柳慶明 田利軍 唐樂 鞏鳳梅

(濟(jì)南市人民醫(yī)院針灸推拿科,山東 濟(jì)南 271100)

頸性眩暈是頸椎病臨床常見分型之一,通常是由于頸椎骨骼、肌肉或軟組織的異常導(dǎo)致,主要以眩暈等交感神經(jīng)癥狀為主,故又稱椎動(dòng)脈型頸椎病〔1〕。頸椎病通常具有病程長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn),而頸性眩暈嚴(yán)重時(shí)還會(huì)出現(xiàn)昏倒的情況,這不僅給患者帶來(lái)了痛苦,還嚴(yán)重影響日常生活及工作〔2〕。目前,關(guān)于頸性眩暈的發(fā)病機(jī)制尚無(wú)明確定論,但有研究表明,炎癥反應(yīng)、頸交感神經(jīng)刺激及體液因子紊亂與該病的發(fā)病密切相關(guān),其都可造成椎基底動(dòng)脈供血不足,從而誘發(fā)眩暈〔3〕。Toll 樣受體(TLR)4炎癥信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,其可通過(guò)識(shí)別不同的病原體,來(lái)調(diào)控炎癥因子、趨化因子、細(xì)胞因子等炎癥介質(zhì),從而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)〔4〕。中縫背核神經(jīng)元是機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)信息的傳遞重要途徑,其與自身穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)、感覺和運(yùn)動(dòng)控制、學(xué)習(xí)和認(rèn)知等方面具有密切聯(lián)系,且其支配區(qū)較大,與包括頸交感神經(jīng)在內(nèi)的各腦區(qū)有著復(fù)雜的神經(jīng)纖維關(guān)系〔5〕。有研究表明,血管活性物質(zhì)是引起眩暈的一種關(guān)鍵體液因子,其收縮、舒張血管物質(zhì)之間的失衡可能是導(dǎo)致眩暈的關(guān)鍵因素〔6〕。目前臨床上治療頸性眩暈的手段紛繁復(fù)雜,但針灸治療一直更受患者青睞,因其在緩解頸肩部疼痛、改善頭暈癥狀方面具有確切療效,且還具有操作簡(jiǎn)單易行、安全、無(wú)副作用及實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)〔7〕。但其對(duì)該病的具體作用機(jī)制研究相對(duì)較少,本文基于TLR4炎癥信號(hào)通路探討針灸對(duì)頸性眩暈大鼠中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞活性及血管活性物質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器與試劑 北京化學(xué)試劑公司提供的60只SPF級(jí)SD大鼠〔合格證書為:SCXK(京)2019-0062〕,體質(zhì)量215～295 g,飼養(yǎng)條件:23～26 ℃,相對(duì)濕度45%～69%,噪音<85 dB,無(wú)菌自由進(jìn)食,進(jìn)水2 w,按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。一次性使用無(wú)菌針灸針(HT0067,河南澤垣醫(yī)療器械銷售有限公司);鹽酸氟桂利嗪(西比靈,H10930003,西安楊森制藥有限公司);平衡木(北京安默賽斯生物科技有限公司);高速冷凍離心機(jī)(M1324R,深圳市瑞沃德生命科技有限公司);TUNEL試劑盒(E-EL-0003,武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);DAPI染色液(TDCF5001,武漢天德生物科技有限公司);熒光顯微鏡(QLS-scope,北京Quantum量子科學(xué)儀器貿(mào)易有限公司);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定試劑盒(SHC-9823,上海淳麥生物科技有限公司);蛋白質(zhì)裂解液(SH0441,上海齊一生物科技有限公司);十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒(01100031,北京蘭杰柯科技有限公司);電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)試劑盒(KFS099,北京百奧萊博科技有限公司);TLR4抗體(10146-T16)、GAPDH抗體(10094-MM09-50)均購(gòu)于北京義翹神州科技股份有限公司。

