謝益民, 岳園園, 趙云博, 魏 鑫

(1.湖北工業(yè)大學(xué) 制漿造紙研究院,湖北 武漢 430068; 2.湖北工業(yè)大學(xué) 綠色輕工材料湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430068)

全球癌癥患者中肺癌的死亡率最高,每年約有180萬肺癌患者死亡,占癌癥死亡總?cè)藬?shù)的18%[1-2]。化療是目前用于對抗癌癥的常見治療方法,然而,現(xiàn)有的肺癌化療藥物普遍存在生物利用度低、水溶性差、治療指數(shù)低、劑量要求高和靶向性差等局限性[3],在殺死癌細(xì)胞的同時對人體自身也造成了很大的傷害,因此人們一直致力于天然藥物在抗癌上的應(yīng)用。木質(zhì)素已被證實具有一定的抗腫瘤活性,Lu等[4]發(fā)現(xiàn)堿處理的木質(zhì)素可抑制2種自由基相關(guān)酶黃嘌呤氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)的活性,是一種超氧陰離子和羥基自由基清除劑,同時發(fā)現(xiàn)堿木質(zhì)素可阻礙酶和非酶系統(tǒng)中的脂質(zhì)過氧化以及宮頸癌HeLa S3細(xì)胞的生長。Lbaj等[5]從硫酸鹽法制漿廢液中分級得到木質(zhì)素,在小鼠淋巴細(xì)胞中測試了木質(zhì)素的體外抗腫瘤活性,與對照組相比,在木質(zhì)素預(yù)孵育的細(xì)胞中由H2O2誘導(dǎo)的DNA鏈損傷明顯減少。Geies等[6]采用氫氧化鈉-硫酸氫鈉法從甜高粱、稻草和甘蔗渣3種不同的農(nóng)業(yè)廢棄物中分離木質(zhì)素,發(fā)現(xiàn)所有木質(zhì)素樣品均對肺癌A549細(xì)胞具有較高的細(xì)胞毒性潛力。葉哲孜等[7-8]合成了低相對分子質(zhì)量的木質(zhì)素模型物(DHP),在對DHP的生理活性研究中發(fā)現(xiàn)苯環(huán)上的甲氧基、側(cè)鏈上的羧基會降低木質(zhì)素的抗腫瘤性能,β-O-4連接對抗腫瘤活性無影響,β-5連接的苯基香豆?jié)M結(jié)構(gòu)抗癌效果明顯。Xie等[9]合成了G型和GS型低分子木質(zhì)素模型物,發(fā)現(xiàn)β-5連接的二聚體、三聚體能夠抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的生長,而β-O-4連接對抗腫瘤活性無貢獻。與合成的抗癌化療藥物相比,木質(zhì)素還具有很好的生物相容性,Sakagami等[10]發(fā)現(xiàn)向小鼠經(jīng)口給藥帶標(biāo)記的天然木質(zhì)素和合成木質(zhì)素后,會通過消化道吸收并通過尿液和糞便排出,不會殘留在體內(nèi)。Ugartondo等[11]發(fā)現(xiàn)甘蔗渣木質(zhì)素在一定濃度范圍內(nèi)具有很高的抗氧化能力,并且對正常人體細(xì)胞無害。Barapatre等[12]從尼羅相思木材中提取不同的木質(zhì)素組分,發(fā)現(xiàn)對人體乳腺癌MCF-7細(xì)胞具有較高的細(xì)胞毒性潛力(IC50值為2～15 mg/L)。與多糖基材料相比,木質(zhì)素尚未在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛開發(fā)應(yīng)用[13],并且由于木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜,有關(guān)木質(zhì)素抗癌活性的根源還缺乏系統(tǒng)的解析。對于工業(yè)木質(zhì)素中生理活性較高的低聚物(苯丙烷結(jié)構(gòu)單元在10以下)的分離提純和抗癌性能方面尚缺乏系統(tǒng)性的研究。因此,本研究在分離提取銀杏硫酸鹽木質(zhì)素中低聚物的基礎(chǔ)上,一方面探索木質(zhì)素對于肺癌A549的抗腫瘤活性,另一方面分析其化學(xué)結(jié)構(gòu),闡釋木質(zhì)素生物活性的構(gòu)效關(guān)系,以期為木質(zhì)素的高附加值利用拓寬方向。

