李啟義 張江濤 常守亞

(河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院),河南 洛陽(yáng) 471000)

骨折裂性病變,通常是由于外力作用或內(nèi)部病理因素導(dǎo)致〔1〕。據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)每年有近千萬(wàn)人因不同原因發(fā)生骨折,其中骨折延遲愈合或不愈合情況是影響骨折患者功能康復(fù)的主要因素〔2〕。血液流變學(xué)對(duì)維持正常的血液循環(huán)和組織灌注具有重要意義,研究發(fā)現(xiàn)在骨折愈合過程中,血液流變學(xué)因素的改變可能會(huì)影響血液流動(dòng)和組織的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng),從而影響骨折愈合的速度和質(zhì)量〔3〕。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),多種生長(zhǎng)因子在創(chuàng)口愈合、骨折愈合過程中起重要作用,如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1,其在細(xì)胞增殖及分化方面扮演著重要角色,同時(shí)對(duì)骨折修復(fù)的啟動(dòng)、調(diào)控、發(fā)育及塑形均有重要作用〔4〕。目前臨床上治療骨折除西醫(yī)治療外,中醫(yī)治療也是常用方法,且近年來(lái)隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展,中醫(yī)治療也在不斷更新和發(fā)展,其在臨床上取得了良好的效果,因此中藥加速骨折愈合方面已經(jīng)成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)〔5〕。益氣活血通絡(luò)湯是中醫(yī)傳統(tǒng)制劑,主要以黃芪、黨參為君藥,以當(dāng)歸、丹參、川芎為臣藥,在諸藥的共同作用下,共奏活血化瘀、益氣固表、舒經(jīng)活絡(luò)、祛風(fēng)培正、調(diào)和氣血之功效,故其對(duì)骨折愈合當(dāng)有奇效〔6〕。而低分子肝素Ⅲ主要治療預(yù)防血栓性栓塞性疾病,但有研究表明其與中藥聯(lián)用,抗凝、抗血栓、擴(kuò)張血管及增加血流等作用會(huì)形成疊加,對(duì)骨折形成的深靜脈具有顯著療效,且不易并發(fā)出血〔7〕。本文探討益氣活血通絡(luò)湯與低分子肝素抗凝對(duì)大鼠骨折愈合、血液流變學(xué)及TGF-β1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物材料 選取溫州清江生物科技有限公司提供的60只SPF級(jí)SD雄性大鼠〔合格證書為:SCXK(浙)2019-0037〕,體質(zhì)量205～255 g,飼養(yǎng)條件:23～26 ℃,相對(duì)濕度44%～73%,噪音<85 dB,提供充足日常飲水和食物,按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2實(shí)驗(yàn)材料 克氏針(貨號(hào):02jh2,新鄉(xiāng)市金環(huán)有限公司);骨鉗(貨號(hào):guj,南京卡爾文有限公司);益氣活血通絡(luò)湯(由本院中醫(yī)部自制);低分子肝素鈣(貨號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H20060191,深圳賽保爾有限公司);蘇木素染液(貨號(hào):RT-S004,北京興怡雅創(chuàng)有限公司);伊紅染液(貨號(hào):E301879-500ml,上海阿拉丁股份有限公司);光學(xué)顯微鏡(型號(hào):CX23,美國(guó)奧林巴斯公司);全自動(dòng)血流變分析儀(型號(hào):HT-100B,濰坊嘉松有限公司);免疫組化試劑盒(貨號(hào):R200826,上海瑞楚有限公司);二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(貨號(hào):R110010,上海瑞楚有限公司);TGF-β1抗體(貨號(hào):YS-0086R,上海雅吉有限公司)。

1.3建模 隨機(jī)選取50只大鼠,麻醉后將其仰臥位固定,然后暴露脛骨骨干,用骨鉗截?cái)嘈纬晒钦勰Ｐ?將2 mm克氏針逆行向上打入脛骨上端,穿出皮膚后鉗斷克氏針尾,再順行打入脛骨干,固定好后活力碘沖洗,在骨折周圍滴入3滴慶大霉素,縫合傷口,術(shù)畢肌注青霉素7萬(wàn)U,連續(xù)3 d,建模中死亡5只,其余全部建模成功。

