李靜 柯錦 嚴偉華

(1武漢市第九醫(yī)院皮膚科,湖北 武漢 430081;2上海市浦東醫(yī)院皮膚科)

皮膚鱗狀細胞癌具有高度侵襲性,其治療以手術(shù)為主,放化療為輔〔1〕。目前,皮膚鱗狀細胞癌發(fā)病機制尚未明確,探究其發(fā)生發(fā)展的分子機制可為其治療提供新靶點。環(huán)狀RNA(circRNA)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(circLRP)6是脂蛋白受體相關(guān)蛋白6基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,屬于環(huán)狀RNA(circRNA)。Zhang等〔2〕研究顯示,circLRP6在口腔鱗狀細胞癌(OSCC)組織中呈高表達,下調(diào)circLRP6可抑制OSCC細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程;Qin等〔3〕研究顯示,circLRP6可海綿吸附miR-330-5p提高核受體結(jié)合蛋白(NRBP)1表達進而促進前列腺癌細胞生長和轉(zhuǎn)移。然而,目前尚不清楚circLRP6對皮膚鱗狀細胞癌進展的影響。StarBase軟件預(yù)測顯示,miR-2116-3p可能是circLRP6的靶基因。miR-2116-3p可靶向抑制Piwi樣RNA介導(dǎo)基因沉默(PIWIL1)表達阻礙結(jié)直腸癌的發(fā)展進程〔4〕。但是,miR-2116-3p能否影響皮膚鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展也還未知。本研究探究circLRP6和miR-2116-3p對皮膚鱗狀細胞生物學(xué)行為的影響。

1 資料與方法

1.1臨床資料 于2018年5月至2020年9月收集在武漢市第九醫(yī)院行手術(shù)治療的皮膚鱗狀細胞癌患者(39例)的癌組織及癌旁組織,液氮保存。男20例,女19例,平均年齡(46.28±7.41)歲。納入標準:首次確診;術(shù)前未進行放、化療等治療。所有患者簽訂知情同意書,研究經(jīng)武漢市第九醫(yī)院倫理委員會審核批準(批準號201803009)。

1.2細胞和主要試劑 A431細胞系,中國科學(xué)院上海細胞庫;聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)實驗相關(guān)試劑(大連寶生物);胎牛血清(浙江天杭);circLRP6小干擾RNA(si-circLRP6)、miR-2116-3p模擬物(mimcs)/抑制劑(anti-miR-2116-3p)及陰性對照(si-NC、miR-NC/anti-miR-NC)、circLRP6野生型(WT)-circLRP6和突變型(MUT)-circLRP6載體、引物序列(上海生工);MMP-2和MMP-9抗體(英國Abcam公司)。

1.3實時熒光定量(qRT)-PCR法檢測circLRP6和miR-2116-3p表達 提取組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA后,行PCR擴增。2-△△Ct法計算circLRP6、miR-2116-3p相對表達量。引物序列:circLRP6:上游5′-GAGTTGGATCAACCCAGAGC-3′、下游5′-TCCTCCAAGCCTCCAACTAC-3′,GAPDH:上游5′-CCCACATGGCCTCCAAGGAGTA-3′、下游5′-GTGTACATGGCAACTGTGAGGAGG-3′,miR-2116-3p:上游5′-AATCCTATGCCAAGAACTCCC-3′、下游5′-CT-CTACAGCTATATTGCCAGCCA-3′,U6:上游5′-CTC-GCTTCGGCAGCACA-3′、下游5′-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3′。

1.4A431細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 用RPMI1640培養(yǎng)液(含10 %胎牛血清的完全培養(yǎng)液)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)A431細胞。取6孔板,加2.5 ml A431細胞懸液(5.0×104個/ml),分為si-circLRP6組、si-NC組、miR-2116-3p組、miR-NC組、si-circLRP6+anti-miR-2116-3p組、si-circLRP6+anti-miR-NC組。轉(zhuǎn)染24 h后,收集各組細胞備用。

1.5CCK-8檢測A431細胞增殖活性 將1.4中各組細胞懸液(5.0×104個/ml)加入96孔板,每孔200 μl,24 h后,加CCK-8 10 μl,反應(yīng)2 h后檢測450 nm處光密度(OD450 nm)值。

1.6克隆形成實驗 6孔板中接種轉(zhuǎn)染后的各組細胞,經(jīng)14 d培養(yǎng)、固定、結(jié)晶紫染色后,計數(shù)克隆數(shù)。

1.7劃痕實驗 于6孔板接種各組細胞,培養(yǎng)24 h,槍頭垂直于孔底劃線,測量劃痕寬度(0 h)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h,再次測量(24 h),計算劃痕愈合率〔(1-24 h/0 h)×100%〕。

1.8Transwell實驗 將各組細胞重懸(5.0×104個/ml),取100 μl懸液加入上室(預(yù)鋪Matrigel),另取500 μl培養(yǎng)液(含血清)添加至下室。24 h將細胞固定、結(jié)晶紫染色。顯微鏡下計數(shù)。

1.9Western印跡法測MMP-2、MMP-9蛋白表達 提取細胞總蛋白,定量蛋白濃度后,將蛋白樣本進行凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)膜,將膜封閉1 h后,4 ℃下與一抗MMP-2、MMP-9、GAPDH(均1∶1 000)孵育24 h,再與二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。顯影、曝光,分析蛋白表達。

1.10雙熒光素酶實驗 于6孔板中接種A431細胞,共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circLRP6(或MUT-circLRP6)與miR-2116-3p mimics(或miR-NC)。轉(zhuǎn)染24 h后,檢測熒光素酶活性。