1.2分組與模型制備 選取40只SPF級(jí)SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常(N)組、模型(M)組、針灸(A)組、西比靈(W)組,每組10只。對(duì)M、A、W組進(jìn)行頸性眩暈建模,首先將大鼠固定,用0.4%的戊巴比妥麻醉后,剪斷頸后部肌肉,切除包括棘上韌帶、棘間韌帶的C5-6 棘突和韌帶,并破壞該段關(guān)節(jié)囊,使大鼠頸椎上下椎體出現(xiàn)明顯失穩(wěn),然后逐層縫合傷口,手術(shù)完成后4萬(wàn)U青霉素連續(xù)注射3 d,當(dāng)傷口愈合后,將大鼠放在平衡木上,如出現(xiàn)搖晃、停滯等現(xiàn)象時(shí),則視為建模成功,N組不建立該模型,同期給予同體積生理鹽水。建模成功后,A組選取“風(fēng)池”“百會(huì)”等穴位進(jìn)行針灸治療,W組灌胃西比靈0.5 mg/kg,兩組均1次/d,持續(xù)21 d,N、M組同期灌胃0.5 mg/kg生理鹽水,給藥期間觀察各組一般情況并記錄。

1.3檢測(cè)步驟 (1)行為學(xué)檢測(cè):實(shí)驗(yàn)完成后對(duì)各組大鼠進(jìn)行平衡木實(shí)驗(yàn),首先將平衡木放置妥當(dāng),然后上下左右的轉(zhuǎn)動(dòng)大鼠頭部,轉(zhuǎn)動(dòng)完成后迅速將大鼠放于平衡木上,若其在平衡木上搖晃、停滯、調(diào)轉(zhuǎn)方向、稍有移動(dòng)或不移動(dòng),計(jì)0～1分;有明顯移動(dòng),甚者通過(guò)木桿,計(jì)1～2分;較流暢行走,通過(guò)木桿,計(jì)2～3分,總分3分,評(píng)分越高行為學(xué)恢復(fù)越好。(2)標(biāo)本采集:平衡木實(shí)驗(yàn)完成后,麻醉后處死大鼠,腹主動(dòng)脈取血5 ml,將其放入含肝素鈉的真空采血管中,搖勻后靜置2 h,離心15 min,棄掉上清液,得血漿樣品放入冰箱密封保存,同時(shí)于冰上斷頭取腦,并分離出中縫背核組織,將其放于冷凍的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中保存?zhèn)溆?其余腦組織用4%的多聚甲醛固定96 h,洗滌后放入冰箱中密封保存。(3)中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞活性測(cè)定:取中縫背核組織,采用TUNEL試劑盒檢測(cè)中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,凋亡細(xì)胞發(fā)綠色熒光。(4)血漿血管活性物質(zhì)相關(guān)指標(biāo)水平測(cè)定:采用ELISA檢測(cè)內(nèi)皮素(ET)-1、血栓素(TX)B2、神經(jīng)肽(NP)Y、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)水平,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。(5)大鼠腦組織中TLR4蛋白表達(dá)檢測(cè):另取20只大鼠,建模后隨機(jī)分為兩組,T組給予灌胃1 mg/kg TLR4抑制劑組,U組給予TLR4抑制劑聯(lián)合針灸,Western印跡檢測(cè)各組腦組織中NLR4蛋白,主要步驟為樣品制備、蛋白質(zhì)濃度測(cè)定、SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、阻斷、一抗孵育、 洗滌、二抗孵育、再洗滌、信號(hào)檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組一般情況觀察結(jié)果 N組皮毛光澤,活動(dòng)自如,一般情況均正常,對(duì)外界刺激也反應(yīng)靈敏,M組皮毛光澤可見降低,且活動(dòng)明顯受限,頸部活動(dòng)受限最為明顯,進(jìn)食、進(jìn)水量明顯減少,對(duì)外界刺激反應(yīng)可見明顯降低,而與M組相比,A、W組一般情況明顯改善,飲食逐漸恢復(fù)正常,頸部活動(dòng)也明顯恢復(fù)。

2.2各組行為學(xué)結(jié)果 與N組相比,M組平衡木得分明顯降低(P<0.05);與M組比較,A、W兩組平衡木得分明顯升高(P<0.05);W組與A組相比無(wú)明顯差異(P>0.05),見表1。

