黃彥峰 張麗鳳 黃永毅 龐文杰

(右江民族醫(yī)學(xué)院,廣西 百色 53000)

隨著全球人口老齡化進(jìn)程的加劇,人們對抗衰老功能食品的需求越來越大,抗衰老已成為研究領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。百香果又稱西番蓮、巴西果、雞蛋果,是西番蓮科(Passiflor aceae)植物果實(shí),有“果汁之王”的美譽(yù),是一種典型的藥食同源的高品質(zhì)水果,具有很高的藥用價值和食用價值〔1〕。國內(nèi)外對百香果化學(xué)成分研究較多,對其的果實(shí)、果汁、果皮、種籽都有研究,它們含有的化學(xué)成分主要為酚類、黃酮苷類、生物堿等,具有多種藥理活性〔2～4〕,但目前百香果果皮總黃酮對D-半乳糖所致衰老小鼠海馬的影響研究少有報道。Simirgiotis 等〔5〕研究發(fā)現(xiàn)百香果果皮中黃酮類化合物的含量是果肉(汁)的1.81 倍,豐富的生物活性成分使其具有抗炎、抗氧化、抗皮膚衰老、降血壓等作用〔6〕。黃酮類化合物可作為信號分子、衰老基因及信號通路延緩衰老。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),百香果果汁有較好的延緩衰老的作用。本文采用D-半乳糖建立衰老模型小鼠,探討百香果果皮總黃酮對衰老小鼠海馬的影響。為百香果的藥用開發(fā)及尋找延緩腦衰老的方法提實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要藥物及試劑 兔抗鼠B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)多克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)多克隆抗體均購于Bioss公司(貨號Bs0127r,Bs0032r),兔抗鼠半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3 多克隆抗體(購于Affinity公司,貨號AF7022);超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乙酰膽堿(ACh)、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)催化酶(MAO)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所(貨號分別為A001-3,A003-1,A105-1-1,A034-1-1);維生素C(國藥準(zhǔn)字H4103317,遂成藥業(yè)股份有限公司);D-半乳糖(solarbio公司,貨號301L052);百香果(廣西百色市售)。

1.2主要儀器與設(shè)備成像系統(tǒng)(日本OLYMPUS),圖像分析軟件(美國Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus),光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS),PAT-8M 小鼠避暗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司),酶標(biāo)儀(Tristar LB 941 德國),離心機(jī)(北京離心機(jī)廠)。

1.3百香果果皮總黃酮的提取〔7〕稱取百香果果皮粉末200 g→加70%乙醇3 000 ml→超聲波提取(提取時間2 h,提取溫度60 ℃,超聲功率為100 W)→ 減壓抽濾→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至200 ml即得母液(1 g/ml)。置于4 ℃冰箱保存,用時稀釋成相應(yīng)濃度。本實(shí)驗(yàn)以蘆丁為對照品,采用回歸方程計算百香果果皮總黃酮含量為2.938 mg/g。

1.4實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥 SPF級小鼠60只,雌雄各半,體質(zhì)量24～28 g,由右江民族醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供,合格證號:SCXK(湘)2019-0014。將小鼠隨機(jī)分為6組:空白組,模型組、陽性組(100 mg/kg維生素C)、百香果果皮總黃酮高(1.00 g/kg)、中(0.50 g/kg)、低(0.25 g/kg)組?？瞻捉M小鼠每日腹腔注射生理鹽水,其余小鼠每日腹腔注射D-半乳糖(500 mg/kg),腹腔注射的同時,空白組和模型組每日灌胃同體積蒸餾水,其余各組均灌胃同體積相應(yīng)劑量的藥液,小鼠均按0.1 ml/10 g的劑量給藥,每日1次,連續(xù)42 d。

1.5學(xué)習(xí)和記憶能力測試 避暗實(shí)驗(yàn)分為訓(xùn)練和正式兩個階段,給藥第40天進(jìn)行訓(xùn)練測試,訓(xùn)練時將小鼠頭背著洞口放入明室適應(yīng)3 min,暗室的避暗儀底部通36 V,50 Hz交流電,小鼠進(jìn)入暗室就會受電擊,正確的反應(yīng)是逃往明室,此過程為訓(xùn)練測試,以此反映的學(xué)習(xí)能力。24、48 h 后(給藥的第41、42天)分別對小鼠進(jìn)行測試,記錄5 min內(nèi)小鼠進(jìn)入暗室的次數(shù)(即為錯誤次數(shù)),第1次進(jìn)入暗室的時間(即避暗潛伏期),以此反映小鼠的記憶能力。

