姜巖松 趙志國 張冰心 楊強 白吉明

(承德市中心醫(yī)院 1檢驗科,河北 承德 067000;2輸血科;3甲乳直腸外科)

甲狀腺癌是臨床上最常見的內(nèi)分泌腫瘤。調查顯示,甲狀腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,這可能與診斷技術的不斷發(fā)展有關〔1〕。大多數(shù)甲狀腺癌患者經(jīng)治療后均可痊愈,死亡率很低,但是間變性甲狀腺癌的死亡率高達90%〔2〕。間變性甲狀腺癌十分罕見,約占甲狀腺惡性腫瘤的2%。常見的甲狀腺惡性腫瘤為甲狀腺乳頭狀癌、濾泡狀癌,分別占79%、13%〔3〕。非編碼RNA是一種在基因合成過程中產(chǎn)生的長短不一的單鏈核酸片段,包括200 個核酸以上的長鏈非編碼RNA、18～22個核酸的短鏈微小RNA和環(huán)狀RNA等,其中微小(mi)RNA是最先發(fā)現(xiàn)腫瘤調控非編碼RNA〔4,5〕。如今,miRNA通過調控靶基因的轉錄、翻譯過程參與調控多種癌癥的進展作用已得到普遍認可,但是仍有部分新發(fā)現(xiàn)的miRNA的功能仍有待進一步探究。 miR-361-3p是甲狀腺癌中新發(fā)現(xiàn)的miRNA,其功能研究仍處于初步探索階段。

S100A6是S100鈣結合蛋白家族成員,位于人類染色體1q21,該染色體經(jīng)常發(fā)生異常,可導致人類的多種疾病(先天性智力低下、畸形、心臟病等)〔6～8〕。已有研究證明,S100A6促進胃癌、肺癌、骨肉瘤和胰腺癌細胞的上皮-間充質轉化、增殖和遷移侵襲〔9,10〕。本研究旨在探究 miR-361-3p通過靶向S100A6抑制在甲狀腺癌細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1材料 組織樣本來自承德市中心醫(yī)院2018年7月至2021年2月接收的30例甲狀腺癌切除術患者的癌組織及對應的癌旁組織?；颊呒凹覍倬炇鹬橥鈺?。人甲狀腺正常細胞Nthy-ori 3-1、甲狀腺癌細胞TPC-1、SW579和CAL-62均購自美國菌種保藏中心;逆轉錄定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)試劑盒購自北京康為世紀;細胞計數(shù)試劑盒(CCK)8購自日本同仁;Transwell小室購自美國Corning;5-乙炔基-2'-脫氧尿苷(EDU)細胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自日本TaKaRa。

1.2細胞培養(yǎng) Nthy-ori 3-1、TPC-1、SW579和CAL-62細胞均使用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,37 ℃、5%CO2的飽和濕度恒溫細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。隔天更換1次培養(yǎng)液。

1.3分組與轉染 將培養(yǎng)48 h的Nthy-ori 3-1、TPC-1、SW579和CAL-62細胞設為Nthy-ori 3-1、TPC-1、SW579和CAL-62組。取3倍量的脂質體將miR-con組、 miR-361-3p組、si-con組、si-S100A6組、 miR-361-3p+pcDNA組、 miR-361-3p+pcDNA-S100A6組轉染至CAL-62細胞,轉染10 h后更換新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。RT-qPCR、Western印跡法檢測轉染效率。

1.4RT-qPCR實驗 收集對數(shù)生長期細胞,Trizol液提取總RNA,并反轉錄為cRNA,-20 ℃保存,作為qPCR模板。按照qPCR試劑盒說明要求操作,檢測其中 miR-361-3p、S100A6的表達。以U6、GAPDH為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計算結果。 miR-361-3p(5′-3′)正向引物ATAAAGRGCRGACAGTGCAGATAGTG,反向TCAAGTACCCACAGTGCGGT;S100A6(5′-3′)正向引物AAGCTGCAGGATGCTGAAAT,反向CCCTTGAGGGCTTCATTGTA。U6(5′-3′)正向引物GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT,反向CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT;GAPDH(5′-3′)正向引物CGACCACTTTGTCAAGCTCA,反向ACTGAGTGTGGCAGGGACTC。循環(huán)條件為95 ℃下初始變性10 min,然后在95 ℃變性15 s,60 ℃退火1 min,進行40次循環(huán)。

1.5Western印跡實驗檢測 無菌研磨組織樣本,放射免疫沉淀(RIPA)裂解,提取總蛋白。對數(shù)生長期細胞用同樣的方法裂解,提取總蛋白。二喹啉甲酸(BCA)試劑盒定量,沸水浴變性。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉膜儀濕轉蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。轉膜后,用2.0%脫脂奶粉的封閉液37 ℃處理2 h。滴加稀釋的一抗溶液(兔抗S100A6多抗,1∶1 000)4 ℃冰箱孵育過夜。再滴加稀釋的二抗溶液〔辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗,1∶500〕,37 ℃溫箱孵育2 h。滴加電化學發(fā)光(ECL)液,顯色,曝光。ImageJ分析條帶的灰度值,用目的蛋白灰度與內(nèi)參蛋白灰度的比值表示蛋白水平。

