馮麗萍 張輝潔 歐雯婷 余盈

(廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腫瘤科,廣東 湛江 524000)

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一,中晚期患者預后較差,研究其相關(guān)機制具有重要意義,胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及多基因、多分子參與,微小RNA(miR)是真核生物單鏈非編碼RNA,通過對靶基因表達調(diào)控參與腫瘤的惡性進展,miR參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。miR-127-3p在胃癌〔1〕、肝癌〔2〕、非小細胞肺癌〔3〕等腫瘤中低表達,其異常表達與腫瘤侵襲、遷移及耐藥性有關(guān)。研究顯示〔4〕,miR-127-3p通過靶向整合素亞基-α(ITGA)6抑制骨肉瘤細胞生長與侵襲。但是miR-127-3p在胃癌發(fā)生和發(fā)展中的潛在作用機制尚不清楚。含SET結(jié)構(gòu)域賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(SETD)8是一種單一的賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶,屬于組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族,參與細胞周期調(diào)控、DNA損傷修復、蛋白翻譯修飾等過程〔5〕。研究顯示,SETD8在胰腺癌、骨肉瘤中高表達,與腫瘤生成與發(fā)展有關(guān),且在骨肉瘤細胞中過表達miR-127-3p可通過靶向抑制SETD8表達,抑制細胞增殖、遷移與侵襲〔6,7〕。miR-127-3p對胃癌細胞惡性行為的影響尚不清楚,本研究觀察miR-127-3p對胃癌細胞惡性行為的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1標本來源 選擇2014年1月1日至2019年1月1日經(jīng)手術(shù)切除胃癌患者的術(shù)后病理組織(胃癌組織)標本及癌旁組織各150例,患者術(shù)前未經(jīng)任何抗腫瘤治療,qRT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測胃癌組織及癌旁組織中miR-127-3p表達水平。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2動物與主要試劑 BALB/c雌性裸鼠〔4～6周齡,許可證號SCXK(閩)2018-0003〕購自廈門大學實驗動物中心。人胃癌細胞(MGC-803、SGC7901、MKN-45、AGS)及人胃上皮細胞GES1購于中國科學院細胞庫;胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液(美國Gibco);Trizol試劑、噻唑藍(MTT)試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(R110、M1020、D0010,Solarbio);miR-127-3p模擬物(miR-127-3p mimics)及對照(miR-NC)、過表達或抑制SETD8質(zhì)粒(SETD8、si-SETD8)、空載質(zhì)粒(pcDNA)及對照(si-NC)及相應(yīng)引物(上海GenePharma);Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑、RIPA細胞裂解液、兔抗人SETD8多抗(C0526、P0013B、AF7971,Beyotime);兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9單抗、MMP-2多抗(E-AB-70247、E-AB-32054,Elabscience)。

1.3細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 GES1、SGC7901、AGS、MKN-45、MGC-803細胞使用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng),培養(yǎng)48 h時檢測細胞中miR-127-3p表達水平。取對數(shù)期SGC7901細胞接種于6孔板中,細胞融合度為75%左右進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒濃度為50 nmol/L,將SGC7901細胞分為Control組、miR-NC組、miR-127-3p mimics組、si-NC組、si-SETD8組、miR-127-3p mimics+pcDNA組和miR-127-3p mimics+SETD8組,Control組不做轉(zhuǎn)染,其他組轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒,每組設(shè)置6個復孔,轉(zhuǎn)染48 h,檢測細胞中miR-127-3p及SETD8表達水平,檢驗是否轉(zhuǎn)染成功。

1.4雙熒光素酶報告基因檢測實驗 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預測發(fā)現(xiàn),miR-127-3p可與SETD8基因靶向結(jié)合。SGC7901細胞接種至6孔板中培養(yǎng)24 h,將野生型wt-SETD8 3′非翻譯區(qū)(UTR,野生型)與mut-SETD8 3′UTR(突變型)質(zhì)粒分別與miR-NC、miR-127-3p mimics共轉(zhuǎn)染SGC7901細胞48 h,分別檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.5qRT-PCR實驗檢測miR-127-3p、SETD8 mRNA水平 Trizol法提取GC組織、癌旁組織及細胞中總RNA,參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA,加入SYBR green染料進行qRT-PCR擴增,采用2-ΔΔCt法計算miR-127-3p、SETD8 mRNA相對表達量。引物序列(5′-3′):miR-127-3p上游引物:GGAAGATCTGTAGTCCTGTCTGTTGGTCAG,下游:CCCAAGCTTCCTGAAGAACTGCTTCCGCC;U6上游引物:CTCGCTTCGGCAGCACA,下游:CTCGCTTCGGCAGCACA;SETD8上游引物:GAAGAGAAAAGAAATGCTGGGAACG,下游:GGTGGAATCACAAGATGAGGGTGGA;β-actin上游引物:CTGCTATGTTGCTCTAGACTTCC,下游:ATGCCACAGGATTCCATACC。

