肖琪 樊慧杰 李艷榮 范麗珊 和璐璐 謝良騏 賈璐 王青 肖保國(guó) 馬存根 柴智

(1山西中醫(yī)藥大學(xué)多發(fā)性硬化益氣活血重點(diǎn)研究室 神經(jīng)生物學(xué)研究中心,山西 晉中 030619;2山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;3復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所)

帕金森病(PD)是常見的神經(jīng)退行性疾病之一,主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)障礙,伴有主要運(yùn)動(dòng)癥狀,如運(yùn)動(dòng)遲緩、僵直性和靜息性震顫,還可能表現(xiàn)為多種非運(yùn)動(dòng)癥狀,如自主神經(jīng)功能障礙、認(rèn)知障礙、睡眠障礙和神經(jīng)精神癥狀〔1〕。其特征是黑質(zhì)致密部(SNpc)中含有神經(jīng)黑色素的多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性缺失〔2〕。研究表明,在工業(yè)化國(guó)家,60歲以上人群的發(fā)病率為1%,80歲以上人群的發(fā)病率為3%以上〔3,4〕。5%～10%的PD患者有孟德爾遺傳的單基因變異,其余的90%～95%是原因不明散發(fā)性變異〔5〕。Parkin基因(PARK2)突變是常染色體隱性PD最常見的病因,占早發(fā)性PD(EOPD)的50%〔6〕。Parkin是一種多效性神經(jīng)保護(hù)蛋白,參與調(diào)控細(xì)胞周期、線粒體動(dòng)態(tài)平衡和能量代謝等細(xì)胞進(jìn)程〔7〕。PD組織學(xué)特征為路易小體的神經(jīng)元內(nèi)嗜酸性蛋白內(nèi)含物,α-突觸核蛋白(syn)是路易小體的主要成分〔8〕。本文圍繞PARK2介導(dǎo)的PD中Parkin與α-syn在翻譯后修飾、tau病理和微聚物的形成、細(xì)胞凋亡等4個(gè)方面的作用及一些PARK2患者死后的神經(jīng)病理學(xué)檢查進(jìn)行綜述。

1 Parkin

PARK2的基因編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物為Parkin,由12個(gè)外顯子和465個(gè)氨基酸組成〔9〕。Parkin的功能喪失突變是家族性PD的主要遺傳原因。PARK2基因突變導(dǎo)致PD的常染色體隱性形式,是EOPD最常見原因。在EOPD相關(guān)基因的篩查中對(duì)基因位點(diǎn)6q25的鑒定發(fā)現(xiàn),2～27位點(diǎn)負(fù)責(zé)EOPD,之后的研究中,確定了其編碼為Parkin的新基因PARK2〔10〕。Parkin作為E3-泛素連接酶發(fā)揮作用,維持泛素蛋白酶體系統(tǒng)清除錯(cuò)誤折疊和聚集的蛋白質(zhì),調(diào)節(jié)線粒體自噬以防止線粒體功能障礙,并以直接和間接功能防止氧化應(yīng)激〔11～15〕。

在PARK2基因的12個(gè)外顯子中已經(jīng)鑒定出100多個(gè)PD相關(guān)突變,包括錯(cuò)義突變、大染色體缺失和重復(fù)、截?cái)嗤蛔兒蛦?dòng)子突變。PARK2基因的純合和復(fù)合雜合突變是遺傳EOPD的原因。EOPD的臨床特征,如發(fā)病年齡早、伴有晝夜波動(dòng)的PD、對(duì)左旋多巴的良好反應(yīng)、肌張力障礙、反射亢進(jìn)、無癡呆和相對(duì)良性的病程〔16〕。雜合子錯(cuò)義突變可能易患晚發(fā)性PD,類似于散發(fā)性PD,但其如何及是否對(duì)PD的病理生理學(xué)起作用仍不清楚〔17〕。

除了損害Parkin蛋白功能的突變外,翻譯后修飾(PTM),如S-亞硝基化、多巴胺共價(jià)結(jié)合、應(yīng)激激活激酶c-Abl的磷酸化和氧化應(yīng)激已被證明會(huì)損害散發(fā)性PD中Parkin的活性〔18～20〕。PD相關(guān)PARK2突變的攜帶者與散發(fā)性PD患者的臨床癥狀非常相似。PARK2突變相關(guān)的獨(dú)特臨床表現(xiàn)為發(fā)病年齡較小、頻繁的肌張力障礙和反射亢進(jìn),發(fā)病較早但疾病進(jìn)展較慢且病程表現(xiàn)為良性〔21〕。治療上,PARK2介導(dǎo)的PD患者對(duì)左旋多巴治療反應(yīng)良好,但容易出現(xiàn)左旋多巴導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)障礙〔22,23〕。病理上,PARK2介導(dǎo)的PD患者和小鼠模型中顯示SNpc的神經(jīng)元明顯減少,藍(lán)斑神經(jīng)元中度下降〔24,25〕。

