楊海龍 王丁丁 陳雨桐 陳曉偉 李冰 王欣麗

(哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院 1胸外科,河北 衡水 053000;2神經(jīng)內(nèi)一科)

食管癌(EC)被認(rèn)為是全球最主要的惡性腫瘤之一,也是中國(guó)男性癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一,每年有近214 090例EC新病例被診斷出來(lái),大約197 823人死亡〔1〕。目前,EC有多種診斷和治療策略,包括色素內(nèi)鏡檢查、窄帶成像和可疑病變活檢。雖然先進(jìn)的技術(shù)在一定程度上提高了EC的治療效率,但EC的預(yù)后仍然很差,提示EC仍然是我國(guó)首要的公共衛(wèi)生問(wèn)題〔2,3〕。因此,有必要探索新的方法以提高EC的診斷和預(yù)后。

miRNA是一種小型的非編碼RNA,在轉(zhuǎn)錄后水平參與基因調(diào)控。據(jù)報(bào)道,miRNA的失調(diào)通過(guò)調(diào)節(jié)與腫瘤發(fā)生過(guò)程相關(guān)的靶基因參與癌變過(guò)程〔4,5〕。例如,miR-154-5p在腫瘤組織中低表達(dá),并抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移〔5〕。越來(lái)越多的證據(jù)也表明,miRNA與EC有關(guān),Fan等〔6〕發(fā)現(xiàn),miR-145-5p可以通過(guò)抑制其靶基因抑制EC的發(fā)生和發(fā)展。miR-541-5p是新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制因子〔7〕,關(guān)于其在EC中的作用還未見(jiàn)深入報(bào)道。DDX52是一種DEAD/H box RNA解旋酶,以往研究顯示,敲低DDX52可顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)〔8〕,還未見(jiàn)報(bào)道顯示DDX52與EC的關(guān)系。本研究假設(shè)miR-541-5p可能通過(guò)調(diào)節(jié)DDX52在EC的發(fā)展中發(fā)揮作用,并通過(guò)以下研究來(lái)驗(yàn)證此假設(shè),以期為EC的治療提供新參考。

1 材料和方法

1.1組織樣本 收集2019年5月至2021年10月哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院200例EC組織及鄰近非腫瘤食管(Normal)組織。所有患者簽署書(shū)面知情同意書(shū)。術(shù)前無(wú)患者接受放療或化療。本研究得到了哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),且符合世界醫(yī)學(xué)會(huì)《赫爾辛基宣言》。

1.2細(xì)胞與主要試劑 人食管上皮細(xì)胞HET-1A(BNCC337688)與EC細(xì)胞系EC9706(BNCC339892)、TE-9(BNCC351845)、ECA-109(BNCC337687)和KYSE180(BNCC351871)獲自北京Bena Culture Collection;Trizol總RNA抽提試劑(R0016)、BeyoECL Moon(P0018FS)、增強(qiáng)型CCK-8試劑盒(C0041)獲自上海Beyotime;PrimeScript RT reagent試劑盒(RR037A)獲自日本TaKaRa;miScript SYBR Green聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒(DXT-218073)獲自美國(guó)Qiagen;miR-541-5p模擬物(miR-541-5p)及其陰性對(duì)照(miR-con)、miR-541-5p抑制物(miR-541-5p inh)及其陰性對(duì)照(miR-con inh)和過(guò)表達(dá)DDX-52(OE-DDX52)及其陰性對(duì)照(OE-con)均獲自廣州RIBIO;RIPA lysis buffer(20-188)獲自美國(guó)Sigma-aldrich;二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(23229)獲自美國(guó)Thermo Fisher Scientific;一抗:DDX52(FNab02315)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH,FNab03342)、Ki67(FNab09788)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9(FNab05247)均獲自武漢FineTest;DualucifTMFirefly &Renilla測(cè)定試劑盒(F6075S)獲自上海US EVERBRIGHT INC;BALB/c裸鼠獲自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,許可證號(hào):SCXK(京)2021-0004;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(AG1120)獲自上海Acmec。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) HET-1A、ECA-109和EC9706細(xì)胞系維系在DEME培養(yǎng)基中,KYSE180和TE-9細(xì)胞系維系在RPMI1640培養(yǎng)基中,所有細(xì)胞置于37 ℃,均添加10%胎牛血清和1%青-鏈霉素。

