龐雅平 韓梅 董帥 姜蘭葉

(河北北方學院附屬第二醫(yī)院 1內(nèi)分泌科,河北 張家口 075100;2手術(shù)室;3急診科)

2型糖尿病合并高血壓對心腦血管的危害有協(xié)同效應,其中高血壓極有可能誘發(fā)糖尿病心腦血管和微血管并發(fā)癥〔1,2〕。臨床上2型糖尿病合并高血壓患者多伴隨發(fā)生心腦血管疾病,并伴有視網(wǎng)膜病變、腎臟病變的發(fā)生與發(fā)展,患者大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能也會發(fā)生異常,腦卒中的風險也顯著增加〔3,4〕。鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白(SGLT)-2抑制劑阻滯腎臟重吸收葡萄糖進程,使尿液中含過量的葡萄糖,從而降低其在血液中的濃度,是一類新型抗糖尿病藥物〔5,6〕。研究表明,SGLT-2抑制劑能有效控制糖尿病患者的血糖水平,對其腎臟和心血管系統(tǒng)具有顯著的保護作用,并降低腎損傷和不良事件的發(fā)生率〔7,8〕,但其是否能對2型糖尿病合并高血壓患者發(fā)揮干預作用尚不清晰。核因子-E2相關(guān)因子(Nrf)2/血紅素氧合酶(HO)-1信號通路在糖尿病并發(fā)癥中具有多重作用,可以通過核因子(NF)-κB介導的睪丸凋亡和炎癥對糖尿病誘導的大鼠生殖損傷的保護作用〔9〕,其表觀遺傳修飾對糖尿病心血管并發(fā)癥具有調(diào)控作用〔10〕,但Nrf2/HO-1信號通路在2型糖尿病合并高血壓中的作用尚不清晰。本研究擬通過建立2型糖尿病合并高血壓大鼠模型,探討SGLT-2抑制劑通過Nrf2/HO-1信號通路對基底動脈重構(gòu)發(fā)揮的干預作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選擇北京科興中維生物技術(shù)有限公司提供的SPF級雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)40 只和SHR遺傳背景相同的 Wistar-Kyoto(WKY)大鼠15只,均為7～8周齡,平均體質(zhì)量(220±20)g,使用許可〔SYXK(京)2020-0054〕,飼養(yǎng)大鼠的溫濕度分別為(25±2)℃和(50±5)%,光照間隔12 h。待大鼠適應環(huán)境1 w后,進行試驗。

1.2主要試劑和儀器 鏈脲佐菌素(STZ)、蘇木素和伊紅購于美國Sigma公司;包埋劑(OCT)購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司;組織蛋白裂解液、十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺試劑盒均購于江蘇碧云天有限公司;戊巴比妥鈉(99%,規(guī)格100 g)購于天津化學試劑研究所有限公司;血糖儀購于美國Jhonson醫(yī)療器械有限公司;實驗動物手術(shù)器械購于玉研儀器公司;SYD-K2080切片機購于沈陽譽德電子儀有限公司;H07000FA型透射電子顯微鏡購于日本日立公司;Western印跡電泳儀購于美國Bio-Rad公司。

1.3大鼠模型建立 SHR高糖高脂飲食聯(lián)合STZ建立2型糖尿病合并高血壓大鼠模型,SHR高糖髙脂飼料喂養(yǎng)2 w,禁食12 h,腹腔一次性注射STZ 35 mg/kg,1 w后,空腹12 h,使用血糖儀大鼠尾血的血糖水平,造模成功標準為血糖≥16.7 mmol/L。造模成功后隨機選取30只大鼠分為模型組和試驗組各15只,另取與SHR遺傳背景相同的Wistar-Kyoto(WKY)大鼠15只為對照組,試驗組1 mg/(kg·d)達格列凈灌胃,模型組和對照組給予等量生理鹽水灌胃,8 w后進行檢測。

