蔣曉蕾 朱立宏

(武漢市中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)皮膚科,湖北 武漢 430014)

皮膚潰瘍病因復(fù)雜、病程較長、且易反復(fù)發(fā)作,嚴(yán)重影響患者生活及工作〔1〕。近來研究發(fā)現(xiàn),皮膚持續(xù)的炎癥反應(yīng),是導(dǎo)致新生結(jié)締組織改建失敗、表皮細(xì)胞爬行困難,創(chuàng)面愈合減慢的主要原因〔2〕。中醫(yī)藥在抗炎、促進(jìn)創(chuàng)面愈合方面有潛在療效〔3〕。復(fù)方黃柏液具有消腫化腐、清熱解毒、抗炎、抗菌等作用,近來臨床研究發(fā)現(xiàn)其可有效控制炎癥,治療慢性創(chuàng)面愈合不良有效率達(dá)70.37%〔4〕,預(yù)示其在皮膚潰瘍治療方面有潛在價值,但其促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合的分子機(jī)制還不甚清楚。核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB被稱為炎癥調(diào)控的開關(guān),其轉(zhuǎn)錄入核活化可促進(jìn)炎癥因子轉(zhuǎn)錄釋放〔5〕。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)可將胞外炎癥信號傳遞到胞內(nèi),并誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞等增殖、分化后向傷口處運(yùn)動,刺激多種生長因子分泌,來促進(jìn)肉芽新生及潰瘍愈合〔6〕。本研究從NF-κB/MAPK通路探究復(fù)方黃柏液對皮膚潰瘍大鼠炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 SPF級雄性SD大鼠90只,7周齡,體質(zhì)量200～220 g,購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究所;生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2021-0004。本試驗(yàn)符合3R原則并經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)ICAU-20210908112。復(fù)方黃柏液(含連翹、黃柏、金銀花、蒲公英、蜈蚣成分,貨號:202106140003,購自山東漢方制藥有限公司,規(guī)格100 ml);NF-κB阻斷劑吡咯烷二硫代氨基甲酸銨(PDTC,貨號:GJ50622,上海圻明生物科技有限公司);MAPK阻斷劑(SB203580,貨號:S1076,美國MCE公司);蘇木素-伊紅(HE)染色液(貨號:YT8310,北京伊塔生物科技有限公司);NF-κB磷酸化蛋白(p-NF-κB)、MAPK磷酸化蛋白(p-MAPK)、NF-κB、MAPK、絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶(MKP)-1、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、轉(zhuǎn)分化生長因子(TGF)-β抗體均購自美國abcam公司。

1.2模型建立及分組 取SD大鼠,參照文獻(xiàn)〔7〕剃去背部面積4 cm×4 cm的長毛,無菌條件下剪去皮膚,深達(dá)筋膜,股肌注射氫化可的松注射液(60 mg/kg),并于筋膜下噴灑金黃色葡萄球菌(1 ml/只),醫(yī)用紗布覆蓋創(chuàng)面,橡皮膏包扎固定,并隨機(jī)分為:模型組、復(fù)方黃柏液組、NF-κB阻斷劑組、MAPK阻斷劑組、復(fù)方黃柏液+MAPK阻斷劑組,每組15只。另取15只大鼠,僅在相應(yīng)部位將皮瓣分離,原位縫合作為假手術(shù)組。各組均于造模手術(shù)后第2天開始給藥,復(fù)方黃柏液組參照文獻(xiàn)〔8〕用鹽水棉球清潔創(chuàng)面后,用與創(chuàng)面相仿的無菌紗布覆蓋創(chuàng)面,無菌注射器抽取藥液(約3 ml)注于紗布內(nèi),以紗布浸透,藥液未溢出為度,透明薄膜敷貼包扎后無菌紗布包裹固定,每天換藥2次;NF-κB阻斷劑組及MAPK阻斷劑組參照文獻(xiàn)〔9〕分別經(jīng)腹腔注射PDTC 120 mg/kg及SB203580 10 mg/kg進(jìn)行干預(yù)治療,1次/d;復(fù)方黃柏液+MAPK阻斷劑組腹腔注射SB203580 10 mg/kg的同時,給予復(fù)方黃柏液進(jìn)行干預(yù)治療;模型組用無菌紗布浸透生理鹽水后包裹固定創(chuàng)面。各組連續(xù)給藥4 w。