1.6細胞增殖 將轉(zhuǎn)染后各組細胞按照4×104個接種至96孔板中,MTT法分別檢測24、48、72 h時的490 nm處吸光度(OD)值。

1.7細胞遷移 轉(zhuǎn)染后,將SGC7901細胞在6孔板中培養(yǎng),細胞融合至70%～80%時,使用20 μl移液管劃痕,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌分離的細胞,培養(yǎng)24 h后,顯微鏡觀察劃痕愈合情況。

1.8細胞侵襲 基質(zhì)膠使用無血清培養(yǎng)基稀釋后,取100 μl加入Transwell小室(8.0 μm孔徑)上室,待膠干后,上室加入無血清培養(yǎng)基稀釋的SGC7901細胞懸液,下室添加配制好的完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h,結(jié)晶紫染色,顯微鏡觀察侵襲細胞數(shù)。

1.9Western印跡實驗 離心收集轉(zhuǎn)染后各組SGC7901細胞,RIPA裂解液裂解,12 000 r/min離心收集蛋白,電泳后轉(zhuǎn)膜,分別加入一抗、二抗孵育,電化學發(fā)光(ECL)放大顯色,ImageJ 軟件分析各蛋白表達。

1.10裸鼠移植瘤實驗 將Control組及轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-127-3p mimics質(zhì)粒的SGC7901細胞稀釋成5×106個/ml的細胞懸液,于裸鼠右前肢腋下接種200 μl,每組6只,第21天脫頸處死小鼠,分離瘤體,測量體積并稱質(zhì)量,檢測瘤體miR-127-3p、SETD8中表達。

1.11統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0及GraphPad Prism8.0軟件進行t檢驗、方差分析、Pearson相關(guān)分析及SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1miR-127-3p在胃癌組織與細胞中表達下調(diào) qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,胃癌組織中miR-127-3p表達水平顯著低于癌旁組織,SETD8 mRNA表達水平顯著高于癌旁組織(均P<0.05),見表1。經(jīng)相關(guān)性分析顯示,胃癌組織中miR-127-3p、SETD8 mRNA表達水平呈負相關(guān)(r=-0.553,P<0.05)。與GES1細胞(1.00±0.09)相比,miR-127-3p在胃癌細胞SGC7901、AGS、MKN-45、MGC-803表達(0.21±0.04、0.65±0.07、0.37±0.05、0.55±0.06)顯著下調(diào)(均P<0.05),miR-127-3p在SGC7901細胞中表達水平最低,故選擇SGC7901細胞。

表1 miR-127-3p、SETD8 mRNA在胃癌組織中表達

2.2miR-127-3p與SETD8靶向驗證 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫進行生物信息學分析,如圖1所示,SETD8是miR-127-3p的潛在靶基因。雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示,wt-SETD8 3′UTR與miR-127-3p mimics共轉(zhuǎn)染SGC7901細胞的相對熒光素酶活性(0.31±0.04)顯著低于野生型wt-SETD8 3′UTR質(zhì)粒與miR-NC共轉(zhuǎn)染細胞(1.00±0.08,P<0.05)。

圖1 miR-127-3p與SETD8靶向結(jié)合位點預測

2.3miR-127-3p上調(diào)表達抑制SGC7901細胞增殖、遷移、侵襲及SETD8表達 MTT檢測顯示,miR-127-3p mimics組較miR-NC組在24、48、72 h對SGC7901細胞增殖均有明顯抑制作用(P<0.05);劃痕愈合實驗與Transwell小室結(jié)果顯示,miR-127-3p mimics組較miR-NC組劃痕愈合率、細胞侵襲數(shù)顯著降低(P<0.05);Western印跡結(jié)果顯示,miR-127-3p mimics組較miR-NC組SETD8、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。與miR-NC組比較,miR-127-3p mimics組miR-127-3p表達水平顯著升高,SETD8 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)。見表2、圖2、表3、圖3。

表2 miR-127-3p上調(diào)抑制SGC7901細胞增殖

圖2 miR-127-3p上調(diào)表達對SGC7901細胞侵襲、遷移的影響(結(jié)晶紫染色)

表3 miR-127-3p上調(diào)表達對SGC7901細胞增殖、遷移、侵襲及SETD8表達的影響

圖3 miR-127-3p上調(diào)表達對SGC7901細胞SETD8、MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響