1 實 驗

1.1 原料、試劑及儀器

6年生銀杏(GinkgobilobaL.),武漢江夏苗圃;人源肺癌A549細(xì)胞,北京北納生物科技有限公司;硫化鈉、鹽酸、溴化鉀、正己烷、乙醚、乙酸乙酯、二氧六環(huán)、丙酮,國藥化學(xué)試劑公司;PBS緩沖液,德國Hyclone公司;RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素混合液,美國Gibco公司;胎牛血清(FBS),浙江天杭生物科技有限公司;噻唑藍(lán)(MTT),北京蘭杰柯科技有限公司;胰蛋白酶,北京索萊寶公司;藥用級吐溫-80,上海麥克林公司;DLM-10tc DMSO-d6,美國CIL公司。

T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶;4-16K冷凍離心機;圓盤削片機;6700型紅外光譜(FT-IR)儀,美國Thermo Fisher Nicolet公司;YM50立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海三申醫(yī)療器械有限公司;HPLC-20AT高效液相色譜(HPLC)儀,日本Shimadzu公司;NanoQuant Infinite M200pro酶標(biāo)儀,瑞士TECAN公司;UV 230Ⅱ型紫外可見檢測器,大連依利特分析儀器公司;C-615中壓液相制備色譜、BOROSILIKAT 3.3 CODE NO.17982和NO.28139分離柱,瑞士Buchi公司;XDS-1E倒置生物顯微鏡,上海比目儀器有限公司;Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(75～150 μm),上海如吉生物科技有限公司。

1.2 銀杏硫酸鹽木質(zhì)素(KL)與銀杏磨木木質(zhì)素(MWL)的提取及表征

1.2.1KL的提取 利用圓盤削片機將銀杏木材削片,取1 kg銀杏木片(以絕干計),采用硫酸鹽法制漿對銀杏木片進行蒸煮,硫化度27%,用堿量(以Na2O計)20%,固液比1∶5(g∶mL),蒸煮完成后過濾出制漿黑液,磁力攪拌條件下用體積分?jǐn)?shù)10%的鹽酸逐滴酸化黑液至pH值為2左右,期間將黑液保持溫度為55 ℃左右,靜置分層1 h后過濾,用含HCl的pH值為3的酸性水洗滌多次,真空干燥得到KL。

1.2.2MWL的提取 銀杏木片風(fēng)干處理后,用植物研磨粉粹機粉碎,取粒徑為0.42～0.63 mm的木粉,苯醇抽提6～8 h,真空干燥2周后,經(jīng)水冷式振動球磨機球磨72 h,按照Bj?rkman[14]方法提取得到MWL。

1.2.3FT-IR分析 木質(zhì)素紅外光譜制樣采用溴化鉀壓片法,取2 mg木質(zhì)素樣品與100 mg無水KBr在瑪瑙研缽中混合均勻,將其充分研磨后均勻地平鋪在壓片模具內(nèi),在18 MPa壓力下壓片2.5 min,采用紅外光譜儀檢測樣品在4 000～500 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的紅外光譜圖,分辨率為2 cm-1。

1.3 KL的分級及產(chǎn)物表征

1.3.1KL的分級 將KL用濾紙包好后放入索氏抽提器,用正己烷抽提6 h,將抽出物減壓蒸干后得到組分LC1。再用乙醚對殘渣進行抽提,得到組分LC2。依次用乙酸乙酯、二氧六環(huán)對殘渣繼續(xù)進行抽提,分別得到組分LC3和LC4。

1.3.2相對分子質(zhì)量的測定 各分級組分的相對分子質(zhì)量通過體積排阻色譜法測定。以EasiVial PS-M為標(biāo)準(zhǔn)品,繪制相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線。將1 mg分級組分溶于1 mL色譜純的DMF中,通過0.22 μm微孔濾膜過濾,然后注入HPLC儀測定相對分子質(zhì)量。具體的儀器參數(shù)為Styrage HR 4E色譜柱(300 mm×7.8 mm),Styrage保護柱(30 mm×4.6 mm),RID-10A示差折光檢測器,流動相為DMF(含0.1 mol/L的LiCl),流速1.0 mL/min,柱溫50 ℃,進樣量20 μL。