1.4大鼠基底動脈分離 腹腔注射5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,取仰臥位,打開腹腔后,經(jīng)左心室插管主動脈,剪開右心房,快速灌注含肝素(100 U/kg)生理鹽水5 min。然后灌注4 ℃ 4%多聚甲醛/PB溶液(Na2HPO4·12H2O 100 mmol/L,NaH2PO4·2H2O 100 mmol/L,pH7.4)15 min,開顱取腦,將基底動脈血管暴露出來。先用4%多聚甲醛固定血管,然后用石蠟包埋起來,再用竹簽輕輕磨掉剩余部分的內(nèi)皮,樣品置于-80 ℃冰箱中,待后面檢測。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色檢測基底動脈病理變化 石蠟切片機將石蠟包埋組織切成4 μm厚度片狀,60 ℃烘箱5 min;二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ依次脫蠟20 min和10 min,1/2二甲苯+1/2無水乙醇-100%-95%-85%-70%-50%乙醇各1 min,自來水沖洗15 s;蘇木素染色5 min,自來水沖洗1 min,切片變藍;1%鹽酸乙醇分化10 s,自來水沖洗1 min;1%稀氨水返藍10 s,自來水洗1 min;伊紅染色1 min,自來水洗30 s;再依次使用不同濃度的乙醇脫水1 min,95%乙醇漂色1 min,無水乙醇脫水5 min,最終依次放在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各3 min,在顯微鏡下觀察中性樹膠封片。

1.6免疫熒光檢測核增殖指數(shù)(Ki67)表達水平 用冰凍切片機將大鼠的包埋組織切成6 μm厚度切片,使用60 ℃高溫去除OCT,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次,5 min/次;經(jīng)0.1%TritonX-100透膜5 min,用PBS洗3次,5 min/次;經(jīng)5%牛血清白蛋白(BSA)封閉切片0.5 h后,甩干,4 ℃下,在切片中加入一抗anti-Ki67(1 μg/ml,ab15580,Abcam,英國),肌動蛋白α抗體(1 μg/ml,ab7817,Abcam,英國)過夜反應,然后用PBS洗3次,5 min/次;室溫下在切片上滴加二抗,避光孵育1 h然后用PBS洗3次,5 min/次,應用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.7透射電鏡觀察大鼠基底動脈超微結(jié)構(gòu) 各組大鼠開顱取腦后取出含腦基底動脈血管在內(nèi)的3 mm厚的腦組織,在4 ℃條件下,電鏡固定液中固定12 h,用PBS洗3次,5 min/次;4 ℃下,使用鋨酸后固定1.5 h,用PBS洗3次,5 min/次;濃度遞增的乙醇-無水丙酮脫水10 min;Epon812包埋劑進行包埋,使用超薄切片機切片,厚度為80 μm,并采用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色,應用H07000FA型透射電子顯微鏡觀察組織的超微結(jié)構(gòu)。

1.8Western印跡檢測大鼠Nrf2和HO-1 蛋白表達水平 基底動脈組織置于液氮中研磨至勻漿,提取總蛋白,采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。加SDS的蛋白上樣緩沖液(×5)并煮沸,分裝保存于-80 ℃冰箱備。樣品放置在不同泳道中,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,濃縮膠電壓設置為80 V,分離膠電壓設置為120 V,轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜后,用5%BSA封閉。加入1∶1 000特異性一抗Anti-Nrf2抗體(ab92946,Abcam,英國),1∶10 000 HO-1(ab68477,Abcam,英國),1∶2 000 GAPDH(sc-47724,Santa Cruz,美國),并在4 ℃冰箱中過夜反應。TBST洗膜3次后,加入1∶5 000特異性的羊抗兔二抗,孵育1 h。繼續(xù)使用TBST洗膜3次,采用電化學發(fā)光(ECL)液曝光顯影,半定量分析通過Photoshop圖像分析軟件系統(tǒng)進行。

1.9統(tǒng)計學處理 采用SPSS23.0軟件進行Student-t檢驗,各時間點的比較采用重復測量方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組血糖比較 如表1所示,建模成功后給抑制劑前,模型組和試驗組空腹血糖差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但均顯著高于對照組(P<0.05);給抑制劑8 w后,試驗組空腹血糖顯著低于模型組,但仍明顯高于對照組(P<0.05)。

2.2各組Ki67表達水平比較 如表1、圖1所示,與對照組相比,模型組和試驗組Ki67表達顯著增加(P<0.05),試驗組Ki67表達明顯低于模型組(P<0.05)。

圖1 各組基底動脈Ki67表達(免疫熒光,×200)

2.3大鼠基底動脈Nrf2和HO-1蛋白表達 如表1、圖2所示,與對照組相比,模型組基底動脈Nrf2和HO-1蛋白表達顯著降低(P<0.05);與模型組相比,試驗組Nrf2和HO-1蛋白表達顯著上升,但仍明顯低于對照組(P<0.05)。