2.4SETD8下調(diào)表達抑制SGC7901細胞增殖、遷移及侵襲 SGC7901細胞轉(zhuǎn)染si-SETD8質(zhì)粒后,MTT檢測顯示,si-SETD8組較si-NC組在24、48、72 h對SGC7901細胞增殖均有明顯抑制作用(P<0.05);劃痕愈合實驗與Transwell小室結(jié)果顯示,si-SETD8組較si-NC組劃痕愈合率、細胞侵襲數(shù)顯著降低(P<0.05);Western印跡結(jié)果顯示,si-SETD8組較si-NC組SETD8、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),Control組和si-NC組上述指標差異不顯著(P>0.05),見圖4、圖5、表4。

1～6:Control組、si-NC組、si-SETD8組、miR-127-3p mimics組、miR-127-3p mimics+pcDNA組、miR-127-3p mimics+SETD8組圖4 SETD8下調(diào)或過表達對SGC7901細胞SETD8、MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響

圖5 SETD8下調(diào)或過表達對SGC7901細胞遷移、侵襲的影響

表4 SETD8下調(diào)表達抑制SGC7901細胞增殖、遷移及侵襲

2.5過表達SETD8與過表達miR-127-3p對SGC7901細胞的影響 MTT檢測顯示,miR-127-3p mimics+SETD8組較miR-127-3p mimics+pcDNA組在24、48、72 h的SGC7901細胞增殖活性顯著增加(P<0.05);劃痕愈合實驗與Transwell小室結(jié)果顯示,miR-127-3p mimics+SETD8組較miR-127-3p mimics+pcDNA組劃痕愈合率、細胞侵襲數(shù)顯著升高(P<0.05);Western印跡結(jié)果顯示,miR-127-3p mimics+SETD8組較miR-127-3p mimics+pcDNA組SETD8、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),miR-127-3p mimics組和miR-127-3p mimics+pcDNA組上述指標差異不顯著(P>0.05),見圖4、圖5、表5。

表5 過表達miR-127-3p與SETD8對SGC7901細胞、遷移及侵襲的影響

2.6miR-127-3p上調(diào)表達抑制裸鼠移植瘤生長 與miR-NC組比較,miR-127-3p mimics裸鼠移植瘤質(zhì)量與瘤體體積顯著降低,miR-127-3p表達水平顯著升高,SETD8 mRNA及蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),見表6、圖6。

表6 miR-127-3p上調(diào)表達對裸鼠移植瘤生長及miR-127-3p、SETD8表達的影響

圖6 miR-127-3p上調(diào)表達對移植瘤SETD8表達的影響

3 討 論

miRNAs可參與腫瘤細胞的多種生物學過程,如腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移或耐藥性等過程,在腫瘤的惡性進展中發(fā)揮重要作用,miR-127-3p為與腫瘤密切相關(guān)的miRNAs分子之一,在肝癌、食管鱗狀細胞癌、乳腺癌、腎癌等多數(shù)腫瘤中表達下調(diào),參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移,發(fā)揮抑癌基因的作用〔8～10〕。研究顯示〔11〕,miR-127-3p在口腔鱗狀細胞癌(OSCC)中表達下調(diào),上調(diào)miR-127-3p表達可靶向調(diào)控驅(qū)動蛋白家族成員(KIF)3B表達抑制OSCC細胞增殖與遷移。另有研究顯示〔12〕,在葡萄膜黑色素瘤細胞中,上調(diào)miR-127-3p表達可通過調(diào)節(jié)相關(guān)通路抑制細胞的惡性生物學行為。本研究顯示,在胃癌組織與細胞中miR-127-3p表達下調(diào),與先前報道一致。MMP-2、MMP-9是參與細胞外基質(zhì)代謝的最主要的蛋白水解酶類,與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果提示,miR-127-3p在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑癌作用。

SETD8(又稱PR-SET7或KMT5a)是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶,參與細胞周期調(diào)控、侵襲和DNA損傷,SETD8還可通過甲基化調(diào)控基因表達與蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾,研究顯示,SETD8在肝癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、乳腺癌等腫瘤中表達上調(diào),與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔13～15〕。上調(diào)miR-384可抑制SETD8表達顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲〔16〕。研究顯示〔17〕,SETD8在胃腺癌中上調(diào)表達,與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、臨床分期、癌癥干細胞相關(guān)基因有關(guān)。本研究結(jié)果表明,抑制SETD8表達可抑制SGC7901細胞惡性行為,而上調(diào)SETD8可部分逆轉(zhuǎn)過表達miR-127-3p對SGC7901細胞惡性行為的影響。

綜上,在胃癌組織與細胞中miR-127-3p表達下調(diào),上調(diào)miR-127-3p表達抑制SETD8表達而抑制胃癌生長。二者的具體調(diào)控機制仍需結(jié)合動物模型進一步研究。