1.3潰瘍面積及創(chuàng)面愈合率檢測 各組給藥結(jié)束后,卡尺測量潰瘍面積;用透明膜覆創(chuàng)面畫膜、剪膜,并換算成面積,計(jì)算創(chuàng)面愈合率,創(chuàng)面愈合率=(給藥前創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/給藥前創(chuàng)面面積×100%。

1.4HE染色觀察創(chuàng)面病理變化 肉眼觀察創(chuàng)面形態(tài),隨機(jī)取6只大鼠,麻醉處死后,取創(chuàng)面,置于多聚甲醛溶液固定24 h,制成厚為5 μm的石蠟切片,置于光鏡下觀察組織形態(tài)變化。

1.5免疫組化法檢測p-NF-κB、p-MAPK陽性表達(dá) 取創(chuàng)面石蠟切片,脫蠟、透化、抗原修復(fù)后,滴加1∶100的兔抗大鼠p-NF-κB、p-MAPK一抗抗體孵育24 h,滴加山羊抗兔IgG(1∶400)二抗抗體孵育20 min,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,光鏡下觀察拍照,Image-Pro Plus6.0軟件分析單位面積內(nèi)陽性染色的平均光密度值(MD)。

1.6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測創(chuàng)面組織炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-8水平 剩余9只大鼠,處死后取創(chuàng)面組織,粉碎勻漿后取勻漿液,按ELISA試劑盒說明書方法檢測TNF-α、IL-1β、IL-8水平。

1.7Western印跡檢測創(chuàng)面組織蛋白表達(dá) 取創(chuàng)面組織勻漿液,提取胞質(zhì)及胞核蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度,取40 μg蛋白行電泳、轉(zhuǎn)膜操作,滴加1∶600的兔抗大鼠NF-κB、p-NF-κB、MAPK、p-MAPK、MKP-1、VEGF、bFGF、TGF-β一抗及1∶900的內(nèi)參β-actin抗體孵育24 h,滴加山羊抗兔IgG二抗(1∶1 500)孵育45 min,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液顯色,ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS24.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析,組間多重比較用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1復(fù)方黃柏液對大鼠潰瘍面積及創(chuàng)面愈合率的影響 與假手術(shù)組相比,模型組潰瘍面積明顯升高,創(chuàng)面愈合率明顯降低(P<0.05)。與模型組相比,復(fù)方黃柏液組及NF-κB阻斷劑組潰瘍面積明顯減小,創(chuàng)面愈合率明顯升高(P<0.05);MAPK阻斷劑組潰瘍面積明顯增大,創(chuàng)面愈合率明顯降低(均P<0.05)。與復(fù)方黃柏液組相比,MAPK阻斷劑組、復(fù)方黃柏液+MAPK阻斷劑組潰瘍面積明顯增大,創(chuàng)面愈合率明顯降低(均P<0.05),見表1。

表1 各組潰瘍面積及創(chuàng)面愈合率比較

2.2復(fù)方黃柏液對大鼠創(chuàng)面組織病理變化的影響 肉眼可見假手術(shù)組創(chuàng)面肉芽組織、纖維排列整齊,筋膜內(nèi)有豐富的毛細(xì)血管網(wǎng);模型組創(chuàng)面有大量滲出液,氣味腥臭,創(chuàng)面顏色晦暗,筋膜內(nèi)毛細(xì)血管網(wǎng)稀少。復(fù)方黃柏液組及NF-κB阻斷劑組創(chuàng)面滲出液減少,創(chuàng)面顏色鮮紅,肉芽組織及毛細(xì)血管網(wǎng)形成較多。MAPK阻斷劑組滲出液較模型組增多,筋膜內(nèi)幾乎未見毛細(xì)血管網(wǎng)。復(fù)方黃柏液+MAPK阻斷劑組創(chuàng)面滲出液及顏色變化較模型組相近。