1.4分組及給藥 從建模成功的大鼠中隨機(jī)選取40只,將其分模型(B)組、益氣活血通絡(luò)湯(C)組、低分子肝素(D)組、益氣活血通絡(luò)湯聯(lián)合低分子肝素(E)組,每組10只,同時(shí)隨機(jī)選取10只正常大鼠作為正常對(duì)照(A)組,C組4 g/kg益氣活血通絡(luò)湯灌胃,D組500 U/kg低分子肝素灌胃,E組給予益氣活血通絡(luò)湯聯(lián)合低分子肝素治療,均1次/d,持續(xù)28 d,A、B組同期給予同體積生理鹽水。

1.5X線攝片檢測(cè)大鼠骨折愈合情況 實(shí)驗(yàn)完成后,給予大鼠腹腔注射0.5%的戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉,將其固定好后,對(duì)患肢行X線攝片檢查,檢查電壓為60 V,電流為1.2 mA,距離為90 cm,以此觀察大鼠骨折愈合情況。

1.6標(biāo)本采集 各組在X線攝片拍攝完成后,腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠,從下腔靜脈取血,加入抗凝劑后密封保存于冰箱中,同時(shí)游離出脛骨,洗凈后,加入脫鈣液進(jìn)行脫鈣處理,處理完成后用梯度乙醇脫水,二甲苯透明2次后常規(guī)石蠟包埋、切片,脫蠟后用4%多聚甲醛固定10 d,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后放入冰箱中密封保存。

1.7蘇木素-伊紅(HE)印跡檢測(cè)大鼠骨組織病理形態(tài) 取部分脛骨組織,經(jīng)二甲苯脫蠟→梯度乙醇水化→蒸餾水洗滌→蘇木素染色5 min→伊紅染液染色2 min→脫水→透明→中性樹膠封片后,用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織病理學(xué)觀察,然后應(yīng)用IPP醫(yī)學(xué)圖像處理系統(tǒng),計(jì)算軟骨、骨性骨痂、纖維性骨痂在骨痂總面積的比例,以反映骨折愈合情況。

1.8血液流變學(xué)指標(biāo)的測(cè)定 取各組靜脈血,全自動(dòng)血流變分析儀檢測(cè)全血低切黏度、中切黏度、高切黏度及血漿黏度,檢測(cè)于 25 ℃條件下進(jìn)行,由專人操作,且需嚴(yán)格按照儀器說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.9免疫組化法檢測(cè)骨組織中TGF-β1蛋白表達(dá) 取各組脛骨組織,使用抗原修復(fù)液(10 mmol/L Tris-EDTA緩沖液,pH9.0)用微波方式對(duì)組織切片進(jìn)行抗原修復(fù),用5%～10%的普通血清(牛血清)對(duì)組織切片進(jìn)行蛋白質(zhì)阻斷,然后進(jìn)行一抗孵育、二抗孵育,在每個(gè)孵育步驟之后,使用Tris緩沖液輕輕地洗滌組織切片,以去除非特異性結(jié)合的抗體,然后用DAB進(jìn)行顯色,脫水、透明、封片后,光學(xué)顯微鏡觀察,并應(yīng)用計(jì)算機(jī)病理圖像處理系統(tǒng)對(duì) TGF-β1的陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行定量分析,用積分吸光度值來(lái)展示統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn),方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組脛骨骨折X線攝片結(jié)果 與A組相比,B組骨折線清晰,且沒有形成明顯骨痂;與B組相比,C、D、E組骨愈合速度明顯加快;C、D組骨折線仍可見但折斷端邊緣趨于模糊,且形成明顯骨痂;而E組骨折基本消失,髓腔再通,外骨痂減少,可見大部分骨痂長(zhǎng)入骨折線,已有骨外膜形成并可見骨連接形成,見圖1。

圖1 各組脛骨骨折X線攝片

2.2各組HE染色結(jié)果 A組骨組織形態(tài)完整,骨小梁生長(zhǎng)旺盛,排列規(guī)則有序,且無(wú)壞死區(qū)域;B組骨組織形態(tài)紊亂,出現(xiàn)部分壞死區(qū)域,并可見少量纖維組織;C、D組骨痂組織中可見大量肉芽組織、纖維組織長(zhǎng)入,成軟骨細(xì)胞增生活躍,并有網(wǎng)狀交織的骨小梁;E組骨組織形態(tài)已趨于完整,排列有序且部分已被正常組織替代,骨小梁排列相對(duì)規(guī)則,可見部分成熟板狀骨形成,見圖2。

