向仕菊 潘渝 陳金 王霞

(貴州省人民醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)科,貴州 貴陽(yáng) 550002)

肺部細(xì)菌感染在治療后還會(huì)存在較為嚴(yán)重的氣道黏膜損傷、氣道反應(yīng)性升高,其臨床表現(xiàn)常見于咳嗽癥狀遷延不愈等,最終會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槁猿掷m(xù)性感染疾病〔1,2〕。miRNAs是當(dāng)下感染疾病領(lǐng)域的研究中的熱點(diǎn),研究顯示,miR-146a在人體肺泡上皮細(xì)胞中會(huì)發(fā)揮重要調(diào)控作用,其常參與各種肺部疾病的發(fā)生發(fā)展〔3,4〕。本研究探究下調(diào)miR-146a對(duì)肺部細(xì)菌感染大鼠的干預(yù)效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1研究動(dòng)物 選取4～6周齡SPF健康雌性大鼠40只,平均體質(zhì)量(114.83±10.60)g,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(桂)2021-0002。將大鼠置于專門實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)室中,保證室內(nèi)光線充足,溫度(23.07±2.13)℃,通風(fēng)良好,晝夜節(jié)律為12 h,環(huán)境濕度保持在50%～60%,定期消毒、清掃鼠籠,及時(shí)更換墊料,保持1 w適應(yīng)性飼養(yǎng)時(shí)間。主要試劑:流感嗜血桿菌1709菌株由解放軍第960醫(yī)院呼吸科臨床分離,經(jīng)VITEK系統(tǒng)鑒定;Ham F-12K培養(yǎng)基由美國(guó)Sigma Aldrich公司提供,胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)HyClone公司、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司;miR-146a引物由上海源葉生物科技有限公司合成;全自動(dòng)酶免分析儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自福州邁新公司。

1.2分組及模型構(gòu)建 將40只大鼠依照隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、空白組、miR-146a轉(zhuǎn)染組,每組各10只,將假手術(shù)組、模型組及miR-146a轉(zhuǎn)染組大鼠以45 ml/kg 3%戊巴比妥腹腔麻醉,成功后取大鼠仰臥位固定于固定板中,用專用電動(dòng)剃毛器將胸部、頸部脫毛。消毒后適度拉伸大鼠頸部,暴露大鼠喉頭,在大鼠頸部正中切2～3 cm切口,分離大鼠前肌,暴露其氣管并進(jìn)行固定,于環(huán)甲軟骨處剪V形切口,置入硅膠管,向大鼠氣管右側(cè)緩慢、傾斜注入流感嗜血桿菌瓊脂小珠100 μl,完成后將大鼠直立10～20 s,使菌液最大可能分布于大鼠肺部。上述大鼠成功建模的只數(shù)分別為10、8、9只。miR-146a轉(zhuǎn)染組:通過敲低miR-146a實(shí)現(xiàn)miR-146a下調(diào),100 nmol/L轉(zhuǎn)染miRNA抑制劑轉(zhuǎn)染miR-146a,分為miR-146a轉(zhuǎn)染組,模型組、假手術(shù)組、空白組使用100 nmol/L轉(zhuǎn)染miRNA抑制劑轉(zhuǎn)染無(wú)意義序列。

1.3樣本采集 24 h后,將大鼠禁食禁水12 h,使用1%戊巴比妥鈉溶液依照40 mg/kg的比例注射進(jìn)大鼠腹腔,使其麻醉,靜待,成功后,取其主動(dòng)脈血5 ml,然后于3 000 r/min條件下,離心15 min,分離血清后分裝于-70 ℃冰箱保存。處死大鼠,取出其肺組織,使用生理鹽水進(jìn)行沖洗,最后將其固定在比例為4%的多聚甲醛溶液中。