2 α-syn

α-syn是一種小的、可溶的140個(gè)氨基酸蛋白,位于突觸前末端,在大腦中高度表達(dá),特別是在一些PD影響的區(qū)域,如海馬、嗅球、SNpc、迷走神經(jīng)背側(cè)運(yùn)動(dòng)核、外側(cè)和內(nèi)側(cè)乳頭核〔26〕。α-syn可以在各種因素下錯(cuò)誤折疊和聚集,包括鈣濃度升高,氧化應(yīng)激,基因突變及與許多其他蛋白質(zhì)的相互作用。隨著PD進(jìn)展,路易小體病理逐漸影響神經(jīng)系統(tǒng)的更多方面。研究發(fā)現(xiàn),錯(cuò)誤折疊和聚集的α-syn可以傳播到相互連接的神經(jīng)元,導(dǎo)致內(nèi)源性α-syn的聚集和錯(cuò)誤折疊,如朊病毒蛋白〔27〕。

PD發(fā)病機(jī)制中的α-syn毒性相關(guān)的多種功能失調(diào)途徑有功能失調(diào)的突觸小泡運(yùn)輸、線粒體功能受損、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體功能缺陷、自噬溶酶體途徑缺陷和核功能障礙〔28〕。與野生型α-syn相比,α-syn和PTM,如絲氨酸(pSer)129α-syn的PD相關(guān)突變及氧化應(yīng)激增加了其核定位〔29〕。在核內(nèi),α-syn在PD患者體內(nèi)、體外和腦組織中均能結(jié)合線粒體生物發(fā)生的標(biāo)志物過氧化物酶體增殖物激活受體γ激活因子(PGC)1α啟動(dòng)子,導(dǎo)致PGC1α啟動(dòng)子活性降低,PGC1α mRNA和蛋白質(zhì)水平降低〔30〕。因此,α-syn的核定位可能導(dǎo)致線粒體功能障礙,是PD的主要標(biāo)志之一,并損害其他可能導(dǎo)致PD發(fā)病的途徑。研究發(fā)現(xiàn),外源性α-syn導(dǎo)致Parkin依賴性線粒體自噬機(jī)制紊亂,使有缺陷的線粒體積累,并且Parkin的過度表達(dá)改善了α-syn寡聚物引起的線粒體功能障礙〔31〕。

3 Parkin對(duì)α-syn功能的作用

3.1Parkin影響α-syn的翻譯后修飾 如圖1所示,α-syn經(jīng)歷廣泛的PTM,包括磷酸化、泛素化、截?cái)嗪拖趸?其中許多已經(jīng)在路易小體中鑒定出來,這表明這些修飾可能是必要的,并且在α-syn聚集和神經(jīng)毒性中起重要作用〔32〕。有研究〔33〕指出,Parkin功能的喪失延緩了α-synA30P突變(hA30Pα-syn)轉(zhuǎn)基因小鼠的感覺運(yùn)動(dòng)障礙,略微改善了PD終末期神經(jīng)病理學(xué)表現(xiàn)。hA30Pα-syn小鼠的主要神經(jīng)病理學(xué)特征為含有原纖維α-syn的神經(jīng)元沉積物在S129處磷酸化(PS129α-syn),PS129在D135處截?cái)唳?syn,表明了Parkin功能喪失使PS129α-syn經(jīng)歷了PTM。研究發(fā)現(xiàn),α-syn的pSer129磷酸化與PD多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞死亡有關(guān)〔34〕。PP2A和polo樣激酶(PLK)2是pSer129α-syn的主要調(diào)節(jié)因子。含有B55的蛋白磷酶(PP2)A亞型已被證明是使pSer129α-syn去磷酸化的主要酶〔35〕。研究表明,Parkin的表達(dá)減弱了細(xì)胞死亡和炎癥,降低了PLK2和糖原合成激酶(GSK)3β水平,增加了PP2A表達(dá),導(dǎo)致pSer129α-syn和磷酸化tau水平降低,防止蛋白質(zhì)聚集和神經(jīng)原纖維纏結(jié),表明了Parkin對(duì)抗α-syn毒性和tau過度磷酸化的重要生理功能〔33〕。研究發(fā)現(xiàn),單胺氧化酶(MAO)-B的過表達(dá)導(dǎo)致α-synTyr39的3-硝基酪氨酸增加氧化應(yīng)激(OS),導(dǎo)致其寡聚化。Parkin抑制MAO-B的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),Parkin缺失時(shí),MAO-B的轉(zhuǎn)錄增加并相應(yīng)地增加OS,而野生型Parkin慢病毒介導(dǎo)的表達(dá)能夠降低MAO-B表達(dá)和活性〔36〕,表明Parkin通過降低MAO-B活性以防止α-syn發(fā)生硝化、寡聚化和氧化應(yīng)激,并減少Tyr39硝化α-syn和低聚物的形成。