1.4qRT-PCR分析 通過(guò)Trizol試劑從收集的EC組織、Normal組織和不同細(xì)胞系中提取總RNA。然后,將RNA合成cDNA,并按照miScript SYBR Green PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR測(cè)定,評(píng)估數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt法,U6用作內(nèi)部對(duì)照?；蛞?miR-541-5p(正義:5′-CGAAAGGATTCTGCTGTCGGT-3′和反義:5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′)和U6(正義:5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′和反義:5′-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′)。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC9706細(xì)胞或ECA-109細(xì)胞,依次分為miR-541-5p組,miR-con組,miR-541-5p inh 組,miR-con inh組,miR-541-5p+OE-DDX52組和miR-541-5p+OE-con組。使用Lipofectamine2000試劑分別轉(zhuǎn)染miR-541-5p(EC9706細(xì)胞)、miR-541-5p inh(ECA-109細(xì)胞)和miR-541-5p+OE-DDX52(EC9706細(xì)胞)及其相應(yīng)的陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L,將細(xì)胞在新鮮培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)48 h以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)qRT-PCR或Western印跡法分析轉(zhuǎn)染效率。

1.6Western印跡分析 用RIPA裂解液獲取轉(zhuǎn)染后的EC9706細(xì)胞或ECA-109細(xì)胞的蛋白質(zhì),并用BCA法進(jìn)行蛋白濃度鑒定。通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離來(lái)自每個(gè)樣品的35 μg總蛋白,轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上并在5%脫脂牛奶中封閉1 h。將膜與一抗孵育,包括DDX52和GAPDH。4 ℃過(guò)夜。然后使用二抗在室溫下覆蓋膜45 min。最后,通過(guò)電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑檢測(cè)條帶。通過(guò)Image Lab軟件分析灰度值。

1.7CCK-8測(cè)定 轉(zhuǎn)染后的EC9706細(xì)胞或ECA-109細(xì)胞以(2×104個(gè)/孔)鋪板到96孔板中,48 h后向每孔中加入10 μl CCK-8溶液。將細(xì)胞與CCK-8溶液一起孵育4 h,然后在450 nm處檢測(cè)吸光度(OD)值(表示細(xì)胞活力)。

1.8集落形成實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后的EC9706細(xì)胞或ECA-109細(xì)胞以(6×102個(gè)/孔)鋪板到6孔板中。培養(yǎng)14 d后,細(xì)胞用甲醇固定,然后用結(jié)晶紫染色。最后使用倒置顯微鏡對(duì)細(xì)胞集落進(jìn)行拍照。使用ImageJ計(jì)算>50個(gè)細(xì)胞的集落。

1.9傷口愈合實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染后的EC9706細(xì)胞或ECA-109細(xì)胞以(5×105個(gè)/孔)鋪板到6孔板中,當(dāng)所有孔都充滿細(xì)胞時(shí),用200 μl無(wú)菌移液器吸頭刮擦線性傷口。使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌板數(shù)次以去除懸浮細(xì)胞。并將細(xì)胞在無(wú)血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。0、24 h用光學(xué)顯微鏡對(duì)同一部位的創(chuàng)面進(jìn)行成像,計(jì)算創(chuàng)面愈合面積〔(總面積-創(chuàng)面面積)/總面積〕。

1.10雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) TragetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)被用來(lái)預(yù)測(cè)miR-541-5p的目標(biāo)基因。將DDX52的野生型(WT)或突變型(MUT)miR-541-5p結(jié)合序列插入pmirGLO質(zhì)粒中,建立重組熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒(DDX52-WT和DDX52-MUT)。EC9706細(xì)胞用重組熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和miR-541-5p或miR-con共轉(zhuǎn)染。48 h后通過(guò)雙熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)檢查相對(duì)熒光素酶活性。

1.11異種移植實(shí)驗(yàn) 共10只雄性無(wú)胸腺BALB/c裸鼠(4～6 w,20～25 g)飼養(yǎng)在哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(濕度:50%;溫度:25 ℃;光照循環(huán):12 h光照/12 h黑暗;隨意進(jìn)食和飲水)。將裸鼠隨機(jī)分為2組:miR-con組、miR-541-5p組,每組5只。將miR-541-5p或miR-con轉(zhuǎn)染的EC9706細(xì)胞懸浮在PBS中(5×105個(gè)/200 μl)并皮下注射到裸鼠的右后腿中。每5 d用卡尺檢測(cè)腫瘤體積,在第32天通過(guò)脊柱脫位處死裸鼠,最后將腫瘤組織標(biāo)本在4%甲醛溶液中固定或儲(chǔ)存在液氮中,qRT-PCR檢測(cè)miR-541-5p表達(dá)。所有程序經(jīng)哈勵(lì)遜國(guó)際和平醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.12HE染色和免疫組化 將固定后的腫瘤組織采用石蠟包埋,并切成5 μm的切片。將切片脫蠟和水化,部分切片用于HE染色。其他切片使用3%過(guò)氧化氫(H2O2)孵育30 min,然后用山羊血清在37 ℃下封閉40 min,與一抗(包括DDX52、Ki67和MMP-9)在室溫下孵育1 h,然后與二抗孵育45 min。最后使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)觀察染色信號(hào),通過(guò)蘇木素對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。在光學(xué)顯微鏡下拍攝圖片。

