孫楊 劉媛媛 隋月林 朱建忠 尹帥 趙燦 陳玲

(1滄州醫(yī)學高等?？茖W校解剖教研室,河北 滄州 061001;2河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院)

血管性癡呆(VD)是腦缺血-再灌注損傷的常見并發(fā)癥,臨床表現(xiàn)為學習記憶功能受損,嚴重影響患者生活質(zhì)量,但是目前VD的機制仍不完全明確〔1〕。自噬過程是細胞器或大分子蛋白被溶酶體降解過程,最新研究顯示,自噬的升高會影響VD海馬神經(jīng)元功能,而抑制自噬則可促進突觸再生〔2〕。自噬過程受到神經(jīng)生長因子(NGF)/神經(jīng)營養(yǎng)因子受體A型(TrkA)通路的調(diào)控,研究顯示,NGF/TrkA通路的升高能夠保護前角運動神經(jīng)元免受2,5-己二酮誘導的自噬損傷〔3〕。辣木葉可作為食物,有研究顯示,其具有抗氧化、提高記憶力、促進神經(jīng)元存活等作用,辣木葉發(fā)酵物的營養(yǎng)成分和抗氧化能力均升高〔4〕。

研究顯示,辣木葉發(fā)酵物能夠減輕同型半胱氨酸誘導的阿爾茨海默病動物模型的神經(jīng)損傷,保護學習、記憶功能〔5〕,然而,其是否對VD具有保護作用尚未見研究。本研究主要分析辣木葉發(fā)酵物對VD小鼠學習記憶能力的影響,并分析其對NGF/TrkA通路和海馬神經(jīng)元自噬的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 BALB/c小鼠〔SPF級,雄性,6～8周齡,體質(zhì)量(20±2)g,河北醫(yī)科大學實驗動物中心,合格證:醫(yī)動字第04057號〕。莫里斯水迷宮(XR-XM101,上海新軟信息技術(shù)有限公司,中國)。蘇木素-伊紅(HE)試劑盒(碧云天公司,中國)。Trizol試劑(Aidlab公司)。RNAspin Mini試劑盒(GE Healthcare,美國)。BestarTM熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)試劑盒(DBI Bioscience公司,德國)?？贵w、一抗和山羊抗免疫球蛋白G(IgG)二抗(1∶1 000稀釋,#ab6721,Abcam公司,美國)。聚偏氟乙烯膜(EMD Millipore,美國)。電化學發(fā)光(ECL)顯色試劑盒(Thermo Fisher公司,美國)。顯微鏡(Carl Zeiss公司,德國)。

1.2小鼠分組 150只小鼠隨機分為對照組、VD組、辣木葉發(fā)酵物低、中、高劑量組各30只。根據(jù)參考文獻〔6〕,通過Himori法構(gòu)建VD模型:小鼠通過腹腔注射戊巴比妥(1%,20 g/L,2 ml/kg)麻醉,仰臥固定后暴露雙側(cè)頸動脈,利用栓線阻斷雙側(cè)頸總動脈10 min,然后再灌注24 h。通過水迷宮實驗檢測目標象限停留時間<20 s且穿越平臺次數(shù)<4次為建模成功。對照組小鼠僅暴露雙側(cè)頸動脈。辣木葉發(fā)酵物低、中、高劑量組根據(jù)參考文獻〔7〕制備辣木葉發(fā)酵物并灌胃,劑量分別為100、200、400 mg/kg,1次/d,連續(xù)28 d。對照組及VD組每日等體積雙蒸水灌胃。

1.3水迷宮實驗 實驗前準備:將水迷宮(1.6 m×1.6 m × 40 cm)放在一個安靜、無干擾的房間中,水位〔水溫(25±1)℃〕通常設(shè)置在迷宮的一半位置。在迷宮的一個入口處放置一個臺子,用來讓動物跳入水中。訓練階段:在入口處放入動物就喜歡的獎勵(小塊食物),然后將動物放在迷宮中的一個位置,并讓它們尋找出口。當動物到達目標區(qū)域時,會發(fā)現(xiàn)隱藏的獎勵并獲得食物獎勵。通常需要多次訓練,直到動物熟悉迷宮結(jié)構(gòu)并且能夠正確地找到出口。記憶測試:在訓練完成后,去掉水迷宮中的獎勵,讓動物再次跳入水中并尋找出口位置。通過觀察動物是否能夠記得迷宮結(jié)構(gòu)并正確地找到出口位置來測試它們的空間記憶和學習能力。