圖1 Parkin影響α-syn的翻譯和修飾

3.2Parkin在α-syn介導(dǎo)的tau病理中作用 路易小體中聚集的α-syn是PD的神經(jīng)病理學(xué)標(biāo)志,而神經(jīng)原纖維纏結(jié)中聚集的微管相關(guān)tau是阿爾茨海默病和額顳葉癡呆的共同特征〔37〕。研究表明α-syn刺激位于微管結(jié)合區(qū)的tau蛋白激酶(PK)A介導(dǎo)的Ser262磷酸化,導(dǎo)致微管失穩(wěn)和神經(jīng)毒性。此外,使用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)的細(xì)胞模型顯示,α-syn的水平對(duì)磷酸化Ser262的數(shù)量至關(guān)重要〔36〕。特別是GSK3β已被證明是以α-syn依賴性方式在殘基Ser262,Ser396和Ser404處tau中過度磷酸化的關(guān)鍵蛋白。GSK3β酪氨酸(Tyr)216依賴性磷酸化是其激活所必需的〔38〕。PARK2介導(dǎo)的PD中Parkin蛋白通過減少激活相關(guān)Tyr216處GSK3β的磷酸化,從而抑制Ser262,Ser396和Ser404處tau過度磷酸化。Parkin對(duì)PP2A的激活也會(huì)引起tau的去磷酸化,見圖2。α-syn、tau、GSK3β、PP2A、PLK2和Parkin之間存在聯(lián)系,是PARK2介導(dǎo)的PD的潛在疾病機(jī)制,證明了Parkin在α-syn和tau病理學(xué)在神經(jīng)保護(hù)中的重要作用〔36〕。Parkin及其神經(jīng)保護(hù)功能在PARK2介導(dǎo)的PD中的喪失可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊,積累和聚集。

圖2 Parkin影響α-syn介導(dǎo)的tau病理

3.3Parkin功能障礙導(dǎo)致α-syn微聚體形成 Parkin作為E3-泛素連接酶的關(guān)鍵作用是通過蛋白酶體或自噬系統(tǒng)介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解,表明Parkin在清除聚集和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)方面具有重要功能。蛋白酶體系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)〔如α-syn、tau和β-淀粉樣蛋白(Aβ)〕積累和聚集的功能失調(diào)可能與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生有關(guān)〔39〕。研究表明,防止α-syn、tau和Aβ過度表達(dá)及蛋白酶體抑制的保護(hù)作用可以由Parkin介導(dǎo)〔40〕。Parkin過表達(dá)可導(dǎo)致蛋白酶體酶活性增加,減少α-syn路易小體的表達(dá),減輕α-syn導(dǎo)致的毒性〔41〕。這些研究表明了Parkin在增加蛋白酶體系統(tǒng)并降解錯(cuò)誤折疊和聚集的蛋白質(zhì)方面的重要功能。由于路易小體中存在泛素化的α-syn,提示α-syn和Parkin之間的直接相互作用可能是由蛋白酶體系統(tǒng)引起的α-syn降解〔42〕。然而,只有O-糖基化的α-syn被證明是Parkin底物〔43〕。Parkin間接影響α-syn的聚集和積累,可能會(huì)減弱α-syn介導(dǎo)的毒性。研究發(fā)現(xiàn),α-syn過度表達(dá)相關(guān)的毒性,可以通過蛋白酶體抑制來模擬,可以通過Parkin的過度表達(dá)來減輕〔44〕。如表1所示,在17篇〔45～61〕PARK2患者尸檢腦切片報(bào)告病例中發(fā)現(xiàn),其中15篇〔45,46,48～50,52～61〕為純合子或復(fù)合雜合子,其余2篇〔47,51〕為雜合子。其中8例報(bào)告了路易小體存在〔45～52〕,除1例為嗜堿性路易小體樣包涵體外,其余7例均為典型路易小體。10例路易小體陰性的病例中發(fā)現(xiàn)患者平均發(fā)病年齡為25.5歲,低于7例PARK2相關(guān)病例存在α-syn和路易小體病理學(xué)患者的46.3歲〔53～60〕。2015年,1例秘魯家族EOPD尸檢病例顯示SNpc中有嚴(yán)重的神經(jīng)元丟失,紋狀體中有酪氨酸羥化酶陽(yáng)性纖維丟失,但未觀察到路易小體病理學(xué)和α-syn陽(yáng)性內(nèi)含物,發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)原纖維纏結(jié)〔61〕。在與PARK2介導(dǎo)的PD中與路易小體相關(guān)的文獻(xiàn)中存在以下幾種假設(shè):①在驗(yàn)尸研究中觀察到的路易小體代表了偶然的路易體病理學(xué),因?yàn)樗鼈兘?jīng)常在健康的老年人中發(fā)現(xiàn);②發(fā)病晚期患者的蛋白質(zhì)清除系統(tǒng)發(fā)生功能障礙〔62〕;③一些Parkin突變可能導(dǎo)致殘留的Parkin活性,導(dǎo)致路易小體形成的可能性增加。因此,關(guān)于發(fā)病年齡較小的PARK2患者可能具有更有效的蛋白質(zhì)清除系統(tǒng)或處理異常積累蛋白質(zhì)的不同機(jī)制。因此,死后神經(jīng)病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元丟失和膠質(zhì)增多癥,但沒有路易小體這一現(xiàn)象可能是正常的。