1.13統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism5.0和SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析和Dunnett-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-541-5p在EC組織和細(xì)胞中表達(dá)降低 qRT-PCR結(jié)果顯示,EC組織中miR-541-5p水平較Normal組織顯著降低(0.34±0.05 vs 1.04±0.20,P<0.05);在EC細(xì)胞系中,與HET-1A細(xì)胞(1.02±0.03)比較,ECA-109、EC9706、KYSE180、TE-9細(xì)胞miR-541-5p表達(dá)(0.46±0.05、0.21±0.02、0.35±0.04、0.40±0.03)顯著降低(均P<0.05)。其中,miR-541-5p水平在EC9706細(xì)胞中最低,在ECA-109細(xì)胞中最高。

2.2miR-541-5p抑制EC細(xì)胞增殖和遷移 如表1、圖1所示,在miR-541-5p過(guò)表達(dá)的EC9706細(xì)胞中miR-541-5p水平顯著升高,而在miR-541-5p敲低的ECA-109細(xì)胞中miR-541-5p水平顯著降低(P<0.05)。miR-541-5p過(guò)表達(dá)顯著降低了EC9706細(xì)胞活力、集落形成數(shù)量和創(chuàng)面愈合面積,而敲低miR-541-5p顯著增加了ECA-109細(xì)胞活力、集落形成數(shù)量和創(chuàng)面愈合面積(均P<0.05)。

表1 miR-541-5p對(duì)EC細(xì)胞增殖和遷移的影響

2.3miR-541-5p靶向DDX52 TargetScan分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),miR-541-5p可能靶向DDX52,見(jiàn)圖2。miR-541-5p模擬物顯著降低了DDX52-WT轉(zhuǎn)染的EC9706細(xì)胞中熒光素酶活性(P<0.05),而miR-541-5p模擬物對(duì)DDX52-MUT轉(zhuǎn)染的EC9706細(xì)胞中熒光素酶活性無(wú)顯著影響(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)miR-541-5p與DDX52之間的關(guān)系

2.4miR-541-5p通過(guò)下調(diào)DDX52抑制EC細(xì)胞增殖、遷移 miR-541-5p過(guò)表達(dá)顯著抑制了DDX52蛋白水平,而OE-DDX52顯著逆轉(zhuǎn)了miR-541-5p模擬物對(duì)DDX52蛋白的抑制作用(P<0.05)。與miR-541-5p+OE-con組相比,miR-541-5p+OE-DDX52組EC9706細(xì)胞活力、集落形成數(shù)量和創(chuàng)面愈合面積均顯著增高(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表3、圖4。

2.5miR-541-5p抑制裸鼠腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移 miR-541-5p過(guò)表達(dá)后腫瘤組織中miR-541-5p水平顯著增加,腫瘤體積、重量顯著減小(P<0.05)。HE結(jié)果顯示,miR-541-5p過(guò)表達(dá)后腫瘤組織繼續(xù)生長(zhǎng)過(guò)程中存在細(xì)胞分層紊亂及壞死情況;免疫組化結(jié)果顯示,miR-541-5p過(guò)表達(dá)抑制腫瘤組織中DDX52、Ki67和MMP-9表達(dá)(P<0.05)。見(jiàn)圖5、表4、圖6。

1～4:miR-con組、miR-541-5p組、miR-541-5p+OE-con組、miR-541-5p+OE-DDX52組圖3 Western檢測(cè)各組DDX52蛋白表達(dá)

表3 miR-541-5p通過(guò)下調(diào)DDX52對(duì)EC細(xì)胞增殖、遷移的影響

圖4 miR-541-5p通過(guò)下調(diào)DDX52對(duì)EC細(xì)胞增殖和遷移的影響(×40)