1.11統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1皮膚鱗狀細胞癌組織中circLRP6和miR-2116-3p表達 皮膚鱗狀細胞癌組織中circLRP6表達量明顯高于癌旁組織(4.30±0.41 vs 1.00±0.07;t=49.548,P<0.05),miR-2116-3p表達量(0.30±0.04)明顯低于癌旁組織(1.00±0.06;t=60.622,P<0.05)。

2.2下調(diào)circLRP6對A431細胞表型的影響 si-circLRP6組A431細胞中circLRP6表達量(0.29±0.03)顯著低于si-NC組(1.00±0.00;t=59.000,P<0.05)。si-circLRP6組細胞增殖、克隆形成數(shù)、遷移、侵襲能力和MMP-2、MMP-9蛋白水平較si-NC組明顯下降(P<0.05)。見圖1、圖2、表1、圖3。

2.3過表達miR-2116-3p對A431細胞生物學(xué)行為的影響 與miR-NC組(1.00±0.00)相比,miR-2116-3p組miR-2116-3p表達量(2.55±0.22)明顯升高(t=21.136,P<0.05)。miR-2116-3p組細胞增殖、克隆形成數(shù)、遷移、侵襲能力和MMP-2、MMP-9蛋白較miR-NC組明顯下降(P<0.05)。見圖1、圖2、表1、圖3。

2.4抑制miR-2116-3p逆轉(zhuǎn)敲低circLRP6對A431細胞的作用 si-circLRP6+anti-miR-2116-3p組miR-2116-3p表達量較si-circLRP6+anti-miR-NC組明顯降低(0.43±0.04 vs 1.00±0.00;t=42.750,P<0.05)。si-circLRP6+anti-miR-2116-3p組細胞增殖、克隆形成數(shù)、遷移、侵襲能力和MMP-2、MMP-9蛋白水平較si-circLRP6+anti-miR-NC組明顯上調(diào)(P<0.05)。見圖1、圖2、表1、圖3。

圖1 各組細胞克隆數(shù)(結(jié)晶紫染色)

圖2 各組細胞遷移(×100)、侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

表1 各組A431細胞增殖、克隆形成數(shù)、遷移、侵襲細胞數(shù)、MMP-2、MMP-9表達比較

2.5circLRP6靶向調(diào)控miR-2116-3p StarBase數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)circLRP6與miR-2116-3p有結(jié)合位點,見圖4。WT-circLRP6+miR-2116-3p mimics組熒光素酶活性明顯低于WT-circLRP6+miR-NC組(0.53±0.05 vs 1.02±0.06;t=18.821,P<0.05);MUT-circLRP6+miR-2116-3p mimics組與MUT-circLRP6+miR-NC組熒光素酶活性無明顯差異(1.00±0.06 vs 1.03±0.08;t=0.900,P=0.381)。此外,si-circLRP6組miR-2116-3p表達量較si-NC組明顯升高(2.83±0.24 vs 1.00±0.00;t=22.875,P<0.05)。

1～6:si-NC組、si-circLRP6組、miR-NC組、miR-2116-3p組、si-circLRP6+anti-miR-NC組、si-circLRP6+anti-miR-2116-3p組圖3 Western印跡檢測各組MMP-2和MMP-9蛋白表達

圖4 circLRP6與miR-2116-3p結(jié)合位點

3 討 論

circRNA是一種非編碼RNA,呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu),具有良好的穩(wěn)定性。隨著對circRNA研究的深入,發(fā)現(xiàn)circRNA在肝癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中呈異常表達,并參與癌癥進展〔5～7〕。文獻表明,多種circRNA參與皮膚鱗狀細胞癌的發(fā)展進程。例如,circ_001937、circ_0067772、circ RNA核糖核蛋白(circ-LARP)1B在皮膚鱗狀細胞癌中表達增加,可分別靶向miR-597-3p/FOS樣抗原(FOSL)2、miR-1238-3p/叉頭框蛋白(FOX)G1、miR-515-5p/爪蟾驅(qū)動蛋白樣蛋白2靶蛋白(TPX2)軸促進皮膚鱗狀細胞癌的發(fā)展進程,為該腫瘤的治療提供了分子靶點〔8～10〕。

研究表明,circLRP6在骨肉瘤組織中表達增加,敲減circLRP6抑制了骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲,circLRP6作為致癌基因促進骨肉瘤的發(fā)展進程〔11〕;circLRP6在食管鱗癌(ESCC)組織中表達上調(diào),敲減circLRP6可通過靶向miR-182/Myc軸降低ESCC細胞的活力、集落形成和侵襲,circLRP6可作為ESCC治療的分子靶點〔12,13〕。本研究提示,下調(diào)circLRP6可抑制皮膚鱗狀細胞癌細胞惡性表型。

研究顯示,miR-2116-3p可靶向抑制Myc抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移能力及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,并誘導(dǎo)細胞凋亡,miR-2116-3p在乳腺癌中起抑癌基因作用〔14〕。本研究結(jié)果表明,miR-2116-3p可作為皮膚鱗狀細胞癌的抑癌基因。此外,敲低circLRP6可升高miR-2116-3p表達,雙熒光酶實驗證實circLRP6與miR-2116-3p存在靶向關(guān)系;下調(diào)miR-2116-3p逆轉(zhuǎn)了敲低circLRP6對A431細胞的影響,這提示circLRP6通過競爭性吸附miR-2116-3p來影響皮膚鱗狀細胞癌進展。

綜上,circLRP6可能通過競爭性吸附miR-2116-3p來影響皮膚鱗狀細胞癌細胞的惡性行為。但circLRP6/miR-2116-3p的下游靶基因仍需進一步分析,且尚需體內(nèi)實驗對circLRP6/miR-2116-3p調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行驗證。