表1 各組血糖、Ki67表達水平及Nrf2、HO-1蛋白表達比較

圖2 各組基底動脈Nrf2和HO-1蛋白表達

2.4各組基底動脈病理比較 如圖3所示,與對照組相比,模型組基底動脈血管壁厚管腔內(nèi)徑管腔外徑和中膜面積均明顯增加,試驗組基底動脈血管壁厚管腔內(nèi)徑管腔外徑和中膜面積相對于模型組有所降低,但仍高于對照組。

圖3 各組基底動脈病理(HE染色,×400)

2.5各組基底動脈超微結(jié)構(gòu)比較 如圖4所示,對照組細胞排列整齊有序,結(jié)構(gòu)良好且完整,模型組細胞排列紊亂,線粒體出現(xiàn)空泡,部分甚至出現(xiàn)腫脹和嵴斷裂,膠原纖維量增加。試驗組細胞的超微結(jié)構(gòu)得到改善,細胞排量相對整齊,線粒體空泡化較少,膠原纖維減少。

圖4 各組基底動脈超微結(jié)構(gòu)(×200)

3 討 論

2型糖尿病合并高血壓是一種慢性疾病,患者臨床特征為高血糖、相對缺乏胰島素、胰島素抵抗等,經(jīng)常合并多種心腦血管、代謝和腎臟病,如高血壓、血脂異常和心力衰竭等,長期高血糖帶來的并發(fā)癥包括腦卒中、心臟病等,會產(chǎn)生大血管和微血管并發(fā)癥,對糖尿病患者的生活質(zhì)量有較大影響,已經(jīng)成為一個主要的公共衛(wèi)生問題〔11,12〕。SGLT-2是一種現(xiàn)代降糖藥物,除了糖尿病患者血糖控制和心血管保護方面的積極結(jié)果外,還與血壓降低和腎功能改善有關(guān),近年來在糖尿病患者中的應用有所增加。越來越多關(guān)于新型降糖藥的證據(jù)證明,SGLT-2與糖尿病相關(guān)的非靶向益處,尤其是對心腦血管和腎臟結(jié)局的顯著改善具有促進作用〔13,14〕。SGLT-2能夠持續(xù)適度但顯著地降低收縮壓和舒張壓,這是傳統(tǒng)降糖藥沒有針對性和觀察到的效果,除了這種降壓作用外對其他心臟代謝和腎臟參數(shù)也有多方面的有益影響,其臨床意義現(xiàn)在已經(jīng)超出了其降血糖作用,從而提供了一種新的正常策略,用于循證、以患者為中心的糖尿病護理方法〔15,16〕。本研究證實,SGLT-2抑制劑可以降低大鼠血糖水平,這與當前臨床隊列研究結(jié)果相一致;本研究結(jié)果提示,對基底動脈異常增殖的抑制作用,可能是心腦血管保護作用機制之一;同時本研究發(fā)現(xiàn),SGLT-2抑制劑降低了細胞損傷,減少了異常線粒體的出現(xiàn),降低了線粒體嵴斷裂,提示其具有更好的細胞代謝功能,由此推測SGLT-2抑制劑對基底動脈的保護作用可能在降低血糖的同時,干預細胞異常增殖,從而維護細胞正常代謝功能。

Nrf2/HO-1途徑是防御氧化應激的內(nèi)在機制,Nrf2作為一種轉(zhuǎn)錄因子可誘導大量細胞因子從而發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用〔17,18〕。研究表明,Nrf2/抗氧化物反應元件(ARE)通路的調(diào)控可以改善大鼠糖尿病相關(guān)的焦慮和抑郁樣行為〔19〕,也有研究證實,Nrf2表達及其下游靶點活化如HO-1、醌氧化還原酶(NQO)-1、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)和谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCLM)可抑制高糖誘導的Toll樣受體(TLR)4/核因子(NF)-κB軸活化,參與糖尿病腎病患者的血清鐵蛋白、乳酸脫氫酶(LDH)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和高遷移率族蛋白(HMG)B1水平升高,對糖尿病腎病發(fā)揮干預作用〔20〕。本研究結(jié)果提示,SGLT-2抑制劑對基底動脈重構(gòu)的保護作用可能是通過Nrf2/HO-1信號通路的抑制實現(xiàn)的。

綜上,SGLT-2抑制劑可以對2型糖尿病合并高血壓大鼠基底動脈重構(gòu)發(fā)揮干預作用。其機制可能與Nrf2/HO-1信號通路的調(diào)控相關(guān)。