細(xì)胞培養(yǎng)研究表明,Parkin通過路易小體中蛋白質(zhì)的K63連鎖泛素化參與形成凝集體樣包涵體〔63〕。特定的錯(cuò)義突變,例如導(dǎo)致殘留Parkin活性的R275W,會(huì)增加路易小體形成的可能性,而導(dǎo)致Parkin功能完全喪失的外顯子缺失使路易小體難以形成。PTM可加速pSer129從α-syn單體向有毒低聚物和原纖維的轉(zhuǎn)化〔64〕。研究發(fā)現(xiàn),Parkin介導(dǎo)的包涵體形成是一種神經(jīng)保護(hù)作用,可避免α-syn釋放到細(xì)胞外空間,從而防止pSer129α-syn原纖維擴(kuò)散到相互連接的神經(jīng)元〔65〕。Espay等〔66〕提出了作為PD潛在機(jī)制的蛋白質(zhì)聚集的三個(gè)概念框架。首先,α-syn的積累可增強(qiáng)導(dǎo)致神經(jīng)退行性變的其他致病機(jī)制。其次,蛋白質(zhì)聚集體可能是由多種致病機(jī)制引起的副產(chǎn)物,聚集體本身不具有致病和保護(hù)作用。第三,將有毒的可溶性蛋白質(zhì)聚集體隔離成不溶形式可能是一種神經(jīng)保護(hù)機(jī)制方式,可以避免神經(jīng)元和突觸功能障礙,從而延緩神經(jīng)退行性變過程〔67〕。Yang等〔68〕研究了Parkin和α-syn之間可能的功能相互作用,發(fā)現(xiàn)Parkin的共表達(dá)導(dǎo)致A53T衰減,A30P突變?chǔ)?syn毒性減弱。野生型或A30P突變?chǔ)?syn誘導(dǎo)的黑腹果蠅攀爬能力喪失可以通過Parkin的共表達(dá)來抑制〔69〕。在一項(xiàng)使用過度表達(dá)A30P突變?chǔ)?syn轉(zhuǎn)基因Parkin缺失小鼠的研究中發(fā)現(xiàn),Parkin缺乏時(shí)運(yùn)動(dòng)障礙延遲,含有pSer129的神經(jīng)元比例降低〔70〕。研究發(fā)現(xiàn),在rAAV載體介導(dǎo)的人類野生型α-syn過度表達(dá)后,SNpc中多巴胺能神經(jīng)元的丟失和pSer129α-syn比例的增加(總α-syn量沒有變化)沒有差異〔71〕。使用rAAV載體介導(dǎo)的人類野生型α-syn和Parkin在獼猴中的過度表達(dá)也獲得了類似的結(jié)果。Parkin的共表達(dá)導(dǎo)致α-syn聚集減弱,pSer129α-syn數(shù)量減少。研究表明,Parkin過度表達(dá)或Parkin敲除的大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞,減弱了細(xì)胞外α-syn低聚物誘導(dǎo)的毒性〔72〕。盡管PARK2患者的尸檢神經(jīng)病理學(xué)檢查對(duì)于路易小體的病理存在尚不明確,但Parkin和α-syn之間功能性作用的發(fā)現(xiàn)高度一致。Parkin可以調(diào)節(jié)α-syn積累、PTM介導(dǎo)的聚集及減弱α-syn介導(dǎo)的毒性方面等功能,那么可以假設(shè)α-syn聚集導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)微聚集體的形成可能是PARK2介導(dǎo)的PD的一種潛在細(xì)胞內(nèi)致病機(jī)制,該機(jī)制比路易小體的形成更為常見。