HE染色可見,假手術(shù)組創(chuàng)面有表皮新生且結(jié)構(gòu)完整,表皮層下可見成纖維細(xì)胞及膠原纖維增多、炎性細(xì)胞散在分布,毛細(xì)血管豐富;模型組及復(fù)方黃柏液+MAPK阻斷劑組創(chuàng)面雖有新生表皮,但未覆蓋創(chuàng)面,表皮上有痂皮,炎性細(xì)胞聚集增多,痂皮下組織液增多,真皮層中毛細(xì)血管和膠原纖維較少。復(fù)方黃柏液組及NF-κB阻斷劑組創(chuàng)面有角質(zhì)層、棘層和基底層新生,成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞散在分布于基底層下,毛細(xì)血管豐富且膠原纖維較多,但形狀較細(xì),沒有交織成網(wǎng)。MAPK阻斷劑組創(chuàng)面組織液形成的痂皮中炎性細(xì)胞聚集增多,毛細(xì)血管和膠原纖維形成最少,見圖1。

圖1 各組創(chuàng)面組織(HE染色,×100)

2.3復(fù)方黃柏液對大鼠創(chuàng)面組織p-NF-κB及p-MAPK陽性表達(dá)的影響 免疫組化染色可見假手術(shù)組創(chuàng)面組織p-NF-κB陽性(紅棕色)表達(dá)較淺,p-MAPK陽性表達(dá)加深。與假手術(shù)組相比,模型組p-NF-κB陽性表達(dá)明顯升高,p-MAPK陽性表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與模型組相比,復(fù)方黃柏液組及NF-κB阻斷劑組p-NF-κB陽性表達(dá)明顯降低,p-MAPK陽性表達(dá)升高;MAPK阻斷劑組p-NF-κB陽性表達(dá)明顯升高,p-MAPK陽性表達(dá)明顯降低(均P<0.05)。與復(fù)方黃柏液組相比,MAPK阻斷劑組、復(fù)方黃柏液+MAPK阻斷劑組p-NF-κB陽性表達(dá)明顯升高,p-MAPK陽性表達(dá)明顯降低(P<0.05),見圖2、表2。

圖2 各組創(chuàng)面組織p-NF-κB及p-MAPK(免疫組化染色,×400)

2.4復(fù)方黃柏液對大鼠創(chuàng)面組織炎癥因子表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比,模型組創(chuàng)面組織TNF-α、IL-1β、IL-8表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與模型組相比,復(fù)方黃柏液組及NF-κB阻斷劑組創(chuàng)面組織TNF-α、IL-1β、IL-8表達(dá)明顯降低;MAPK阻斷劑組創(chuàng)面組織TNF-α、IL-1β、IL-8表達(dá)明顯升高(均P<0.05)。與復(fù)方黃柏液組相比,復(fù)方黃柏液+MAPK阻斷劑組、MAPK阻斷劑組創(chuàng)面組織TNF-α、IL-1β、IL-8表達(dá)明顯升高(P<0.05),見表2。

表2 各組創(chuàng)面組織p-NF-κB及p-MAPK陽性表達(dá)、TNF-α、IL-1β、IL-8表達(dá)比較

2.5復(fù)方黃柏液對大鼠創(chuàng)面組織NF-κB及MAPK通路蛋白、生長因子蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比,模型組創(chuàng)面組織p-NF-κB/NF-κB、MKP-1蛋白表達(dá)明顯升高,p-MAPK/MAPK、VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表達(dá)明顯降低(均P<0.05)。與模型組相比,復(fù)方黃柏液組及NF-κB阻斷劑組創(chuàng)面組織p-NF-κB/NF-κB、MKP-1蛋白表達(dá)明顯降低,p-MAPK/MAPK、VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表達(dá)明顯升高;MAPK阻斷劑組創(chuàng)面組織p-NF-κB/NF-κB、MKP-1蛋白表達(dá)明顯升高,p-MAPK/MAPK、VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表達(dá)明顯降低(均P<0.05)。與復(fù)方黃柏液組相比,MAPK阻斷劑組、復(fù)方黃柏液+MAPK阻斷劑組p-NF-κB/NF-κB、MKP-1蛋白表達(dá)明顯升高,p-MAPK/MAPK、VEGF、bFGF、TGF-β蛋白明顯降低(均P<0.05)。見表3、圖3。