1.6生化指標(biāo)檢測 避暗實(shí)驗(yàn)結(jié)束后頸椎脫臼處死小鼠,剖腹取小鼠全腦組織加入9 倍體積的冰凍生理鹽水,制備10%的組織勻漿液,離心取上清液,用酶標(biāo)儀按照試劑說明書測定其吸光度,計算小鼠腦組織中SOD、MDA、ACH、MAO含量。

1.7觀察腦組織海馬區(qū)的病理形態(tài)學(xué)變化 取出腦組織在冰盒上剝離海馬組織,用10%甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察病理組織學(xué)改變。

1.8檢測海馬組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達(dá) 取1.7中蠟塊切片后放入檸檬酸修復(fù)液高壓修復(fù),清洗,加一抗工作液4 ℃過夜,第2天磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次,加二抗工作液,37 ℃孵育30 min,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染、分化、反藍(lán)。在顯微鏡下觀察,依據(jù)陽性免疫反應(yīng)判斷陽性細(xì)胞表達(dá),應(yīng)用計算機(jī)圖像處理系統(tǒng)及分析軟件進(jìn)行圖像分析。依據(jù)陽性免疫反應(yīng)的圖像選取陽性表達(dá)區(qū)域,以人機(jī)交互方式測定陽性免疫染色強(qiáng)度及面積,結(jié)果以平均光密度值表示。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1避暗實(shí)驗(yàn)測定百香果果皮總黃酮對衰老小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響 由表1可知,與空白組比較,模型組避暗潛伏期顯著縮短(P<0.01),錯誤次數(shù)明顯增加(P<0.05);與模型組比較,陽性組及百香果果皮總黃酮高、中、低組避暗潛伏期明顯延長(P<0.01),錯誤次數(shù)明顯減少(P<0.05)。表明在避暗實(shí)驗(yàn)中,百香果果皮總黃酮能改善衰老小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。

表1 避暗實(shí)驗(yàn)測定百香果果皮總黃酮對衰老小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響

2.2百香果果皮總黃酮對衰老小鼠腦組織SOD、MDA、MAO、ACH含量的影響 由表2可知,與空白組比較,模型組腦組織的SOD、ACH含量顯著下降(P<0.01),MDA、MAO含量顯著上升(P<0.01);與模型組比較,陽性組及百香果果皮總黃酮高、中、低組腦組織的SOD、ACH活力明顯上升(P<0.05,P<0.01),MDA、MAO含量顯著下降(P<0.01)。說明百香果果皮總黃酮可能是通過提高小鼠腦組織的SOD、ACH活力,降低MDA、MAO含量而發(fā)揮抗衰老作用。

2.3百香果果皮總黃酮對衰老小鼠海馬組織Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)的影響 由表2、圖1～3可知,與空白組比較,模型組海馬區(qū)Bax、Caspase-3 陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增加(P<0.05),Bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)明顯下降(P<0.05);與模型組比較,除百香果果皮總黃酮低組Caspase-3差異無統(tǒng)計學(xué)意義外,陽性組及百香果果皮總黃酮高、中、低組海馬組織上述指標(biāo)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。表明百香果果皮總黃酮能減少海馬區(qū)細(xì)胞死亡的數(shù)量,改善衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力,可能與上調(diào)Bcl-2 陽性細(xì)胞表達(dá)、下調(diào)Bax、Caspase-3 陽性細(xì)胞表達(dá)有關(guān)。

表2 百香果果皮總黃酮對衰老小鼠腦組織SOD、MDA、MAO、ACH含量及組織Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)的影響

圖1 百香果果皮總黃酮對衰老小鼠腦組織海馬區(qū)Bax的表達(dá)(HE染色,×400)

2.4百香果果皮總黃酮對衰老小鼠腦組織海馬區(qū)病理形態(tài)學(xué)的影響 由圖4可知,空白組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞整體形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊,染色均勻,無明顯凋亡及壞死,無空泡樣變性,無炎細(xì)胞浸潤。模型組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞損傷較嚴(yán)重,CA1區(qū)細(xì)胞排列紊亂,染色不均勻,出現(xiàn)明顯空泡狀結(jié)構(gòu),大量神經(jīng)元固縮,凋亡;出現(xiàn)少量炎細(xì)胞浸潤。與模型組比較,陽性組、百香果果皮總黃酮高、中、低組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞損傷較輕,CA1區(qū)細(xì)胞排列略顯紊亂,有少量空泡狀結(jié)構(gòu),少量神經(jīng)元固縮,凋亡;整體損傷較模型組減輕,無明顯炎細(xì)胞浸潤。神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)有改善,表明百香果果皮總黃酮對衰老小鼠腦組織海馬CA1 區(qū)細(xì)胞具有保護(hù)作用。