1.6CCK8實驗 收集對數(shù)生長期miR-con組、 miR-361-3p組、si-con組、si-S100A6組、 miR-361-3p+pcDNA組、 miR-361-3p+pcDNA-S100A6組細胞,培養(yǎng)液調至0.5×105個/ml,取200 μl置于96孔板,分別培養(yǎng)12、24、48 h。取CCK8試劑盒中的CCK液20 μl,輕輕震蕩混勻,避光孵育15 min。490 nm波長下檢測細胞的吸光度(OD)值。

1.7EDU增殖檢測實驗 收集對數(shù)生長期細胞,接種在24孔板,按照BeyoClickTMEDU-488細胞增殖檢測試劑盒要求操作,檢測分析細胞的增殖情況。用EDU(300 μl)與細胞孵育3 h,洗滌。多聚甲醛固定30 min,0.5%Triton X-100滲透脫色10 min,最后用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色細胞核30 min。熒光顯微鏡觀察EDU陽性染色細胞數(shù)量、細胞總數(shù)量,計算EDU陽性率。EDU陽性率(%)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.8劃痕實驗 收集對數(shù)生長期細胞,接種至不含血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基的24孔板(24孔板的背面每劃5條平行直線)。常規(guī)培養(yǎng)細胞至融合度至80%左右,用200 μl的槍頭垂直孔底,平行板背面的直線劃線。沖洗脫落的細胞,五點法拍照。細胞培養(yǎng)24 h后,再次拍照。ImageJ軟件分析劃痕的愈合情況。劃痕愈合率(%)=(0 h寬度-24 h寬度)/0 h寬度×100%。

1.9Transwell實驗 收集對數(shù)生長期細胞,更換無血清的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h。取200 μl均勻鋪在不含基質膠的小室(遷移能力)上室表面,取600 μl含血清的培養(yǎng)基至下室,常規(guī)細胞培養(yǎng)12 h。用于細胞的甲醛固定,結晶紫染色,顯微鏡下計數(shù),結果取平均值。細胞侵襲力的檢測將小室更換為含有基質膠的小室即可,其他操作同上。

1.10雙熒光素酶報告基因檢測實驗 Targetscan在線預測軟件(http://www.targetscan.org/)發(fā)現(xiàn)S100A6是 miR-361-3p的一個靶基因。依據(jù)預測到的結合位點化學合成S100A6野生片段(含S100A6結合位點)和S100A6突變片段(不含S100A6結合位點)的核酸序列,插入熒光載體,構建熒光素酶報告基因。將miR-con、 miR-361-3p、anti-miR-con、anti-miR-361-3p分別與熒光報告基因載體共轉染CAL-62細胞。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測、計算細胞的熒光活性。

1.11統(tǒng)計學處理 采用SPSS23.0軟件進行t檢驗、方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1miR-361-3p 在甲狀腺癌中的表達 與癌旁組織(0.95±0.06)相比,癌組織中 miR-361-3p表達(0.68±0.13)顯著降低(t=14.968,P=0.000)。與Nthy-ori 3-1組(0.93±0.07)相比,TPC-1、SW579和CAL-62組 miR-361-3p表達(0.50±0.10、0.52±0.06、0.45±0.05)均顯著降低(均P<0.05)。CAL-62組細胞 miR-361-3p的降低幅度最大,對 miR-361-3p的敏感性最高,故選用CAL-62細胞用于后續(xù)研究。

2.2過表達 miR-361-3p調控CAL-62增殖、凋亡 與miR-con組相比, miR-361-3p組細胞 miR-361-3p表達顯著升高,24、48、72 h細胞活性均顯著降低,EDU陽性率顯著降低(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 兩組甲狀腺癌細胞CAL-62增殖(EDU法,×100)

2.3過表達 miR-361-3p調控CAL-62遷移侵襲 與miR-con組相比, miR-361-3p組細胞劃痕愈合率顯著升高,遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)。見表1、圖2。

表1 過表達 miR-361-3p抑制CAL-62增殖、凋亡、遷移和侵襲

圖2 過表達 miR-361-3p的CAL-62細胞遷移、侵襲

2.4miR-361-3p靶向S100A6 targetscan在線預網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/)預測到S100A6與 miR-361-3p之間存在連續(xù)的互補結合位點,見圖3。miR-con組相比, miR-361-3p組WT-S100A6細胞熒光活性顯著降低,MUT-S100A6細胞熒光活性變化不顯著,S100A6蛋白表達顯著降低(P<0.05);與anti-miR-con組相比,anti-miR-361-3p組WT-S100A6、MUT-S100A6細胞的熒光活性變化均不顯著,S100A6蛋白表達顯著升高(P<0.05),見圖4、表2。

