丁清穎, 昌家宇, 肖轉(zhuǎn)泉, 胡 嘉, 王宗德, 陳尚钘*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學 林學院;國家林業(yè)草原木本香料(華東)工程技術研究中心;國家林業(yè)草原/江西省樟樹工程技術研究中心,江西 南昌 330045; 2.江西師范大學 化學化工學院,江西 南昌 330022)

為了防治由植物病原菌引起的各種病害,減少其對農(nóng)林作物的危害,同時克服使用化學殺菌劑所造成的病原菌抗藥性、毒性農(nóng)藥殘留及其引起的環(huán)境污染等問題[1],科研人員一直致力于新型低毒高效抗菌劑的開發(fā)及應用[2]。本研究團隊曾以松節(jié)油主成分之一的β-蒎烯為原料,合成了多個系列的含氫化諾卜基的單季銨鹽[3-5]和對稱型雙子季銨鹽[6-7],并研究了這些季銨鹽類化合物對造成松竹林木、果樹蔬菜、水稻及一些經(jīng)濟作物病害的植物病原菌的抑菌活性,結(jié)果表明多數(shù)化合物對所試病原菌具有很好的抑制作用,抑菌能力接近甚至遠遠超過常用的農(nóng)用殺菌劑百菌清、多菌靈[8-9]。許多研究表明,醛酮的肟類化合物和縮氨基硫脲類化合物及其與過渡金屬離子的絡合物都有較好的抑菌活性[10-12]。前期研究中,本研究團隊以α-蒎烯制備合成樟腦的中間產(chǎn)物莰烯為原料,合成了具有優(yōu)異抗植物病原菌性能的莰烯醛縮氨基硫脲、莰烯醛肟[13]、內(nèi)型異莰烷基甲醛肟及其醚類化合物[14]。本研究以莰烯醛的選擇性氫化產(chǎn)物內(nèi)型異莰烷基甲醛(1)為原料,分別與5種氨基硫脲類化合物(2a～2e)進行縮合反應,合成了5種內(nèi)型異莰烷基甲醛縮氨基硫脲類化合物(3a～3e),再采用菌絲生長速率法測試了化合物對8種植物病原菌生長的抑制效果,以期為新型抗菌劑的開發(fā)以及研究相關化合物結(jié)構(gòu)與生物活性之間的關系提供參考。

1 實 驗

1.1 材料與儀器

內(nèi)型異莰烷基甲醛,GC純度98%,由江西農(nóng)業(yè)大學國家林業(yè)草原木本香料(華東)工程技術研究中心提供;氨基硫脲、 4-甲基-3-氨基硫脲、 4-苯基-3-氨基硫脲、 4-對氯苯基-3-氨基硫脲、 4-對甲苯基-3-氨基硫脲、乙醇、乙酸乙酯、石油醚(60～90 ℃)等,均為市售分析純試劑。水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)、松枯梢病病原菌(Sphaeropsissapinea)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.niveum)、油茶炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、輪枝鐮刀菌(Fusariumverticillioides)、油茶果生刺盤孢菌(Colletotrichumfructicola)、枇杷炭疽病菌(Colletotrichumacutatum)、彩絨革蓋菌(Coriolusversicolor)8種菌種,均由江西農(nóng)業(yè)大學林學院森林保護教研室提供。

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-10無菌超凈工作臺,蘇州凈化設備有限公司;CHP-250智能培養(yǎng)箱,上海三發(fā)科學儀器有限公司;Trip TOFTM 5600高分辨質(zhì)譜儀,美國SCIEX公司;Nicolet IR 6700 紅外光譜儀,美國賽默飛世爾科技公司;Bruker AVANCE 400型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑,TMS為內(nèi)標),瑞士Bruker公司。

1.2 內(nèi)型異莰烷基甲醛縮氨基硫脲類化合物的合成

1.2.1合成路線 內(nèi)型異莰烷基甲醛(1)分別與氨基硫脲(2a)、 4-甲基-3-氨基硫脲(2b)、 4-苯基-3-氨基硫脲(2c)、 4-對氯苯基-3-氨基硫脲(2d)、 4-對甲苯基-3-氨基硫脲(2e)進行縮合反應,合成得到5種異莰烷基甲醛縮氨基硫脲類化合物(3a～3e),合成路線見圖1。