1.3.3總酚含量(TPC)的測定 各分級組分的總酚含量測定采用Folin-Ciocalteu比色法[15]。首先配制125～1 000 mg/L質(zhì)量濃度梯度的沒食子酸甲醇溶液,取100 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入500 μL Folin-Ciocalteu試劑和6 mL蒸餾水后充分振蕩1 min,在0.5～8 min內(nèi)加入2 mL 15% Na2CO3溶液,再次振蕩0.5 min,最后補充蒸餾水至10 mL。室溫避光靜置2 h后用紫外可見分光光度計測定760 nm(25℃)下的吸光度,繪制沒食子酸質(zhì)量濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照相同的方法測定所有樣品溶液還原Folin-Ciocalteu試劑后在760 nm(25 ℃)下的吸光度,每個數(shù)據(jù)點重復(fù)測量3次,控制吸光度在0.2～0.7之間,根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的結(jié)果,按照式(1)計算樣品的總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)(wTPC):

wTPC=C×V×N/m×100%

(1)

式中:C—從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算得到的沒食子酸質(zhì)量濃度,g/L;V—分級組分的最終體積,mL;N—稀釋倍數(shù);m—樣品質(zhì)量,g。

1.3.4抗腫瘤活性的測定 胰蛋白酶處理對數(shù)生長期細(xì)胞,計數(shù)后稀釋成細(xì)胞懸液(5×104個/mL),在培養(yǎng)箱(37 ℃,5% CO2)中培養(yǎng)16～48 h,培養(yǎng)瓶底層細(xì)胞貼壁后,實驗組加入100 μL不同質(zhì)量濃度(12.5～800 mg/L)的各分級組分樣品,樣品用1 mL CM2-1完全培養(yǎng)液溶解(脂溶性樣品先加入適量的甲醇或丙酮等有機溶劑和0.5%吐溫-80,再補加CM2-1完全培養(yǎng)液至1 mL,稀釋至不同的質(zhì)量濃度),在細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃,5% CO2)中培養(yǎng)48 h后每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L),培養(yǎng)4 h后棄去上清液,每孔中加入150 μL DMSO,放入酶標(biāo)儀中低速搖晃10 min,在490 nm下測定每孔的吸光度(A)。其中,空白組不加入細(xì)胞和樣品,對照組不加入樣品,分別加入與實驗組相同質(zhì)量濃度的溶劑和完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)和測定方法同上。細(xì)胞生長抑制率(η)按式(2)計算,以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo),繪制不同組分樣品對肺癌A549細(xì)胞增殖的抑制率曲線,并用SPSS26軟件擬合計算半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)[16-17]。

η=(A對照-A實驗)/(A對照-A空白)×100%

(2)

1.4 KL乙醚可溶組分(LC2)的分離純化及表征

1.4.1LC2的純化 利用中壓液相制備色譜對銀杏硫酸鹽木質(zhì)素的乙醚抽提物L(fēng)C2進行梯度洗脫純化。固定相為Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(75～150 μm),流動相為氯仿-甲醇混合洗脫液,流速2.5 mL/min,紫外檢測器波長280 nm,用20 mL定量環(huán)濕法進樣。

具體操作為:先將LC2樣品用丙酮溶解,用氯仿-甲醇(50%∶50%)沖洗分離柱,進樣后逐漸增加甲醇的體積分?jǐn)?shù),最后用甲醇完全沖洗分離柱,在分離過程中用紫外可見檢測器檢測物質(zhì)出峰情況。LC2經(jīng)純化后依次得到L1、L2、L3、L4、L5、L6和L7等7個化合物,得率分別為30.38%、23.13%、20.68%、12.80%、6.33%、5.14%和1.54%。

1.4.2HESI-MS分析 通過靜電場軌道肼質(zhì)譜獲取L7的質(zhì)譜信息。該離子源為HESI源,干燥氣體N2,霧化氣壓力4 MPa,輔助氣壓力0.8 MPa,噴霧電壓3 200 V,離子傳輸毛細(xì)管溫度300 ℃,輔助氣溫度280 ℃,掃描方式為負(fù)離子Full MS/dd-MS2,掃描范圍(m/z)為50～750。

1.4.313C NMR分析 將20 mg化合物L(fēng)7溶解在0.6 mL DMSO-d6中,并放入5 mm核磁測試管中,用NMR波譜儀在150.91 Hz下掃描獲得相應(yīng)的13C NMR波譜。測試溫度25℃,脈沖延遲2.0 s,采集時間0.69 s,掃描次數(shù)3 000次。

2 結(jié)果與討論

2.1 分級組分的結(jié)構(gòu)表征

圖1 MWL、KL及分級組分的FT-IR

2.1.2相對分子質(zhì)量測定 銀杏硫酸鹽木質(zhì)素各分級組分的相對分子質(zhì)量見表1。由表1可知,隨著溶劑極性和溶解能力的增大,分級組分的相對分子質(zhì)量也逐漸增加,LC1～LC4的Mw在700～4 800之間,并且組分LC1、LC2和LC3的多分散系數(shù)(PDI)較小,表明利用不同有機溶劑對其進行分級的效果比較好。