表3 各組創(chuàng)面組織各蛋白表達(dá)比較

1～6:假手術(shù)組、模型組、復(fù)方黃柏液組、NF-κB阻斷劑組、MAPK阻斷劑組、復(fù)方黃柏液+MAPK阻斷劑組圖3 各組創(chuàng)面組織p-NF-κB、NF-κB、MKP-1、p-MAPK、MAPK、VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表達(dá)

3 討 論

皮膚潰瘍后創(chuàng)面修復(fù)及愈合困難是臨床的一大難題〔10〕。研究發(fā)現(xiàn),創(chuàng)面愈合涉及炎癥反應(yīng)、肉芽組織形成、新生結(jié)締組織沉積及改建等3個過程〔11〕。其中炎癥反應(yīng)過程是創(chuàng)面正常愈合的第一個也是非常重要的階段,其可溶解及清除壞死組織及滲出物,為肉芽組織形成奠定基礎(chǔ),但炎癥反應(yīng)過激,也會殺傷正常細(xì)胞,降解結(jié)締組織中的膠原,而不利于創(chuàng)面愈合〔12〕。Panek-Jeziorna等〔13〕發(fā)現(xiàn),慢性難愈合性皮膚潰瘍患者滲出液或血清中存在IL-1β、IL-8、TNF-α等炎癥因子釋放增多現(xiàn)象,提示炎癥反應(yīng)過激,可能是皮膚潰瘍后愈合速度減慢的關(guān)鍵因素。

已有研究發(fā)現(xiàn),抑制炎癥因子大量釋放及滲入周圍組織,可加快肉芽組織形成,促進(jìn)潰瘍愈合〔14〕。復(fù)方黃柏液是由黃柏、連翹、金銀花、蒲公英等藥物組成,具有清熱解毒、祛腐生肌、殺菌止癢等功效,因其具有抗菌、抗感染、抗炎、促傷口愈合等藥理作用,而被應(yīng)用于濕疹、痤瘡、帶狀皰疹等皮膚病的治療〔15〕。李友山等〔16〕臨床研究,發(fā)現(xiàn)復(fù)方黃柏液可促進(jìn)糖尿病足部潰瘍患者TNF-α及IL-1等炎癥因子的釋放,升高VEGF及表皮生長因子(EGF)表達(dá)而促進(jìn)潰瘍愈合,提示復(fù)方黃柏液可能為治療皮膚潰瘍的潛在藥物。本研究結(jié)果證實(shí),復(fù)方黃柏液可促進(jìn)潰瘍愈合。

NF-κB被稱為炎癥的總開關(guān),其磷酸化入核活化,可誘導(dǎo)IL-1β、IL-8、TNF-α等炎癥因子的轉(zhuǎn)錄及表達(dá),而介導(dǎo)炎癥信號的傳導(dǎo),并能誘導(dǎo)T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞表達(dá)MKP-1來吞噬受損或感染細(xì)菌的細(xì)胞〔17〕。但MKP-1同時也是MAPK的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,可通過去磷酸化作用,使p-MAPK活性失活〔18〕。MAPK磷酸化活性升高已被證實(shí)可促進(jìn)生長因子如VEGF、bFGF、TGF-β等表達(dá)來誘導(dǎo)血管新生、肉芽組織形成及表皮再生修復(fù)〔19,20〕。李多等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方黃柏液可通過抑制p-NF-κB表達(dá)來降低潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜炎癥損傷。本研究結(jié)果提示,復(fù)方黃柏液促進(jìn)皮膚潰瘍愈合作用,可能與抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)活化,升高M(jìn)APK磷酸化活化介導(dǎo)的生長因子表達(dá)有關(guān)。MAPK阻斷劑可部分減弱復(fù)方黃柏液發(fā)揮的抗炎、促生長因子表達(dá)及抗?jié)兊茸饔谩?/p>

綜上,NF-κB與MAPK之間的聯(lián)系較為復(fù)雜且爭議較多。復(fù)方黃柏液通過何種途徑調(diào)控NF-κB炎癥及MAPK促生長因子表達(dá),發(fā)揮抗?jié)冏饔?還需進(jìn)一步探討及驗(yàn)證。