圖3 S100A6與miR-361-3p存在連續(xù)互補的結合位點

2.5敲減S100A6 調控CAL-62增殖、遷移侵襲和凋亡 與si-con組相比,si-S100A6組細胞S100A6蛋白表達、24、48、72 h細胞活性、EDU陽性率、細胞遷移、侵襲數(shù)量均顯著降低,劃痕愈合率顯著升高(P<0.05)。見圖4、表3。

1～10:miR-con組、miR-361-3p組、anti-miR-con組、anti-miR-361-3p組、癌旁組織、癌組織、si-con組、si-100A6組、miR-361-3p+pcDNA組、miR-361-3p+pcDNA-S100A6組圖4 各組S100A6蛋白表達

2.6過表達S100A6和 miR-361-3p影響甲狀腺癌細胞CAL-62增殖、遷移、侵襲 與 miR-361-3p+pcDNA組相比, miR-361-3p+pcDNA-S100A6組細胞S100A6蛋白表達顯著升高,24、48、72 h細胞活性、EDU陽性率、細胞遷移、侵襲數(shù)量顯著升高,劃痕愈合率顯著降低(P<0.05),見圖4、表4。

表2 雙熒光素酶報告實驗

表3 敲減S100A6 抑制甲狀腺癌細胞CAL-62增殖、遷移和侵襲

2.7miR-361-3pt S100A6 mRNA相關性 與癌旁組織(1.05±0.12、0.36±0.07)相比,癌組織中S100A6 mRNA和蛋白表達(4.45±0.35、0.76±0.13)均顯著升高(t=72.937、21.503;均P<0.05)。癌組織中 miR-361-3p相對表達與S100A6相對表達呈顯著負相關(P<0.05)。見圖4、圖5。

表4 過表達 miR-361-3p和S100A6 調控CAL-62增殖、遷移侵襲和凋亡

圖5 miR-361-3p和S100A6 mRNA相關性

3 討 論

miR-361被證明在乳腺癌、肺癌、胃癌等實體腫瘤中的表達受到抑制〔11〕。Xia等〔12〕研究報道,miR-361-3p作為Hsa_circ_0011385的靶向因子參與甲狀腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲、細胞周期阻滯和凋亡過程,揭示Hsa_Circ0011385通過靶向miR-361-3p促進甲狀腺癌細胞增殖、侵襲、遷移,抑制甲狀腺癌細胞周期阻滯和凋亡,提示Hsa_Circ0011385/miR-361-3p通路可能是甲狀腺癌的一個有希望的治療靶點。Li等〔13〕報道,miR-361-5p過度表達可在體外顯著抑制甲狀腺癌細胞增殖、遷移、侵襲,在體內(nèi)抑制腫瘤的生長。本研究發(fā)現(xiàn),miR-361-3p在甲狀腺癌組織和癌細胞中的表達水平均發(fā)生明顯下調。過表達miR-361-3p明顯的抑制了癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力,增強了癌細胞的凋亡能力,說明miR-361-3p在甲狀腺癌的治療中具有成為潛在治療靶點的價值。miR-361-3p具有靶向負調控S100A6的功能,推測這可能與miR-361-3p在甲狀腺癌中調控甲狀腺癌細胞表型變化的潛在機制有關。

有研究〔14〕表明,S100A6在甲狀腺乳頭狀癌中的表達顯著升高,腫瘤的免疫組化分析顯示,乳頭狀甲狀腺癌患者的胞質染色明顯強于濾泡性甲狀腺癌,且染色的細胞核比例更大,說明S100A6在甲狀腺癌中具有促進作用,并可能有助于區(qū)分濾泡性甲狀腺癌和乳頭狀甲狀腺癌〔14〕。Nipp等〔15〕研究發(fā)現(xiàn),S100-A10、S100-A10在轉移性甲狀腺癌中的表達明顯升高,并與淋巴轉移的程度高度相關,此外,其還與轉化生長因子(TGF)-β依賴性上皮間質化途徑密切相關,提示S100-A10、S100-A10可能在轉移性甲狀腺癌的診斷中具有生物價值。Li等〔16〕研究發(fā)現(xiàn),S100A2/4/6/10/14/16在胰腺導管腺癌(PDAC)組織中的表達水平顯著高于正常胰腺組織,而S100A2/4/6/10/14/16在PDAC中的啟動子甲基化水平低于正常組織,它們的表達與PDAC患者的生存率呈負相關,表明S100A2/4/6/10/14/16可作為PDAC患者預后的生物標志物。由此可見,S100A6在內(nèi)分泌腫瘤中發(fā)揮致癌功能,但是其發(fā)揮作用的機制仍有待繼續(xù)研究。本研究發(fā)現(xiàn),敲減S100A6明顯抑制了甲狀腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲,促進凋亡,說明S100A6的抑制具有抗甲狀腺癌作用,再次證實了前S100A6在甲狀腺癌中的致癌功能。此外,過表達S100A6后還能夠部分逆轉過表達 miR-361-3p對甲狀腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲抑制和凋亡促進作用。

綜上, miR-361-3p在甲狀腺癌組織、癌細胞中表達降低,具有抑制癌細胞增殖、遷移侵襲,促進凋亡的作用,其機制與靶向抑制S100A6表達相關。