統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化為內(nèi)參GAPDH。使用2-ΔΔCt方法評(píng)估相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中涉及的引物如下：SLC6A8-F：CATCTCCAAGGTGGCAGAGT；SLC6A8-R：G ATGAAGCCCTCCACACCTA；BNIP3L-F：CAG CAGGGACCATAGCTCTC；BNIP3L-R：TCATGGCTCCACTTTTCCTC；GAPDH-F：CCAGG TGGTCTCCTCTGA；GAPDH-R：GCTGTAGCCAAATCGTTGT。

1.4 Western blot 檢測(cè)SLC6A8 和BNIP3L 蛋白的表達(dá)量

使用RIPA 裂解液（碧云天技術(shù)，P0013B）50 mL 對(duì)Huh-7 和Hep3B 細(xì)胞進(jìn)行裂解，收集蛋白質(zhì)樣本。并使用BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒（Thermo Fisher Scientific，23225）按照說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將蛋白樣本與SDS 樣本緩沖液混合，并在SDS-PAGE 凝膠（Bio-Rad，456-1094）中進(jìn)行電泳分離。然后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜（Merck Millipore，IPVH00010）上。為了防止非特異性結(jié)合，使用5%脫脂牛奶50 mL 在TBST 緩沖液中封閉膜1 h。接下來(lái)，加入抗SLC6A8（ab151315）和抗BNIP3L（ab10433）一抗（Abcam）進(jìn)行反應(yīng)，按1∶1 000稀釋?zhuān)總€(gè)樣本5 μL 孵育膜過(guò)夜。使用TBST 緩沖液洗滌膜3 次，使用與一抗相匹配的HRP 標(biāo)記二抗（Santa Cruz Biotechnology，sc-2004）進(jìn)行反應(yīng)，按1∶2 000 稀釋?zhuān)總€(gè)樣本5 μL 孵育1 h。再次使用TBST 緩沖液洗滌膜3 次。使用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（GENVIEW，GE2301）進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色。使用Image J 軟件定量條帶密度。將蛋白質(zhì)的相對(duì)水平歸一化為GAPDH。

1.5 免疫熒光觀察線粒體自噬相關(guān)蛋白

將Huh-7 和Hep3B 細(xì)胞株種植在適合免疫熒光的載玻片上。使用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑（Thermo Fisher Scientific，11668019）轉(zhuǎn)染SLC6A8過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、陰性對(duì)照質(zhì)粒到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，使用4% 甲醛10 mL 固定細(xì)胞15 min。使用0.1% Triton X-100（Sigma-Aldrich，T9284）10 mL在PBS 中滲透細(xì)胞10 min。使用5%BSA（Sigma-Aldrich，A9418）50 mL 在PBS 中封閉細(xì)胞1 h，以防止非特異性結(jié)合。隨后，加入抗TOM20（ab56783）和抗LC3（ab128025）一抗（Abcam），按1∶200 稀釋?zhuān)總€(gè)樣本5 μL 并在4 ℃下孵育過(guò)夜。使用PBS 洗滌細(xì)胞3 次，每次5 min。使用與一抗相匹配的熒光標(biāo)記山羊抗兔二抗（Jackson ImmunoResearch，111-545-144），按1∶500 稀釋?zhuān)總€(gè)樣本5 μL 于避光室溫環(huán)境中孵育細(xì)胞1 h。再使用PBS 洗滌細(xì)胞3 次，每次5 min。使用DAPI（Sigma-Aldrich，D9542）按1∶1 000 稀釋染色細(xì)胞核10 min。使用PBS 洗滌細(xì)胞兩次。使用抗褪色封片液（Vector Laboratories，H-1000）封片。然后使用熒光顯微鏡觀察并捕獲圖像。

1.6 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖

將Huh-7 和Hep3B 細(xì)胞株分別種植在96 孔板中，每孔5×103細(xì)胞，不同組進(jìn)行3 次重復(fù)。使用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染SLC6A8 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒、陰性對(duì)照質(zhì)粒、BNIP3L 沉默質(zhì)粒到細(xì)胞中。在1、2、3、4、5 d 固定時(shí)間點(diǎn)，向每孔添加10 μL CCK-8 試劑（Dojindo，CK04）。并置于37 ℃、5% CO2孵育器中孵育3 h，直到顏色發(fā)展良好。使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下讀取吸光度值（OD 值）。使用陰性對(duì)照組的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。使用GraphPad Prism 9.0.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與作圖，兩組之間的比較采用Student'st檢驗(yàn)，單因素方差進(jìn)行多組比較，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLC6A8 在肝癌組織中高表達(dá)且與BNIP3L 表達(dá)正相關(guān)