表1 各分級組分的相對分子質(zhì)量和總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.1.3總酚含量(TPC)分析 經(jīng)過擬合得到760 nm處沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.958x+0.074,R2=0.981。經(jīng)計算各分級組分相對于沒食子酸的總酚含量見表1。從表1可以明顯看出,各分級組分的總酚含量都隨著相對分子質(zhì)量增大而降低,正己烷可溶組分(LC1)和乙醚可溶組分(LC2)的總酚含量較高。在硫酸鹽法制漿過程中,木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化,由于β-芳基醚鍵的斷裂,硫酸鹽木質(zhì)素中游離酚羥基的含量顯著提高。

2.2 抗腫瘤活性分析

2.2.1分級組分的抗腫瘤活性 銀杏硫酸鹽木質(zhì)素分級組分對肺癌A549細(xì)胞抑制率結(jié)果如圖2(a)所示,其中LC1、LC2、LC3和LC4的IC50值分別為(695.93±9.24)、(366.09±6.39)、(1 366.18±21.90)和(1 605.61±37.93) mg/L。可以明顯看出,各分級組分對于肺癌A549細(xì)胞均有不同程度的抑制作用,并且抑制率與質(zhì)量濃度大致呈對數(shù)函數(shù)關(guān)系。與其他分級組分相比,乙醚可溶組分(LC2)對肺癌A549細(xì)胞的抑制效果最好,IC50值最小。

圖2 分級組分(a)和純化物質(zhì)(b)對肺癌A549細(xì)胞的抑制率

2.2.2LC2組分純化物質(zhì)的抗腫瘤活性 LC2組分純化物質(zhì)對肺癌A549細(xì)胞抑制率結(jié)果如圖2(b)所示,其中L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7的IC50值分別為(446.23±8.03)、(339.74±8.78)、(303.76±7.31)、(188.01±4.66)、(175.86±4.35)、(159.61±3.75)和(89.44±2.13) mg/L。結(jié)果表明:各純化物質(zhì)對于肺癌A549細(xì)胞均有不同程度的抑制作用,并且抑制率與質(zhì)量濃度大致呈對數(shù)關(guān)系。與銀杏硫酸鹽木質(zhì)素分級組分相比,純化物質(zhì)對肺癌A549細(xì)胞的抑制效果顯著增強,這表明經(jīng)過中壓液相制備色譜的純化,能成功分離出木質(zhì)素分級組分中的生物活性物質(zhì)。在所有樣品中,對肺癌A549細(xì)胞的抑制效果較好的是L7,其IC50值為(89.44±2.13) mg/L。根據(jù)美國國家癌癥研究所[19-20]和Geran方案[21]的標(biāo)準(zhǔn),IC50≤20 mg/L為高度細(xì)胞毒性,IC50介于21～200 mg/L為中度細(xì)胞毒性,IC50介于201～500 mg/L 為弱細(xì)胞毒性,以及IC50>501 mg/L 為無細(xì)胞毒性。上述結(jié)果表明:L1～L3對肺癌細(xì)胞具有弱細(xì)胞毒性,L4～L7具有中度細(xì)胞毒性,因此對L7進行進一步研究。

2.3 純化物質(zhì)L7的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1HESI-MS分析 純化物質(zhì)L7的質(zhì)譜信息如圖3所示。m/z409.096處為L7的分子離子峰,L7的分子結(jié)構(gòu)式應(yīng)為C23H22O7。豐度最高為m/z149.061處,來源于香豆?jié)M結(jié)構(gòu)斷裂后產(chǎn)生的碎片峰,證明了G型木質(zhì)素中苯丙烷單體側(cè)鏈上的C-γ與其他位置相比是不穩(wěn)定的,易發(fā)生斷裂。m/z137.061為m/z149.060處C-β進一步斷裂形成的碎片峰。m/z177.055處為松柏醛單體的離子信號峰。m/z353.103處為β-5結(jié)構(gòu)的松柏醛二聚體(β-5,γ-CHO,γ’-CHO)的離子信號峰,m/z409.096處與m/z353.103相差56,表明m/z409.096處為酚羥基上連有2-丙醛取代基的β-5結(jié)構(gòu)的松柏醛二聚體,結(jié)合m/z381.134和395.113處為m/z409.096處的進一步斷裂,證實了m/z409.096處的結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖3 純化物質(zhì)L7的質(zhì)譜