圖2 百香果果皮總黃酮對衰老小鼠腦組織海馬區(qū)Caspase-3的表達(dá)(HE染色,×400)

圖3 百香果果皮總黃酮對衰老小鼠腦組織海馬區(qū)Bcl-2的表達(dá)(HE染色,×400)

圖4 百香果果皮總黃酮對衰老小鼠腦組織海馬區(qū)病理形態(tài)學(xué)的影響(HE,染色×400)

3 討 論

衰老是機(jī)體各組織、器官功能隨年齡增加而發(fā)生的退行性變化,生理功能逐漸衰退,機(jī)體抵御外界傷害和恢復(fù)體內(nèi)平衡的能力都下降。目前,衰老的確切機(jī)制還不明確,存在多種學(xué)說,自由基學(xué)說是被科學(xué)家認(rèn)可的衰老學(xué)說之一。自由基學(xué)說認(rèn)為機(jī)體內(nèi)的抗氧化防御與自身產(chǎn)生的自由基在正常生理?xiàng)l件下維持相對平衡,而機(jī)體衰老過程會產(chǎn)生超出機(jī)體抗氧化能力大量自由基,使體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和機(jī)體的抗氧化防御之間產(chǎn)生不平衡,這被稱為氧化應(yīng)激,可導(dǎo)致細(xì)胞受損甚至死亡,同時氧化應(yīng)激還會隨著衰老而加重〔8～10〕。SOD 是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶,能夠清除機(jī)體內(nèi)多余自由基〔11〕。MDA 是體內(nèi)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物,常作為評價細(xì)胞和器官衰老的重要指標(biāo)〔12〕。大腦組織需氧量大,抗氧化能力弱且對氧化應(yīng)激損傷較敏感,會隨著機(jī)體衰老程度對氧化應(yīng)激損傷敏感性增強(qiáng)〔13〕,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示百香果果皮總黃酮能有效提高衰老小鼠體內(nèi)抗氧化酶含量,減弱因自由基增多而發(fā)生氧化應(yīng)激,延緩機(jī)體衰老進(jìn)程。

衰老常伴學(xué)習(xí)和記憶能力的下降,學(xué)習(xí)是神經(jīng)系統(tǒng)接受外界環(huán)境改變而獲得新行為、經(jīng)驗(yàn)的過程,記憶是學(xué)習(xí)后經(jīng)驗(yàn)的識記、保持和再現(xiàn),因此學(xué)習(xí)和記憶是有聯(lián)系的神經(jīng)過程,有賴于全腦功能的整合〔14〕。ACH是膽堿能系統(tǒng)重要的神經(jīng)遞質(zhì),隨年齡的增長其含量會下降,大腦組織中ACH 含量高可增強(qiáng)學(xué)習(xí)與記憶能力〔15〕。MAO廣泛存在于肝、腎、腦等組織中,體內(nèi)含量升高可提升體內(nèi)H2O2濃度,對大腦海馬神經(jīng)元造成損傷,導(dǎo)致大腦的學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知功能有不同程度的減退〔16〕。目前建立記憶損傷模型方法較多,但避暗實(shí)驗(yàn)是最常用的動物學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)方法。本實(shí)驗(yàn)提示百香果果皮總黃酮能提高衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力,干預(yù)衰老進(jìn)程。學(xué)習(xí)記憶以神經(jīng)元為物質(zhì)基礎(chǔ),海馬的結(jié)構(gòu)及功能跟學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān),海馬神經(jīng)元衰老或丟失嚴(yán)重影響學(xué)習(xí)與記憶能力。細(xì)胞凋亡在腦的發(fā)育過程起重要的作用。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞因子很多,其中抗凋亡基因(如Bcl-2)和促凋亡基因(如Bax)是這個家族中的重要成員。Bax表達(dá)過量,形成同源二聚體Bax/Bax,可促進(jìn)細(xì)胞凋亡;Bcl-2表達(dá)過量,形成異源二聚體Bcl-2/Bax,可促進(jìn)細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖,從而抑制細(xì)胞凋亡〔17〕。Caspase-3 是 Caspase下游關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶,在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用〔18〕。本文結(jié)果提示百香果果皮總黃酮能通過促進(jìn)細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,能拮抗D-gal 所致衰老小鼠海馬損傷,從而延緩海馬衰老。

綜上所述,百香果果皮總黃酮能改善衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,能減輕衰老小鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng),能改善海馬組織CA1 區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)、抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡,推測其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激及上調(diào)Bcl-2 、下調(diào)Bax及Caspase-3 表達(dá)有關(guān)。具體的抗衰老作用機(jī)制,還需要進(jìn)一步研究。