通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析SLC6A8基因，發(fā)現(xiàn)SLC6A8在肝癌組織中顯著高表達(dá)（t=0.94，P＜0.001），見(jiàn) 圖1A；且SLC6A8在 肝 癌 組 織 中 與BNIP3L表達(dá)呈正相關(guān)（R=0.327，P＜0.001），見(jiàn)圖1B。根據(jù)對(duì)肝癌組織中SLC6A8 與線粒體自噬相關(guān)基因的相關(guān)性分析，結(jié)果顯示SLC6A8 在肝癌組織中與線粒體自噬相關(guān)基因BNIP3L、PINK1、ATG5、ATG7、ULK1、MAP1LC3B有一定相關(guān)性，見(jiàn)圖1C。

圖1 SLC6A8 在肝癌組織中高表達(dá)且與BNIP3L 表達(dá)正相關(guān)Fig 1 SLC6A8 is highly expressed in liver cancer tissue and positively correlated with BNIP3L expression

2.2 SLC6A8 過(guò)表達(dá)促進(jìn)線粒體自噬

采用RT-PCR 檢測(cè)SLC6A8過(guò)表達(dá)人肝癌Huh-7 及Hep3B 細(xì)胞中SLC6A8mRNA 的表達(dá)。結(jié)果顯 示，OE -SLC6A8 組（SLC6A8 過(guò) 表 達(dá) 組）中SLC6A8相 對(duì) 表 達(dá) 為4.29±0.34，顯 著 高 于NC 組（陰性對(duì)照組）中SLC6A8 相對(duì)表達(dá)1.01±0.02（t=16.63，P＜0.001），見(jiàn)圖2A。使用Western blot 檢測(cè)SLC6A8 蛋白的表達(dá)量。結(jié)果顯示，OE-SLC6A8組中SLC6A8 蛋白相對(duì)表達(dá)為0.81±0.02，顯著高于NC 組中SLC6A8 蛋白相對(duì)表達(dá)0.36±0.02（t=24.32，P＜0.001），見(jiàn) 圖2B。 使 用CCK -8 檢 測(cè)SLC6A8 過(guò)表達(dá)人肝癌Huh-7 及Hep3B 細(xì)胞增殖率。結(jié)果顯示，OE-SLC6A8 組第五天細(xì)胞增殖率（1.69±0.15）顯著高于NC 組2.85±0.13（t=22.20，P＜0.001），見(jiàn)圖2C。通過(guò)免疫熒光標(biāo)記線粒體蛋白TOM20 以及自噬體蛋白LC-3 觀察線粒體自噬。結(jié)果顯示，OE-SLC6A8 組中發(fā)生的線粒體自噬（黃色部分）顯著多于NC 組，見(jiàn)圖2D。

圖2 SLC6A8 過(guò)表達(dá)促進(jìn)線粒體自噬促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖Fig 2 Overexpression of SLC6A8 promotes mitochondrial autophagy and promotes liver cancer cells proliferation

2.3 SLC6A8 過(guò)表 達(dá)促進(jìn)BNIP3L 表 達(dá)

采用RT-PCR 檢測(cè)SLC6A8過(guò)表達(dá)人肝癌Huh-7 及Hep3B 細(xì)胞中BNIP3LmRNA 的表達(dá)。結(jié)果顯 示，OE-SLC6A8 組 中BNIP3LmRNA 相 對(duì) 表 達(dá)（1.40±0.13）顯著高于NC 組中BNIP3LmRNA 相對(duì)表達(dá)1.03±0.07（t=4.34，P＜0.05），見(jiàn)圖3A。使用Western blot 檢測(cè)BNIP3L 蛋白的表達(dá)量。結(jié)果顯示，OE-SLC6A8 組中BNIP3L 蛋白相對(duì)表達(dá)量（0.82±0.03）顯著高于NC 組中BNIP3L 蛋白相對(duì)表達(dá)量0.34±0.03（t=19.60，P＜0.001），見(jiàn)圖3B。

圖3 SLC6A8 過(guò)表達(dá)促進(jìn)BNIP3L 表達(dá)Fig 3 Overexpression of SLC6A8 promotes BNIP3L expression

2.4 沉默BNIP3L 逆轉(zhuǎn)SLC6A8 過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用

采用CCK-8 檢測(cè)沉默BNIP3L 后SLC6A8 過(guò)表達(dá)人肝癌Huh-7 及Hep3B 細(xì)胞的增殖率。CCK-8 結(jié) 果 顯 示，沉 默BNIP3L 后OE-SLC6A8+KDBNIP3L 組（過(guò)表達(dá)SLC6A8+沉默BNIP3L 組）第5 天 的 細(xì) 胞 增 殖 率（2.01±0.14）顯 著 低 于OESLC6A8 組（過(guò) 表 達(dá)SLC6A8 組）2.60±0.23（q=8.945，P＜0.001）；OE-SLC6A8 組第5 天的細(xì)胞增殖率（2.60±0.23）顯著高于NC 組1.77±0.13（q=12.54，P＜0.001），見(jiàn)圖4。