銀杏硫酸鹽木質(zhì)素是在天然木質(zhì)素的基礎(chǔ)上獲取的,醛基是天然木質(zhì)素中常見的結(jié)構(gòu),但是天然木質(zhì)素中酚羥基上連有2-丙醛取代基的β-5結(jié)構(gòu)的松柏醛二聚體比較少見,前人也有類似的發(fā)現(xiàn)[22-23]。在硫酸鹽法制漿過程中,由于木質(zhì)素受堿性氧化,醛基的含量有顯著提高。

2.3.213C NMR分析 來自銀杏硫酸鹽木質(zhì)素的純化物質(zhì)L7的13C NMR譜圖如圖4所示,主要共振信號有:δ199.74(C-10),193.07(C-γ),192.00(C-γ’),152.71(C-α’),149.15(C-3),148.05(C-4),147.91(C-4’),145.13(C-3’),133.39(C-1),129.81(C-1’),129.39(C-5’),127.02(C-β’),121.15(C-6),120.61(C-6’),115.56(C-5),115.42(C-2’),111.73(C-2),88.11(C-α),79.80(C-8),58.65(C-β),56.50(C-7),56.07(C-7’),40.07(DMSO),15.31(C-9)。

以上結(jié)果表明L7為酚羥基上連接著2-丙醛取代基的β-5結(jié)構(gòu)的松柏醛二聚體。

2.4 純化物質(zhì)的構(gòu)效關(guān)系討論

HESI-MS和13C NMR的結(jié)果表明,L7為酚羥基上連接著2-丙醛取代基的β-5結(jié)構(gòu)的松柏醛二聚體,與前人的工作相比這類化合物的抗腫瘤活性在一定程度上有所降低,這可能受苯丙烷結(jié)構(gòu)上醚鍵的影響,這與前人的研究結(jié)果一致[22]。

Zemek等[24]研究了木質(zhì)素模型物的生物活性,發(fā)現(xiàn)在苯環(huán)側(cè)鏈上含有Cα=Cβ,并且Cγ上含有甲基的模型物效果最好,然而,側(cè)鏈上羥基、羰基和羧基的增加都會降低生物活性。葉哲孜等[23]以異丁香酚為原料合成木質(zhì)素脫氫聚合物(DHP),發(fā)現(xiàn)苯丙烷結(jié)構(gòu)側(cè)鏈上醛基的增加會削弱DHP的抗氧化性和抗菌性,而本研究表明L7在側(cè)鏈上含有醛基,具有較好的抗腫瘤活性。這也可能是由于前人研究的物質(zhì)沒有分離到單分子水平,雜質(zhì)造成的誤差比較大;另外前人用的木質(zhì)素原料相對分子質(zhì)量較大,空間位阻較強,導(dǎo)致醛基生物活性被一定程度的屏蔽。

3 結(jié) 論

3.1銀杏木片經(jīng)硫酸鹽法制漿得到硫酸鹽木質(zhì)素(KL),FT-IR的分析結(jié)果表明KL和銀杏磨木木質(zhì)素(MWL)在結(jié)構(gòu)上比較相似,均屬于G型木質(zhì)素。

3.2銀杏硫酸鹽木質(zhì)素用不同極性溶劑分級,得到正己烷可溶組分(LC1)、乙醚可溶組分(LC2)、乙酸乙酯可溶組分(LC3)和二氧六環(huán)可溶組分(LC4)。生物活性實驗表明:在上述組分中,乙醚可溶組分(LC2)對肺癌A549細(xì)胞的抑制作用最強,IC50值為(366.09±6.39) mg/L。

3.3用中壓液相色譜對組分LC2進一步分離純化,得到L1～L7這7個化合物。其中化合物L(fēng)7的抗腫瘤活性最好,對肺癌A549細(xì)胞的IC50值為(89.44±2.13) mg/L。HESI-MS測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)L7是酚羥基上連接著2-丙醛取代基的β-5結(jié)構(gòu)的松柏醛二聚體。13C NMR的分析結(jié)果進一步證實了化合物L(fēng)7的結(jié)構(gòu)。通過分析化合物L(fēng)7的結(jié)構(gòu)和抗腫瘤活性的構(gòu)效關(guān)系,發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素中小分子物質(zhì)的苯丙烷結(jié)構(gòu)單元側(cè)鏈上醛基的增加會提高其抗癌活性,但是醚鍵的增加會降低其抗癌活性。