1.4HE染色 海馬組織在10%中性緩沖甲醛溶液中固定24 h,包埋在最佳切割溫度溶液中并在矢狀面上切片。5 μm厚的切片在遞減的乙醇梯度中水合后,切片均脫石蠟并在37 ℃下用蘇木素溶液染色5 min。倒置光學顯微鏡觀察。

1.5RT-qPCR 使用Trizol試劑盒提取海馬組織的總RNA,并進行逆轉(zhuǎn)錄,生成cDNA。SYBR Green試劑用于qPCR擴增,反應條件為:95 ℃ 2 min,94 ℃ 20 s,58 ℃ 20 s,72℃ 2 s,40個循環(huán),最后在72 ℃下延伸4 min。使用2-ΔΔCt方法將微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈(LC)3、Beclin1、NGF和TrkA mRNA相對于GAPDH標準化。

1.6Western印跡 海馬組織的裂解液通過100 μl裂解液體+1 μl蛋白酶抑制劑+1 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)獲得。離心(12 000 r/min,4 ℃,15 min)后,將上清液收集到另一個1.5 ml的EP管中。將2.5 μl樣品加入22.5 μl超純水中通過二喹啉甲酸(BCA)來測量蛋白質(zhì)濃度。8%～12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)用于分離。分別加入1∶800稀釋的LC3、Beclin1、NGF和TrkA一抗(4 ℃,過夜),然后將其與二抗(1∶2 000)在37 ℃下孵育 2 h。采用ECL和IPP6.0進行印跡可視化,相對表達量通過內(nèi)參GAPDH得到。

1.7統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1辣木葉發(fā)酵物對VD小鼠學習記憶功能的影響 VD組目標象限停留時間和穿越平臺次數(shù)顯著低于對照組(P<0.05);辣木葉發(fā)酵物低劑量組目標象限停留時間和穿越平臺次數(shù)顯著高于VD組(P<0.05);辣木葉發(fā)酵物中劑量組目標象限停留時間和穿越平臺次數(shù)顯著高于辣木葉發(fā)酵物低劑量組(P<0.05);辣木葉發(fā)酵物高劑量組目標象限停留時間和穿越平臺次數(shù)顯著高于辣木葉發(fā)酵物中劑量組(P<0.05),且基本恢復至對照組水平。見表1。

表1 各組水迷宮實驗比較

2.2辣木葉發(fā)酵物對VD小鼠海馬組織損傷的影響 在細胞結(jié)構(gòu)上,對照組海馬神經(jīng)元具有清晰的形態(tài),細胞核大小適中且圓形,位于細胞的中央。相比之下,VD組海馬神經(jīng)元呈現(xiàn)核凝聚、空泡化及炎癥細胞浸潤現(xiàn)象。而接受辣木葉發(fā)酵物低劑量處理的組別中,核凝聚和空泡化現(xiàn)象有所緩解,相較VD組表現(xiàn)更加良好。辣木葉發(fā)酵物中劑量組的核凝聚、空泡化情況顯著減少。辣木葉發(fā)酵物高劑量組海馬組織神經(jīng)元基本恢復,僅有少量空泡化。見圖1。

圖1 辣木葉發(fā)酵物對VD小鼠海馬組織損傷的影響(HE染色,×400)

2.3辣木葉發(fā)酵物對VD小鼠海馬神經(jīng)元自噬水平的影響 VD組LC3、Beclin1 mRNA及蛋白表達量顯著高于對照組(P<0.05)。辣木葉發(fā)酵物低劑量組LC3、Beclin1 mRNA及蛋白表達顯著低于VD組(P<0.05);辣木葉發(fā)酵物中劑量組LC3、Beclin1 mRNA及蛋白表達顯著低于辣木葉發(fā)酵物低劑量組(P<0.05);辣木葉發(fā)酵物高劑量組LC3、Beclin1 mRNA及蛋白表達顯著低于辣木葉發(fā)酵物中劑量組(P<0.05)。見圖2、表2。

2.4辣木葉發(fā)酵物對VD小鼠海馬神經(jīng)元中NGF/TrkA通路蛋白水平的影響 VD組NGF、TrkA mRNA及蛋白表達顯著低于對照組(P<0.05)。辣木葉發(fā)酵物低劑量組的NGF、TrkA mRNA及蛋白表達顯著高于VD組(P<0.05);辣木葉發(fā)酵物中劑量組NGF、TrkA mRNA及蛋白表達顯著高于辣木葉發(fā)酵物低劑量組(P<0.05);辣木葉發(fā)酵物高劑量組NGF、TrkA mRNA及蛋白表達顯著高于辣木葉發(fā)酵物中劑量組(P<0.05)。見圖2、表2。