2.3各組血漿中血管活性物質(zhì)相關(guān)指標(biāo)水平 與N組相比,M組血漿中CGRP水平明顯降低,ET-1、TXB2、NPY水平明顯升高(P<0.05);與M組比較,A、W兩組血漿中CGRP水平明顯升高,ET-1、TXB2、NPY水平明顯降低(P<0.05);W組與A組相比無(wú)明顯差異(P>0.05),見表1。

2.4各組中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞活性 與N組相比,M組中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞凋亡明顯升高(P<0.05);與M組比較,A、W兩組中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞凋亡明顯降低(P<0.05);W組與A組相比無(wú)明顯差異(P>0.05),見表1、圖1。

表1 各組平衡木得分、中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率、血漿中血管活性物質(zhì)相關(guān)指標(biāo)水平

圖1 各組中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞活性(TUNEL染色,×200)

2.5各組腦組織中TLR4蛋白表達(dá) 與N組(1.21±0.05)相比,M組腦組織中TLR4蛋白表達(dá)(2.74±0.12)明顯升高(P<0.05);與M組比較,A、W兩組腦組織中TLR4蛋白表達(dá)(1.97±0.11,1.98±0.11)明顯降低(P<0.05);W組與A組相比無(wú)明顯差異(P>0.05);T組(1.96±0.11)與W組相比無(wú)明顯差異(P>0.05);U組(1.41±0.09)比T組明顯降低(P<0.05),見圖2。

圖2 各組腦組織中TLR4蛋白表達(dá)

3 討 論

長(zhǎng)時(shí)間的低頭會(huì)導(dǎo)致頸椎受損從而引發(fā)各種頸椎病,這也使得頸椎病的發(fā)病率不斷上漲且呈年輕化趨勢(shì)〔8〕。而頸性眩暈除伴有頸項(xiàng)僵痛、麻木、耳鳴等癥狀,還伴有頭暈?zāi)垦?、惡心嘔吐、步履不穩(wěn),同時(shí)其也是高血壓、腦梗死等疾病的發(fā)病誘因,因此探尋一種有效地治療方法對(duì)緩解患者病痛,預(yù)防并發(fā)癥等方面具有積極意義〔9〕。古代醫(yī)師在針灸治療頸椎病方面留下了豐富的臨床資料以供借鑒〔10〕。

本研究說(shuō)明,針灸治療具有顯著療效。西比靈是臨床上治療眩暈的常用藥物,其可選擇性的阻止過(guò)量鈣離子進(jìn)入細(xì)胞,從而防止血管痙攣,進(jìn)而恢復(fù)椎動(dòng)脈的供血,最終到達(dá)緩解眩暈癥狀的目的,因此本文選擇其作為對(duì)照藥物〔11〕。而針灸是一種傳統(tǒng)的中醫(yī)療法,可以用于治療各種疾病和癥狀,包括頭暈,其通過(guò)刺激特定的穴位來(lái)調(diào)節(jié)人體的氣血流動(dòng),促進(jìn)身體的自愈能力〔12〕。平衡木實(shí)驗(yàn)是反映大鼠行為學(xué)的有效指標(biāo),其能夠驗(yàn)證大鼠的平衡能力及眩暈狀態(tài),且操作簡(jiǎn)單易行,便于實(shí)驗(yàn)。頸性眩暈在中醫(yī)中屬于眩暈范疇,其主要病機(jī)為局部經(jīng)脈氣血運(yùn)行不暢,髓海失養(yǎng),難以上呈清竅而致,因此調(diào)整督脈氣血、活血化瘀是關(guān)鍵所在〔13〕。對(duì)于頸性眩暈大鼠,針灸主要是通過(guò)刺激穴位及局部軟組織,來(lái)激發(fā)經(jīng)脈氣血,從而調(diào)節(jié)血管的血流速度、調(diào)節(jié)局部軟組織的緊張痙攣狀態(tài),進(jìn)而改善椎動(dòng)脈血供、緩解局部肌肉痙攣,最終有效改善或消除頭暈癥狀。張國(guó)亮〔14〕研究發(fā)現(xiàn),針灸治療頸性眩暈具有良好的臨床效果,可顯著緩解眩暈癥狀,這與本文結(jié)果類似。