圖2 各組脛骨組織(HE染色,×100)

2.3各組脛骨組織TGF-β1蛋白表達(dá) 5組脛骨組織TGF-β1蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.000,P<0.001)。與A組(2.13±0.12)比較,B組脛骨組織TGF-β1蛋白表達(dá)顯著降低(0.98±0.08,P<0.05);與B組比較,C、D、E組脛骨組織TGF-β1蛋白表達(dá)顯著升高(1.54±0.11、1.53±0.12、2.14±0.12,P<0.05);與C、D組相比,E組上述指標(biāo)顯著升高(P<0.05),見圖3。

圖3 各組脛骨組織TGF-β1蛋白表達(dá)(免疫組化,×400)

2.4各組骨折愈合相關(guān)指標(biāo)結(jié)果 與A組比較,B、C、D、E組軟骨比例顯著降低,纖維骨痂比例顯著升高(均P<0.05);與B組比較,C、D、E組軟骨比例顯著升高,纖維骨痂比例顯著降低(P<0.05);與C、D組相比,E組軟骨比例顯著升高,纖維性骨痂比例明顯降低(P<0.05),而各組骨性骨痂比例相比無(wú)明顯差異(P>0.05),見表1。

2.5各組血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)結(jié)果 與A組比較,B、C、D、E組全血低切黏度、中切黏度、高切黏度及血漿黏度顯著升高(P<0.05);與B組比較,C、D、E組血低切黏度、中切黏度、高切黏度及血漿黏度顯著降低(P<0.05);與C、D組相比,E組上述指標(biāo)降低顯著(P<0.05),見表1。

表1 各組骨折愈合、血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)

3 討 論

在臨床上,一般通過治療多數(shù)患者骨折都會(huì)到達(dá)愈合,但骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜且相對(duì)漫長(zhǎng)的生物學(xué)過程,其會(huì)受到如缺血、感染、年齡和健康狀況等多方面因素的影響 ,因此骨折延遲愈合及不愈合的情況也時(shí)有發(fā)生,這不僅使得患者的行動(dòng)及生活受限極大,還對(duì)患者及其家屬造成了一定負(fù)擔(dān)〔8〕。

本研究發(fā)現(xiàn),益氣活血通絡(luò)湯與低分子肝素均具有顯著療效,可顯著促進(jìn)骨折愈合,改善大鼠骨組織形態(tài),且聯(lián)合效果更佳。低分子肝素是治療及預(yù)防深靜脈血栓的重要藥物,是由肝素裂解、純化后得到的低分子量肝素組成的混合物,具有明顯的抗凝血因子Xa活性,可有效抑制體內(nèi)外血栓和動(dòng)靜脈血栓的形成〔9〕。而益氣活血通絡(luò)湯則充分體現(xiàn)了中醫(yī)的兩大特點(diǎn)之一“整體觀念”,并運(yùn)用“益氣活血舒筋活絡(luò)”為治則,從而達(dá)到標(biāo)本兼治,局部與全身兼顧,祛邪與扶正兼施的目的〔10〕。在中醫(yī)中,骨折被稱為“骨碎”或“骨折”,中醫(yī)認(rèn)為骨折是由于外傷引起的氣血瘀滯、經(jīng)絡(luò)阻塞等問題導(dǎo)致,因此在中醫(yī)治療骨折時(shí),主要是通過活血化瘀、通絡(luò)舒筋以及調(diào)和氣血等方法來(lái)促進(jìn)骨折的愈合〔11〕。近年來(lái)雖然隨著醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展,骨折愈合率越來(lái)越高,但骨折愈合時(shí)間仍然較長(zhǎng),大多數(shù)骨折仍需6～12 w才能達(dá)到臨床愈合,此外還時(shí)有骨折愈合延遲或不愈合的情況,有調(diào)查顯示這種情況可占骨折的10%左右,是影響骨折病人功能康復(fù)的重要問題,已經(jīng)廣泛受到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的關(guān)注〔12〕。而對(duì)于骨折大鼠,益氣活血通絡(luò)湯聯(lián)合低分子肝素可能是通過活血通絡(luò)、抗凝、抗血小板聚集的作用,來(lái)改善血液循環(huán),從而增強(qiáng)新陳代謝、促進(jìn)基質(zhì)膠原的合成、提高成骨細(xì)胞的活性、增強(qiáng)機(jī)體清除血腫的能力等,進(jìn)而促進(jìn)骨痂形成、并有效促進(jìn)骨形成及骨重建,最終到達(dá)加速骨折愈合的目的。周志豪〔13〕研究表明,養(yǎng)血固腎湯具有顯著療效,可顯著促進(jìn)鈣鹽沉積、增強(qiáng)體內(nèi)成骨細(xì)胞的活動(dòng)、進(jìn)而促進(jìn)骨折大鼠骨折愈合,改善其病理形態(tài),這與本文結(jié)果類似。

