譚培勇 胡廣

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科,貴州 貴陽(yáng) 550002)

脊髓損傷是由脊柱骨折后脊椎移位或者是碎骨片突出所導(dǎo)致,其原因多為直接暴力、間接暴力導(dǎo)致〔1,2〕。有研究發(fā)現(xiàn),脊髓損傷與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NT)和脊髓改善緊密相關(guān)〔3〕。另有研究表明,電針是中醫(yī)藥領(lǐng)域的治療方法,可促進(jìn)受損脊髓分泌內(nèi)源性NT,可使脊髓功能恢復(fù)〔4〕。腦源性NT(BDNF)可以促進(jìn)損傷神經(jīng)元修復(fù),利于神經(jīng)環(huán)路重建〔5〕。NT-3廣泛存在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),具有調(diào)控神經(jīng)發(fā)育的作用〔6〕。本研究探究電針治療對(duì)脊髓損傷大鼠模型神經(jīng)功能的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1研究動(dòng)物 選取50只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組10只、其余40只大鼠參照白春宏等〔7〕研究建立脊髓損傷模型作為脊髓損傷模型組,空白對(duì)照組給予普通飼料正常喂養(yǎng),不進(jìn)行針?biāo)幪幚?脊髓損傷模型組給予高脂飼料(脂肪30%,蛋白質(zhì)20%,碳水化合物50%)喂養(yǎng),不施加針?biāo)幱绊?喂養(yǎng)1 w后每組隨機(jī)抽樣2只,取脊髓組織蘇木素-伊紅(HE)染色,發(fā)現(xiàn)脊髓組織神經(jīng)元缺失,結(jié)構(gòu)不清晰為建模成功。建模成功后將脊髓損傷模型組38只大鼠分為模型組(13只)、甲潑尼松龍組(12只)、電針組(13只)。

1.2給藥干預(yù) 給予上述處理1 w后,于第2周開(kāi)始給藥。甲潑尼松龍組給予甲潑尼松龍藥液灌胃,2次/d,2 ml/次。電針組給予電針治療,取相當(dāng)于人體的“大椎”“命門”、與損傷平面上下棘突旁的“夾脊穴”垂直進(jìn)針4～5 mm,電流強(qiáng)度為1～3 mA,頻率2 Hz,連續(xù)波,1次/d,20 min/次,以上各組均連續(xù)治療1 w。

1.3病理形態(tài)學(xué)觀察 采血后取脊髓組織進(jìn)行脫水、透明、包埋、制備橫切面石蠟切片,做HE染色,觀察光鏡下脊髓組織的病理變化。

1.4BDNF、NT-3 取大鼠脊髓組織,采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)BDNF、NT-3,石蠟組織切片脫蠟至水、修復(fù)、冷卻;經(jīng)過(guò)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后,采用30%的Triton X-100溶液浸泡10 min,室溫封閉1 h,加入(1∶200)的BDNF、NT-3,4 ℃過(guò)夜,PBS洗滌后避光加入Alexa Fluor488熒光二抗,37 ℃孵育1 h,PBS洗滌,顯微鏡下觀察,采用ImageJ軟件識(shí)別視野中的BDNF、NT-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),試劑由Abcam提供(批號(hào):ab108319、ab7484)重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次。以GAPDH為內(nèi)參照,定量分析蛋白表達(dá)情況。采用2-△△Ct方法計(jì)算出BDNF表達(dá)量,BDNF上游引物:5′-GGACCCTGAGTTCCACCA-3′,下游:5′-CAAAAGTGTCAGCCAGGGA-3′;NT-3上游引物:5′-GCGAGACTGAATGACCGAACT-3′,下游:5′-GCCA-CGGAGATAAGCAAGAAA-3′。內(nèi)參GAPDH上游引物:5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′,下游:5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。

1.5脊髓損傷的行為學(xué)評(píng)分(BBB) 采用BBB〔8〕評(píng)價(jià)大鼠后肢功能情況,由熟悉本實(shí)驗(yàn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的人員進(jìn)行評(píng)價(jià),至少兩人,每組動(dòng)物于造模后每天一次評(píng)分,評(píng)分觀察期4 min,每只動(dòng)物取兩后肢平均值。

1.6絲裂原激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(MEK)2、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(P-ERK)1 通過(guò)Western印跡對(duì)脊髓組織中的MEK2/P-ERK1信號(hào)通路蛋白MEK2、P-ERK1表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),取受損脊髓組織研磨,取蛋白,采用Bradford法檢測(cè)蛋白含量,經(jīng)過(guò)凝膠電泳分離,將蛋白移至聚偏氟乙烯(PVDF)印跡膜上。加入5%TBS-T脫脂奶粉封閉,加入適當(dāng)?shù)目贵w,4 ℃過(guò)夜,洗膜3次,每次10 min,將PVDF膜放置電化學(xué)發(fā)光(ECL)混合液孵育5 min,用IPP軟件對(duì)掃描蛋白圖像進(jìn)行分析,重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1脊髓損傷模型判定 造模后病理切片顯示,空白對(duì)照組脊髓神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰、排列緊密;脊髓損傷模型組脊髓神經(jīng)元缺失較為明顯,結(jié)構(gòu)不清晰。見(jiàn)圖1。

圖1 兩組脊髓形態(tài)病理切片(HE染色,×200)