本研究表明,針灸可顯著抑制頸性眩暈大鼠中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞活性,有效調(diào)控血管活性物質(zhì)分泌。頸交感神經(jīng)刺激學(xué)說(shuō)是目前被醫(yī)學(xué)專家公認(rèn)的引起頸性眩暈的幾大學(xué)說(shuō)之一,當(dāng)交感神經(jīng)受到壓迫或刺激時(shí),就會(huì)引起眩暈、頭痛、惡心、心臟搏動(dòng)增快等情況,而中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞活性可能在其中發(fā)揮著重要作用〔15〕。血液中ET-1、TXB2、NPY、CGRP等血管活性物質(zhì)與椎基底動(dòng)脈供血有著密切的關(guān)聯(lián),有研究表明,血管活性物質(zhì)分泌紊亂是誘發(fā)眩暈的關(guān)鍵因素〔16〕。頸椎長(zhǎng)期受到壓迫或椎動(dòng)脈出現(xiàn)粥樣硬化是頸性眩暈的主要致病因素,而這會(huì)導(dǎo)致血流減慢,從而引起缺血低氧反應(yīng),進(jìn)而影響血管活性物質(zhì)的分泌,最終加重疾病癥狀〔17〕。對(duì)于頸性眩暈大鼠,針灸可能是通過(guò)穴位刺激,來(lái)擴(kuò)張血管,調(diào)節(jié)微循環(huán),從而增加腦血流量及局部組織的微血流量、降低微血管收縮性、降低血管阻力、抑制血小板凝集,進(jìn)而降低血黏度、松弛頸部肌肉痙攣、改善供血,最終有效改善頸性眩暈癥狀。劉乃剛等〔18〕研究發(fā)現(xiàn),針灸治療對(duì)第三腰椎橫突綜合征大鼠具有顯著療效,其可有效調(diào)節(jié)血漿中血管活性物質(zhì)的含量,這與本文結(jié)果類似。

本研究說(shuō)明,針灸可顯著抑制TLR4炎癥信號(hào)通路表達(dá)。TLR4 是一種模式識(shí)別受體,其在免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著不可或缺的作用,而其所在炎癥信號(hào)通絡(luò)也是炎癥反應(yīng)發(fā)生的重要參與者,其可通過(guò)活化促炎性因子來(lái)促進(jìn)炎癥反應(yīng)〔19〕。頸性眩暈由于血流受到限制,從而激發(fā)了炎癥反應(yīng),而相關(guān)炎癥性的發(fā)生、發(fā)展與靶器官的損害是一個(gè)惡性循環(huán),因此近年來(lái)如何抑制炎癥反應(yīng)是臨床治療該病的工作重點(diǎn)〔20〕。對(duì)于頸性眩暈大鼠,針灸可能是通過(guò)穴位這種外源性刺激,來(lái)激活機(jī)體神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),將物理信號(hào)轉(zhuǎn)化為生物信號(hào),從而釋放某些 TLR4的內(nèi)源性配體使其與 TLR4結(jié)合,進(jìn)而達(dá)到降低TLR4表達(dá)、抑制相關(guān)炎性因子分泌、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成等目的,最終有效抑制炎癥反應(yīng),改善大鼠臨床癥狀。孫遠(yuǎn)征等〔21〕研究發(fā)現(xiàn),針刺可以調(diào)控TLR4-核因子-κB信號(hào)通路,在頸椎病等慢性神經(jīng)退行性疾病中起調(diào)節(jié)作用,這與本文結(jié)果類似。

綜上,針灸可顯著抑制頸性眩暈大鼠中縫背核神經(jīng)元細(xì)胞活性并有效調(diào)控血管活性物質(zhì)水平,其作用機(jī)制可能與抑制TLR4炎癥信號(hào)通路有關(guān)。