表1 PARK2突變的患者的尸檢神經(jīng)病理學(xué)結(jié)果

3.4Parkin影響α-syn對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控 研究發(fā)現(xiàn),PD患者的SNpc中神經(jīng)元丟失時(shí),胱天蛋白酶(caspase)3水平升高,Parkin可以通過抑癌基因(p53)依賴性方式阻止caspase3的活化,導(dǎo)致p53 mRNA和蛋白質(zhì)水平降低〔73〕。因此Parkin作為p53轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮作用,功能喪失的Parkin突變?cè)黾恿藀53表達(dá),促進(jìn)凋亡發(fā)生。在生理?xiàng)l件下,α-syn會(huì)下調(diào)p53,抑制細(xì)胞凋亡,然而在PD中α-syn聚集導(dǎo)致其無法抑制p53,這將增強(qiáng)p53表達(dá),并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔74〕。

α-syn的過表達(dá)以劑量依賴的方式導(dǎo)致核因子(NF)-κB活化減弱,下調(diào)抗凋亡因子B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2表達(dá),上調(diào)GSK3β水平〔75〕。GSK3β通過其調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白Bcl-2、髓系白血病(Mcl)-1及促凋亡蛋白(Bax)來促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔76〕。GSK3β激活已被證明可以在Ser163處上調(diào)和磷酸化Bax,這有助于其線粒體定位〔77,78〕。此外,GSK3β在Ser159處磷酸化Mcl-1,導(dǎo)致其泛素化和降解〔79〕。病理狀態(tài)下,α-syn介導(dǎo)的GSK3β激活導(dǎo)致Bax介導(dǎo)的線粒體膜孔形成增加,并隔離Bcl-2,從而導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中。進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后,與Apaf-1結(jié)合激活前蛋白酶9,進(jìn)而激活下游caspase,啟動(dòng)凋亡過程〔80〕。研究發(fā)現(xiàn),Parkin能夠降低GSK3β的表達(dá)和活性〔81,82〕,由此發(fā)現(xiàn),GSK3β在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)聚集和細(xì)胞凋亡方面起著關(guān)鍵作用,而這種機(jī)制可能是PD患者Parkin功能喪失的核心。因此,PARK2介導(dǎo)的PD中Parkin功能的喪失不僅可能促進(jìn)蛋白質(zhì)聚集,而且可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡并介導(dǎo)細(xì)胞死亡。由上可知,Parkin對(duì)α-syn微聚體的形成具有促進(jìn)作用,所以,當(dāng)Parkin發(fā)生功能障礙時(shí)α-syn聚集,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述,PARK2介導(dǎo)的PD分子機(jī)制是復(fù)雜的,需要更多的研究來了解功能失調(diào)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過程。Parkin功能的喪失可能導(dǎo)致持續(xù)形成有毒物質(zhì)α-syn低聚物和原纖維,破壞許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過程,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Parkin可以防止α-syn發(fā)生硝化、寡聚化和氧化應(yīng)激,這對(duì)研究如何通過調(diào)節(jié)Parkin的功能去更好對(duì)抗α-syn毒性和tau過度磷酸化以治療PD具有重要意義。本文介紹了PARK2介導(dǎo)的PD中微聚體的可能,它們導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的嚴(yán)重喪失,但其中所觀察到路易體并不一定是致命效應(yīng)的中介,可能僅僅是病理過程的產(chǎn)物。PARK2介導(dǎo)的PD中病理性細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過程中Parkin與α-syn相關(guān)的功能失調(diào)途徑的共同點(diǎn)可能是蛋白質(zhì)清除系統(tǒng)受損和蛋白質(zhì)PTM失衡導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和聚集。這對(duì)研究PARK2介導(dǎo)的PD具有重要意義。