圖5 miR-541-5p過(guò)表達(dá)對(duì)異種移植裸鼠模型中腫瘤組織生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響(×200)

表4 miR-541-5p過(guò)表達(dá)對(duì)異種移植裸鼠模型中腫瘤組織生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響

圖6 裸鼠異種移植瘤圖像

3 討 論

第一個(gè)miRNA是1993年發(fā)現(xiàn)的,來(lái)自秀麗隱桿線蟲(chóng)中的lin-4,被鑒定為一種小的非編碼RNA〔9〕。在過(guò)去的幾十年中,隨著越來(lái)越多的miRNA被鑒定出來(lái),研究人員逐漸意識(shí)到miRNA是一簇短的非編碼RNA,可以抑制mRNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、降低蛋白質(zhì)的翻譯率、破壞蛋白質(zhì)的調(diào)控,參與包括細(xì)胞增殖、遷移在內(nèi)的多個(gè)生物過(guò)程,并在癌癥的發(fā)展中發(fā)揮作用〔10,11〕。

miRNA組成了一個(gè)廣泛存在于真核細(xì)胞中的大家族,其中一些與mRNA存在靶向關(guān)系?；蚪M分析表明,miRNA靶向的人類基因有5 300多個(gè),占人類基因總數(shù)的30%,其表達(dá)與癌癥密切相關(guān)〔12,13〕。研究表明,EC患者和健康人之間存在許多miRNA改變。據(jù)報(bào)道,miRNA的異常表達(dá)與EC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)〔4〕,如miR-1304在EC患者組織和血清中的表達(dá)增加,可作為EC診斷和復(fù)發(fā)及該病患者生存率的潛在指標(biāo)〔14〕。Maghsudlu等〔15〕研究顯示,miR-27a和miR-24-2在食管鱗狀細(xì)胞癌中顯著上調(diào),且具有協(xié)同作用。此外,研究表明,miR-27b-3p可通過(guò)靶向核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2在食管鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮抑癌作用〔16〕。本研究結(jié)果表明,miR-541-5p在EC進(jìn)展中起抑制作用。以往研究顯示,miR-541-5p可通過(guò)靶向環(huán)核苷酸磷酸二酯酶1A調(diào)節(jié)肺纖維化,上調(diào)其表達(dá)對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺部纖維化具有保護(hù)作用〔17〕。另外,一篇報(bào)道顯示,miR-541-5p在肝細(xì)胞癌中上調(diào),可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,并抑制細(xì)胞凋亡〔18〕。結(jié)合以上研究說(shuō)明,miR-541-5p在不同的癌癥中可能發(fā)揮不同的作用,因此有必要對(duì)其在EC中的作用機(jī)制進(jìn)行探究。

DDX52也稱為ROK1,是DEAD-box RNA解旋酶家族的成員,該家族的成員參與各種基于RNA的過(guò)程和三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合,并與多種人類疾病有關(guān),包括精子發(fā)生紊亂、病毒感染和癌癥〔19〕。先前的研究表明,RNA解旋酶可以作為癌基因并在癌癥進(jìn)展過(guò)程中表達(dá)上調(diào),例如:DDX10可通過(guò)U3小核仁核糖核蛋白4促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖〔20〕。本研究結(jié)果表明,miR-541-5p通過(guò)負(fù)靶向DDX52在EC中發(fā)揮抑癌作用。另外,根據(jù)現(xiàn)有研究報(bào)告顯示,敲低DDX52可通過(guò)調(diào)節(jié)抗鼠源原癌基因(c-Myc)信號(hào)傳導(dǎo)抑制前列腺癌〔8〕、黑色素瘤〔21〕的發(fā)展。于是,筆者推測(cè)miR-541-5p可能通過(guò)調(diào)控DDX52調(diào)節(jié)c-Myc信號(hào)抑制EC細(xì)胞增殖和遷移,但其具體機(jī)制還需更深入探討。然而,miR-541-5p亦可能與其他基因結(jié)合,通過(guò)其他信號(hào)通路參與EC進(jìn)展。因此,接下來(lái)將探討miR-541-5p在EC細(xì)胞增殖和遷移中的作用機(jī)制。此外,許多miRNA可能參與EC治療,隨后將在進(jìn)一步的研究中探索一組miRNA在EC治療中的作用?？傊?本研究首次證明了miR-541-5p可能通過(guò)抑制DDX52來(lái)抑制EC細(xì)胞的增殖和遷移,為EC患者提供了一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。