2a, 3a.R=H; 2b,3b.R=CH3; 2c,3c.R=C6H5; 2d,3d.R=p-Cl-C6H4; 2e,3e.R=p-CH3-C6H4

1.2.2合成方法 在250 mL磨口錐形瓶上安裝三叉接管,上插球形回流冷凝管和滴液漏斗,錐形瓶置于磁力加熱攪拌器上,內(nèi)放磁力攪拌子。在瓶中加入0.05 mol氨基硫脲類化合物2、 50 g水、 25 g乙醇,攪拌溶解;將0.05 mol內(nèi)型異莰烷基甲醛、 25 g乙醇于滴液漏斗中混勻,攪拌下緩慢滴加至錐形瓶中,約1 h滴完。滴完后升溫至(50±2) ℃保溫反應,24 h后取出約1 mL反應液,加石油醚3 mL,混搖后取上層液體用無水硫酸鈉干燥后進行氣相色譜分析,如未檢測到內(nèi)型異莰烷基甲醛,則認為反應已經(jīng)完成。反應結(jié)束后將反應液取出,冷卻至10 ℃以下,靜置析出固體產(chǎn)物,過濾并以冷石油醚浸洗多次,將濾餅抽濾至干,真空干燥,得粉末狀固體產(chǎn)物3。

1.3 抑菌活性測試

采用菌絲生長速率法,按文獻[15]所述的方法,測定化合物3a～3e對8種植物病原菌的抑制作用。以無任何化合物的PDA培養(yǎng)基平板作為空白對照,以98%百菌清為陽性對照,藥液按一定比例加入至經(jīng)滅菌處理的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)液中, 用二倍稀釋法將化合物3a～3e和陽性對照物百菌清配制成最終質(zhì)量濃度分別為200、 100、 50、 25和12.5 mg/L的藥液,每組重復3次,接種后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)數(shù)天,待空白對照組平板的菌落直徑生長至6 cm以上時,用十字交叉法測量其直徑,根據(jù)菌落直徑計算出化合物3a～3e對8種植物病原菌的抑制率(η),公式如下:

η=(dCK-dT)/dCK×100%

式中:dCK,dT—分別表示空白對照和處理后的菌落直徑,mm。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物3的結(jié)構(gòu)表征

2.2 化合物3a～3e的抑菌活性

用菌絲生長速率法對內(nèi)型異莰烷基甲醛縮氨基硫服類化合物3a～3e的抑菌活性進行了測定。5種化合物對8種植物病原菌的抑制率數(shù)據(jù)列于表1。

表1 化合物3a～3e對8種植物病原菌的抑制率1)

由表1可知,5個內(nèi)型異莰烷基甲醛縮氨基硫脲類化合物中,3a在5個質(zhì)量濃度下對8種植物病原菌生長的抑制率基本都高于其他4個化合物,在3a所有40個抑制率結(jié)果中,有9個達到100%。在8種植物病原菌中,5個化合物對水稻紋枯病菌抑制效果普遍較好,在質(zhì)量濃度為25 mg/L時抑制率均超過了50%(除3c外)。與陽性對照百菌清相比,當質(zhì)量濃度為50 mg/L時,除輪枝鐮刀病菌以外,3a對另外7種病原菌的抑制率均高于百菌清;其中3a對油茶果生刺盤孢菌和彩絨革蓋菌的抑制率均達100%,對油茶炭疽病菌、枇杷炭疽病菌的抑制率分別為91.9%和97.2%,對水稻紋枯病菌、松枯梢病病原菌和西瓜枯萎病菌的抑制率分別為80.7%、 79.8%和79.5%。

3b～3e是含有取代基的縮氨基硫脲類化合物,從表1數(shù)據(jù)可以看出,它們的抑制率都不如無取代基化合物3a,其中以含有苯基的3c抑制率最低,但苯環(huán)4號位有氯取代的3d又比有甲基取代的3e對8種病原菌的抑制率普遍要高一些。

3 結(jié) 論

3.1由莰烯醛氫化得到的內(nèi)型異莰烷基甲醛合成了5種縮氨基硫脲類化合物,通過1H NMR、13C NMR、IR和MS鑒定為內(nèi)型異莰烷基甲醛縮氨基硫脲(3a)、內(nèi)型異莰烷基甲醛縮-4-甲基氨基硫脲(3b)、內(nèi)型異莰烷基甲醛縮-4-苯基氨基硫脲(3c)、內(nèi)型異莰烷基甲醛縮-4-對氯苯基氨基硫脲(3d)、內(nèi)型異莰烷基甲醛縮-4-對甲苯基氨基硫脲(3e)。

3.2采用菌絲生長速率法對8種植物病原菌進行了抑菌試驗,結(jié)果表明:無取代基團的內(nèi)型異莰烷基甲醛縮氨基硫脲(3a)對8種病原菌的生長有很好的抑制作用。在質(zhì)量濃度為50 mg/L時,3a對油茶炭疽病菌、枇杷炭疽病菌、油茶果生刺盤孢菌、彩絨革蓋菌、水稻紋枯病菌、松枯梢病病原菌和西瓜枯萎病菌的抑制率均高于陽性對照樣百菌清。