本研究表明,益氣活血通絡(luò)湯與低分子肝素可顯著改善骨折大鼠血液流變學(xué),且聯(lián)合效果更佳。在骨折初期,受傷組織會(huì)發(fā)生出血,形成血腫,而血腫的形成會(huì)導(dǎo)致骨折處血液的供應(yīng)情況變差,從而直接影響新骨的生成,因此,良好的血供是促使骨折愈合的首要條件〔14〕。而血液流變學(xué)是研究血液在血管內(nèi)流動(dòng)時(shí)的性質(zhì)和特性的科學(xué)領(lǐng)域,也是判斷血瘀程度的客觀指標(biāo),故檢測(cè)其變化可有效明確機(jī)體血液循環(huán)及血瘀情況〔15〕。而對(duì)于骨折大鼠,益氣活血通絡(luò)湯聯(lián)合低分子肝素可能是通過促進(jìn)全身氣血循環(huán),來(lái)加強(qiáng)血液循環(huán)及離子的運(yùn)轉(zhuǎn),從而加速代謝、提高肢體血流量、改善缺血、缺氧、乳酸蓄積情況,進(jìn)而改善骨折處的血液供應(yīng)、降低血液黏稠度、提高骨痂的生物力學(xué)性能、刺激骨生長(zhǎng)因子的分泌與合成等,最終加快骨吸收愈合,改善骨生物力學(xué)。李書良〔16〕研究發(fā)現(xiàn),益氣活血通絡(luò)湯聯(lián)合低分子肝素鈣對(duì)老年股骨轉(zhuǎn)子間骨折具有顯著療效,可有效降低骨折術(shù)后下肢深靜脈血栓的發(fā)生率,且無(wú)不良反應(yīng),這與本文結(jié)果類似。

本研究說(shuō)明,益氣活血通絡(luò)湯與低分子肝素可顯著促進(jìn)TGF-β1表達(dá),且聯(lián)合效果更佳。TGF-β1與許多病理、生理的發(fā)生發(fā)展過程都有著密切聯(lián)系,有研究表明,其是成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞的促有絲分裂原,可促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和基質(zhì)蛋白的合成,同時(shí)具有刺激骨膜內(nèi)骨形成的作用,因此,研究其表達(dá)情況可作為闡明骨折愈合分子機(jī)制的重要步驟〔17～19〕。而對(duì)于骨折大鼠,益氣活血通絡(luò)湯聯(lián)合低分子肝素可能是通過活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)、去瘀生新等功效,來(lái)加速毛細(xì)血管的形成,從而促進(jìn)血液運(yùn)行、刺激降鈣素基因相關(guān)肽等神經(jīng)肽類物質(zhì)的釋放、刺激骨細(xì)胞增殖分化、刺激成骨細(xì)胞活性等,進(jìn)而促進(jìn)TGF-β1表達(dá)、達(dá)到促進(jìn)骨蛋白的合成、增加骨基質(zhì)等的目的,最終有效提高骨折愈合程度。郇義超等〔20〕研究發(fā)現(xiàn),益氣健骨補(bǔ)腎方可顯著改善股骨骨折大鼠骨轉(zhuǎn)化指標(biāo),提升骨生物力學(xué)性能,促進(jìn)TGF-β1表達(dá),這與本文結(jié)果類似。

綜上,益氣活血通絡(luò)湯聯(lián)合低分子肝素抗凝具有顯著療效,其可顯著促進(jìn)骨折愈合,改善血液流變學(xué),并促進(jìn)TGF-β1表達(dá)。