1～5:對照組、VD組、辣木葉發(fā)酵物低劑量組、辣木葉發(fā)酵物中劑量組、辣木葉發(fā)酵物高劑量組圖2 Western印跡檢測各組LC3、Beclin1、NGF、TrKA表達蛋白

表2 辣木葉發(fā)酵物對VD小鼠海馬神經(jīng)元中LC3、Beclin1、NGF、TrkA mRNA及蛋白表達水平的影響

3 討 論

VD是由腦血管疾病引起的神經(jīng)性疾病,是全球第二大最常見的癡呆形式,患者往往表現(xiàn)出高級認知能力的嚴重損害〔8〕。VD的發(fā)病機制涉及膽堿能系統(tǒng)、氧化自由基產(chǎn)生、一氧化氮、興奮性氨基酸等多方面損傷,且與認知功能相關(guān)〔9〕。但是目前尚無治療VD的特效方法,尋找有效緩解VD患者學習記憶能力損傷的藥物具有重大臨床意義。

作為一種食物和天然藥物,辣木葉具多種生物學活性,包括抗糖尿病、抗感染、抗癌、抗缺血、抗瘧原蟲等〔10〕。發(fā)酵是用于增強豆類、谷物等植物性食品營養(yǎng)品質(zhì)的生物技術(shù)方法之一,發(fā)酵食品的營養(yǎng)價值早已得到認可,研究顯示,辣木葉發(fā)酵物對高膽固醇血癥大鼠的緩解作用明顯〔11〕。辣木葉具有抗氧化和神經(jīng)保護作用,如Adebayo等〔12〕研究顯示,長期食用辣木葉補充飲食可促進機體抗氧化能力并增強大鼠海馬的神經(jīng)認知及保護神經(jīng)功能。也有研究顯示,辣木葉可保護大腦免受實驗性尼古丁誘導的神經(jīng)行為障礙和小腦變性的影響〔13〕。Jaafaru等〔14〕研究也顯示,辣木葉能夠減輕過氧化氫誘導的人類神經(jīng)元損傷和凋亡,并有助于恢復神經(jīng)元的形態(tài)特征,但是關(guān)于辣木葉發(fā)酵物是否會緩解VD神經(jīng)損傷仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),辣木葉發(fā)酵物能夠有效改善VD小鼠神經(jīng)功能障礙,并且隨著劑量的升高,改善作用更加明顯。根據(jù)本研究結(jié)果和過往文獻,說明辣木葉發(fā)酵物能夠顯著改善VD小鼠的學習記憶功能,緩解海馬神經(jīng)元損傷。

自噬會被細胞所處的環(huán)境壓力誘導,氧化應激不但是VD的重要誘因,也是誘導自噬重要因素,細胞為維持細胞存活,會將細胞器、蛋白運送至溶酶體降解為小分子物質(zhì)并被重新利用,而過度的自噬不但會影響細胞的正常功能,還會引起神經(jīng)元凋亡〔15,16〕。研究顯示,VD中LC3、Beclin1等自噬蛋白升高,海馬神經(jīng)元的正常功能受到抑制〔17〕。神經(jīng)元的自噬水平和功能受到NGF/TrkA通路的調(diào)控,研究顯示,NGF/TrkA通路會調(diào)控神經(jīng)細胞中的自噬通量促進髓鞘碎片清除并加速神經(jīng)再生〔18〕。本研究結(jié)果顯示,辣木葉發(fā)酵物能夠有效促進NGF/TrkA通路并抑制自噬,并且隨著劑量的升高,促進作用更加明顯。研究顯示,辣木葉的結(jié)腸代謝物可通過細胞凋亡和自噬調(diào)控結(jié)腸癌細胞的存活〔19〕。根據(jù)本研究結(jié)果和文獻報道,提示辣木葉發(fā)酵物可能通過促進NGF/TrkA通路來抑制海馬神經(jīng)元中的自噬水平,從而促進神經(jīng)元的功能,進而保護VD小鼠的學習記憶功能。

綜上,辣木葉發(fā)酵物能夠保護VD小鼠學習記憶功能,促進海馬神經(jīng)元中NGF/TrkA通路并抑制自噬。然而,本研究結(jié)果雖然初步得到辣木葉發(fā)酵物保護VD小鼠神經(jīng)功能的機制可能與NGF/TrkA通路和自噬有關(guān),仍需體內(nèi)或體外實驗進行驗證;此外,辣木葉發(fā)酵物緩解VD的作用和安全性仍需要臨床研究證實。