1.4病理組織學(xué)觀察 將肺組織固定后進(jìn)行常規(guī)脫水、包埋、切片、HE染色,觀察其病理形態(tài)變化,光鏡下肺部感染情況。

1.5miR-146a相對(duì)表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)肺組織中miR-146a表達(dá)水平,采用Trizol法提取樣本RNA,使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得總cDNA,采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列,啟動(dòng)PCR儀,反應(yīng)體系:0.4 μl上下游引物、1 μl cDNA模板、10 μl SYB Green,加蒸餾水至20 μl。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性1 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 31 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán),采用2-△△Ct方法計(jì)算出miR-146a相對(duì)表達(dá)。miR-146a上游引物:5'-CGTAGCATCCTTAGAACTCAGC-3′,下游5′-CCGCTCGAGGAA-CTATTGTTGAACGGCACT-3′。內(nèi)參上游:5′-CATTGCC-GACAGGATGCA-3′,下游5′-GCCGATCCACACGGAGTACT-3′。

1.6白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-1β、干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β、糖鏈抗原(KL)-6、水性表面活性蛋白(SP)-D水平 采用ELISA檢測(cè)。提前稀釋好將提前稀釋好100 μl標(biāo)本,將其置入微孔板標(biāo)準(zhǔn)孔,樣品孔只加樣品稀釋液,混合均勻,在37 ℃下處理90 min,甩去孔內(nèi)液體,吸干水分;將準(zhǔn)備好的抗體加入樣品孔、標(biāo)準(zhǔn)孔中0.1 ml,在37 ℃下處理60 min,甩去孔內(nèi)液體,每孔中加滿0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS),浸泡2 min后甩干孔內(nèi)液體;每孔加入90 μl TMS,置于避光處20 min;每孔中加入90 μl TMS終止液。于波長(zhǎng)450 mm處分析IL-4、IL-1β、IFN-γ、TNF-α、TGF-β、KL-6、SP-D水平。

1.7血?dú)夥治?構(gòu)建模型24 h后,取腹主動(dòng)脈血行血?dú)夥治鏊蜋z做血?dú)夥治觥?/p>

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組病理組織 空白組肺泡形態(tài)均勻、結(jié)構(gòu)完整,且上皮細(xì)胞形態(tài)正常,肺泡腔內(nèi)未發(fā)現(xiàn)滲出的纖維蛋白,肺間質(zhì)未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞、水腫及紅細(xì)胞浸潤(rùn);假手術(shù)組與空白組差異性并不明顯,肺泡間隔正常,肺泡腔及肺泡結(jié)構(gòu)較為完整,無(wú)明顯肺組織損傷狀況,但由于受實(shí)驗(yàn)操作的影響,假手術(shù)組肺部結(jié)構(gòu)及形態(tài)稍有改變。模型組肺泡間隔出現(xiàn)明顯增寬,微血管有充血、擴(kuò)張現(xiàn)象,肺間質(zhì)周圍有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn),且肺組織損傷較為嚴(yán)重。miR-146a轉(zhuǎn)染組肺泡結(jié)構(gòu)雖然不完整,但較模型組狀況要好,肺組織損傷也較輕,肺泡及其周圍炎性細(xì)胞逐漸減少,且肺泡間隔變窄,肺部結(jié)構(gòu)趨于恢復(fù)正常。見圖1。

圖1 各組肺泡病理(HE染色,×200)

2.2各組miR-146a相對(duì)表達(dá)比較 miR-146a轉(zhuǎn)染組miR-146a相對(duì)表達(dá)明顯低于模型組、空白組,明顯高于假手術(shù)組(P<0.05);模型組、空白組miR-146a相對(duì)表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(P<0.05);模型組、空白組miR-146a相對(duì)表達(dá)比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.3各組炎癥因子水平比較 miR-146a轉(zhuǎn)染組IL-4、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平明顯低于模型組,明顯高于空白組、假手術(shù)組(P<0.05);空白組以上指標(biāo)明顯低于模型組(P<0.05),與假手術(shù)組無(wú)顯著差異(P>0.05);模型組以上指標(biāo)明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)。見表1。