圖4 沉默BNIP3L 可以逆轉(zhuǎn)SLC6A8 過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用Fig 4 Silencing BNIP3L can reverse the promoting effect of SLC6A8 overexpression on liver cancer cells proliferation

3 討論

肝細(xì)胞癌是肝臟的原發(fā)性腫瘤，占肝臟原發(fā)性腫瘤的90%以上［3］。盡管近年來(lái)肝癌的治療方法有所進(jìn)步［3，19］，但其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制以及晚期診斷的問(wèn)題使得死亡率依然高居不下［20，21］。研究發(fā)現(xiàn)，基因的異常表達(dá)和調(diào)控可能是導(dǎo)致肝癌發(fā)生的關(guān)鍵因素之一［22］。某些基因的過(guò)度表達(dá)或沉默可能導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，進(jìn)而誘發(fā)肝癌的發(fā)生［23，24］。

SLC6A8基因編碼肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［25］，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其與結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤的惡性 進(jìn) 展 有 關(guān)［26，27］，并 且SLC6A8 在 多 種 癌 癥 中 都 有顯著的上調(diào)［28］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SLC6A8基因敲低可抑制人肝癌Huh-7 和Hep3B 細(xì)胞侵襲和遷移［17］。在本次研究中，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SLC6A8 的過(guò)表達(dá)不僅顯著促進(jìn)線粒體自噬，還促進(jìn)人肝癌Huh-7 及Hep3B 細(xì)胞的增殖，與前期研究［17］結(jié)果一致。

根據(jù)報(bào)道，線粒體功能障礙與多種慢性肝病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)［29］。線粒體自噬是一個(gè)關(guān)鍵的生物過(guò)程，它通過(guò)選擇性降解受損和老化的線粒體來(lái)維持細(xì)胞的線粒體質(zhì)量［30］，這對(duì)于肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展具有重要影響［31］。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬與代謝重編程、抗癌療法抗性和癌細(xì)胞干細(xì)胞有關(guān)，這 為 針 對(duì) 腫 瘤 的 治 療 提 供 了 新 的 策 略［32，33］。BNIP3L 是一種調(diào)控線粒體自噬的關(guān)鍵蛋白［34］，其功能異?？赡軐?dǎo)致線粒體自噬的紊亂，進(jìn)而影響肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展［31］。本研究顯示，在肝癌組織中SLC6A8與線粒體自噬相關(guān)基因BNIP3L的正相關(guān)性最為顯著。研究結(jié)果表明，SLC6A8的過(guò)表達(dá)能顯著促進(jìn)BNIP3LmRNA 和蛋白的表達(dá)，且沉默BNIP3L 可以逆轉(zhuǎn)SLC6A8 過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。 以上結(jié)果表明，SLC6A8 調(diào)控BNIP3L 的表達(dá)影響線粒體自噬，對(duì)肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生影響。

本研究雖然取得了一些有意義的研究結(jié)果，但仍存在不足。首先本研究主要基于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，未進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，因此SLC6A8 和BNIP3L在體內(nèi)的具體作用及機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。其次，本研究只探討了SLC6A8 與BNIP3L 之間的關(guān)系，但SLC6A8 可能還與其他基因或通路存在交互，這也是未來(lái)研究的方向。

總而言之，本研究發(fā)現(xiàn)SLC6A8 在肝癌組織中的高表達(dá)且與BNIP3L 正相關(guān)，SLC6A8 的過(guò)表達(dá)能促進(jìn)線粒體自噬和肝癌細(xì)胞的增殖，沉默BNIP3L 可逆轉(zhuǎn)SLC6A8 過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖促進(jìn)作用。這些發(fā)現(xiàn)不僅為理解肝細(xì)胞癌的發(fā)生機(jī)制提供了新的線索，也為開(kāi)發(fā)新的肝細(xì)胞癌治療策略提供了可能的靶點(diǎn)。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

路遠(yuǎn)： 實(shí)驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)分析與寫(xiě)稿；唐?。杭?xì)胞培養(yǎng)；李文川：RT-PCR 檢測(cè)；許佐明：Western blot 檢測(cè)；羅宗將：CCK8 檢測(cè)；馬嘉盛：免疫熒光觀察自噬；浦澗：文章審核與經(jīng)費(fèi)支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。