2.2病理特征比較 空白對(duì)照組脊髓神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰、排列緊密;模型組脊髓神經(jīng)元缺失明顯,結(jié)構(gòu)不清晰;甲潑尼松龍組脊髓神經(jīng)元數(shù)目比模型組增多,結(jié)構(gòu)較為清晰;電針組神經(jīng)元排列整齊,結(jié)構(gòu)清晰。見(jiàn)圖2。

圖2 各組脊髓形態(tài)病理特征比較(HE染色,×400)

2.3各組脊髓組織MEK2、P-ERK1相對(duì)蛋白表達(dá)量對(duì)比 與空白對(duì)照組相比,模型組、甲潑尼松龍組、電針組MEK2、P-ERK1明顯降低(P<0.05);與模型組相比,甲潑尼松龍組、電針組MEK2、P-ERK1明顯升高(P<0.05);與甲潑尼松龍組相比,電針組MEK2、P-ERK1明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表1。

2.4各組BDNF、NT-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較 與空白對(duì)照組相比,模型組、甲潑尼松龍組、電針組BDNF、NT-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05);與模型組相比,甲潑尼松龍組、電針組BDNF、NT-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯升高(P<0.05);與甲潑尼松龍組相比,電針組BDNF、NT-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.5各組BBB比較 與空白對(duì)照組相比,模型組、甲潑尼松龍組、電針組BBB明顯降低(P<0.05);與模型組相比,甲潑尼松龍組、電針組BBB明顯升高(P<0.05);與甲潑尼松龍組相比,電針組BBB明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

1～4:空白對(duì)照組、模型組、甲潑尼松龍組、電針組圖3 Western印跡檢測(cè)各組脊髓組織MEK2/P-ERK1通路蛋白表達(dá)

表1 各組BDNF、NT-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、BBB、MEK2、P-ERK1蛋白表達(dá)比較

3 討 論

脊髓和腦組織一樣有可塑性,脊髓損傷臨床主要癥狀有肢體運(yùn)動(dòng)、大小便功能障礙等〔9,10〕。全球發(fā)病率較高,致殘率較高,發(fā)病突然,嚴(yán)重威脅患者的生命健康。脊髓損傷在中醫(yī)學(xué)屬于外傷淤血導(dǎo)致“痿證”“腰痛”等范疇〔11〕。

脊髓損傷后氣血虧虛、經(jīng)脈阻滯、肌肉痿廢,與“痿證”相契合,“痿證”指肢體筋脈弛緩,軟弱無(wú)力的一種病癥〔12〕。其病因不外乎兩種,外傷者與外力撞擊者導(dǎo)致經(jīng)絡(luò)血脈離斷,如《血證論》曰:“痿者,足廢不能行之謂”。電針是中醫(yī)藥領(lǐng)域中的重要方法,可用于脊髓損傷的治療,從穴位角度而言,每個(gè)穴位都是從淺到深,會(huì)涉及皮膚、血管等,會(huì)伴有相應(yīng)的神經(jīng)系統(tǒng)。電針是在普通針柄處連接電針治療儀,將電刺激與針刺結(jié)合增加刺激的力度,電針對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用,可以修復(fù)受損神經(jīng),且電針形成的電磁場(chǎng)又可強(qiáng)化夾脊針的作用〔13,14〕。

NT在體內(nèi)和離體時(shí)均可維持損傷脊髓神經(jīng)細(xì)胞。BDNF有促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)的作用,是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)NT,可增加維持損傷部位細(xì)胞的存活〔15〕。NT-3分布于脊髓、背根節(jié)、大腦皮質(zhì)、海馬等區(qū)域,可以和單跨膜細(xì)胞表面糖基化受體相結(jié)合成原肌球蛋白受體激酶(Trk)C,通過(guò)其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)〔16〕。有研究表明,脊髓中TrkC過(guò)表達(dá)能提高神經(jīng)前體細(xì)胞存活率〔17〕。本研究結(jié)果提示,電針可以促進(jìn)脊髓損傷大鼠的神經(jīng)功能、運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

細(xì)胞外信號(hào)通路系統(tǒng)在脊髓損傷中有關(guān)鍵作用,ERK是MAPK超家族中的一員,MEK/ERK信號(hào)通路是將細(xì)胞外刺激信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞的重要通路,活化MEK可以激活ERK,ERK是MEK磷酸化的觸點(diǎn),參與了多種疾病〔18〕。ERK是一種Ser/Thr蛋白激酶,位于胞質(zhì)中,激活后轉(zhuǎn)移至胞核,ERK1可以增強(qiáng)依賴ERK2信號(hào),促進(jìn)細(xì)胞的增殖,ERK1/2活化有促進(jìn)神經(jīng)再生的作用〔19〕。MEK2、P-ERK1在促進(jìn)細(xì)胞增殖中起重要作用,參與了脊髓損傷修復(fù)的過(guò)程〔20,21〕。本研究結(jié)果表明,MEK2/P-ERK1信號(hào)通路與脊髓損傷的發(fā)展密切相關(guān),但目前未有研究將其用于脊髓損傷的研究中,因此上述研究需后續(xù)研究進(jìn)一步分析驗(yàn)證。

綜上,脊髓損傷發(fā)生后伴隨著神經(jīng)功能損傷、肢體運(yùn)動(dòng)障礙等現(xiàn)象,經(jīng)過(guò)電針治療后可以促進(jìn)脊髓損傷大鼠的神經(jīng)功能、運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù),其機(jī)制可能與MEK2/P-ERK1信號(hào)通路被抑制有關(guān)。