表1 各組miR-146a表達(dá)、炎癥因子水平比較

2.4各組血?dú)庵笜?biāo)比較 miR-146a轉(zhuǎn)染組動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)、PaO2/吸入氣氧濃度(FiO2)明顯低于假手術(shù)組、空白組,明顯高于模型組(P<0.05);空白組以上指標(biāo)明顯高于模型組(P<0.05),與假手術(shù)組無(wú)顯著差異(P>0.05);模型組以上指標(biāo)明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)。見表2。

2.5各組肺泡灌洗液TGF-β、KL-6、SP-D水平比較 miR-146a轉(zhuǎn)染組TGF-β、KL-6、SP-D水平明顯低于模型組,明顯高于空白組、假手術(shù)組(P<0.05);空白組以上指標(biāo)明顯低于模型組,與假手術(shù)組無(wú)顯著差異(P>0.05);模型組以上指標(biāo)明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)。見表2。

表2 各組PaO2、PaO2/FiO2、TGF-β、KL-6、SP-D水平比較

3 討 論

肺部細(xì)菌感染在重癥患者群體中較為多發(fā),是造成重癥死亡的關(guān)鍵〔5,6〕,主要是由于機(jī)體遭受常見致病菌的入侵而引發(fā)的肺部疾病〔7,8〕。當(dāng)肺部感染后,肺泡中毛細(xì)血管上皮細(xì)胞會(huì)被破壞,進(jìn)而引發(fā)肺部炎癥及氣體交換功能障礙。臨床治療肺部感染的常規(guī)手段之一是抗菌治療,抑制相關(guān)病原菌感染,降低病原菌引發(fā)的肺損傷,但由于抗菌藥物使用過于廣泛,加上部分侵入性診斷、治療手段的實(shí)施,令諸多病原菌的耐藥性不斷升高。

miR-146a作為內(nèi)源性非編碼RNA分子的一種,具有高度保守性,其屬于miRNA與相關(guān)蛋白分子結(jié)合形成的復(fù)合物之一〔9,10〕。研究顯示,沉默后miR-146a會(huì)抑制炎癥相關(guān)基因表達(dá),促進(jìn)靶基因降解,同時(shí)miR-146a也會(huì)參與機(jī)體固有免疫反,在調(diào)控感染性疾病中起至關(guān)重要作用〔11,12〕。本研究結(jié)果提示,下調(diào)miR-146a會(huì)降低肺部細(xì)菌大鼠炎癥水平,發(fā)揮抗炎作用,同時(shí)可以調(diào)節(jié)肺部感染大鼠血?dú)馑?促進(jìn)氣體交換功能的改善。TGF-β是纖維細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、氣管平滑肌、內(nèi)皮細(xì)胞等多種肺泡相關(guān)細(xì)胞的表達(dá)生長(zhǎng)因子,其有引發(fā)氣道組織肥厚、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子產(chǎn)生與釋放〔13,14〕。KL-6、SP-D屬于肺泡表面的常見活性蛋白,其會(huì)發(fā)揮促進(jìn)組織細(xì)胞修復(fù)及抑制病菌生長(zhǎng)的作用〔15～17〕。既往研究發(fā)現(xiàn),TGF-β、KL-6、SP-D在肺部細(xì)菌感染中會(huì)呈顯著升高狀態(tài),且多項(xiàng)顯示證實(shí),它們會(huì)參與多種炎癥介質(zhì)的釋放〔18～20〕。推測(cè)下調(diào)miR-146a會(huì)抑制肺部細(xì)菌感染的病理活動(dòng)過程。當(dāng)肺部受致病菌感染后,大量炎癥因子相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄被啟動(dòng),而miR-146a的靶基因是相關(guān)炎癥因子通路中的重要接頭蛋白編碼基因,miR-146a下調(diào)后會(huì)抑制炎癥因子及促炎因子釋放,有助于改善肺組織感染狀況,減輕肺損傷,有利于平滑肌重塑及呼吸功能的改善。雖然本文初步證實(shí)了,下調(diào)miR-146a可能是靶向調(diào)控治療肺部細(xì)菌大鼠有效方案,但后續(xù)研究還需進(jìn)一步理清該作用機(jī)制中路徑。