張奇 宋娟 王明 田華 郭紅艷 趙學(xué)梅

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

血管性癡呆(VD)是一種主要影響老年人的癡呆形式,是第二大常見癡呆類型,發(fā)病率呈逐年上升趨勢,其特征是大腦供血發(fā)生變化〔1〕。研究表明,抑郁是VD中最常見的一種精神行為異常〔2〕。VD抑郁樣行為會嚴重損害患者的身心健康,降低患者的生命質(zhì)量〔3〕。目前,VD抑郁樣行為的發(fā)病機制尚未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)營養(yǎng)因子(NT)低表達是引起抑郁癥狀的重要原因之一,海馬中NT表達的增加對抑郁癥狀具有改善作用。因此,調(diào)節(jié)NT表達可能是防治VD抑郁樣行為途徑之一〔4〕。除神經(jīng)元損傷外,海馬突觸的損害也是VD的重要病理特征〔5〕,且海馬突觸可塑性的調(diào)節(jié)可以改善抑郁癥狀〔6〕。本實驗研究脫氫表雄酮(DHEA)對VD抑郁小鼠的行為學(xué)和海馬組織NT-3、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和生長相關(guān)蛋白(GAP)-43表達的影響。

1 材料和方法

1.1動物 健康C57BL/6小鼠,雌雄各半,體質(zhì)量18～22 g,購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,動物許可證號為SYXK(黑)2016-001。

1.2實驗試劑 DHEA購自Sigma公司;抗BDNF抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;抗NF-3抗體購自Abcam公司;抗GAP-43抗體購自Proteintech公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒和Ⅰ抗、Ⅱ抗去除液購自碧云天生物技術(shù)研究所;Ⅱ抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.3動物分組 實驗前小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w,隨機分為假手術(shù)組,模型組,DHEA低、中、高劑量組。

1.4動物模型的建立 以雙側(cè)頸總動脈閉塞(BCCAO)法建立VD小鼠模型,術(shù)前小鼠禁食12 h,自由飲水,將小鼠用0.3%戊巴比妥鈉(10 ml/kg)腹腔注射麻醉,將小鼠仰臥位固定于鼠臺,鈍性分離胸骨舌肌與胸鎖乳突肌間的肌間隙,分離雙側(cè)頸總動脈,剝離神經(jīng),暴露并夾閉雙側(cè)頸總動脈20 min后再灌注,造成全腦缺血再灌注損傷。假手術(shù)組只分離頸總動脈,不夾閉。術(shù)后,各組自由進食和飲水。

1.5給藥方法 用二甲基亞砜(DMSO)溶解DHEA后,再采用植物油稀釋。DHEA低、中、高劑量組缺血再灌注后,分別皮下注射20、40和60 mg/kg DHEA,假手術(shù)組和模型組給予等量植物油。

1.6懸尾實驗(TST) 測試時在距小鼠尾尖約2 cm處用細繩固定懸掛在離地面20 cm處,使小鼠呈倒懸狀態(tài)6 min,記錄懸尾不動時間。小鼠懸尾不動時間反映其絕望水平。

1.7強迫游泳實驗(FST) 第1天將小鼠依次置于水溫25 ℃的玻璃容器中,玻璃容器直徑15 cm,高25 cm,小鼠適應(yīng)15 min后取出,擦干。第2天,在同樣的條件下進行強迫游泳6 min,記錄后4 min在水中游泳不動時間。游泳不動的標(biāo)準(zhǔn)為小鼠僅將頭部露出水面漂浮,尾巴和前爪輕微擺動以維持身體平衡,游泳不動時間與動物絕望程度呈正相關(guān)。

1.8筑巢實驗(NBT)〔7〕將小鼠單籠飼養(yǎng),讓其適應(yīng)環(huán)境24 h后,在鼠籠內(nèi)部放入約1 cm厚的墊料,墊料上放置5×5 cm2的棉花,使小鼠自由活動24 h后,拍照記錄小鼠的筑巢情況,按照5分法對筑巢質(zhì)量進行評分:棉花沒有被撕咬計1分;較少部分棉花有被拖拽或有被撕咬行為計2分;絕大部分棉花有被拖拽到角落或有被撕咬行為計3分;3分情況下,有成型巢可見計4分;棉花被撕咬成小塊,并聚攏成較深的巢計5分。

1.9Western印跡檢測相關(guān)蛋白表達 將假手術(shù)組、模型組、DHEA高劑量組斷頭處死,暴露腦組織于冰上,用生理鹽水沖洗表面殘余血,立即分離出海馬組織,-80 ℃保存。取小鼠海馬組織勻漿液,蛋白定量采用BCA蛋白濃度測定試劑盒,將Western印跡工作液配制完成后進行蛋白質(zhì)電泳、轉(zhuǎn)膜,封閉液封閉1 h,加入目標(biāo)蛋白和β-actin一抗,4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次。加二抗,室溫下孵育2 h,TBST洗膜3次,滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)液,顯影,定影;以β-actin為內(nèi)參,檢測各條帶灰度值,計算目標(biāo)蛋白相對表達量。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1DHEA對VD小鼠TST和FST的影響 與假手術(shù)組相比較,模型組TST和FST的靜止時間顯著增加(P<0.01),說明VD模型建立成功。與模型組相比較,DHEA低、中、高劑量組TST和FST的靜止時間顯著減少(P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 各組TST和FST靜止時間

2.2DHEA對VD小鼠筑巢能力的影響 與假手術(shù)組〔(4.25±0.71)分〕相比較,模型組NBT評分〔(2.88±0.64)分〕顯著降低(P<0.05),說明模型小鼠自理能力顯著下降。與模型組相比較,DHEA低、中、高劑量組評分〔(3.75±0.71)分、(4.00±0.76)分、(4.13±0.83)分〕顯著提高(P<0.05,P<0.01)。

2.3DHEA對NT-3、BDNF和GAP-43表達水平的影響 與假手術(shù)組相比較,模型組NT-3、BDNF、GAP-43表達均顯著減少(P<0.05,P<0.01);與模型組相比較,DHEA高劑量組NT-3、BDNF、GAP-43蛋白表達均顯著增加(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 DHEA對VD小鼠BDNF、NT-3及GAP-43蛋白表達影響

圖1 各組BDNF、NT-3及GAP-43蛋白表達

3 討 論

VD患者常常伴隨著不同程度的抑郁癥狀,具體表現(xiàn)為不愿與人溝通、情緒低落、生活自理能力下降及對較多數(shù)事物不感興趣等〔8〕。TST、FST是常用的篩選抗抑郁藥的行為學(xué)方法,而NBT是反映抑郁小鼠日常生活自理能力的行為學(xué)指標(biāo)〔9〕。本實驗結(jié)果顯示,BCCAO小鼠較好地模擬了VD的抑郁樣行為;DHEA可以減輕VD小鼠抑郁樣行為,提高生活自理能力。

DHEA可以在星形膠質(zhì)和大腦神經(jīng)元中合成,其中DHEA在海馬中含量最高,DHEA對海馬發(fā)育有促進作用,還可以改變海馬中的突觸可塑性〔10〕。BDNF是調(diào)節(jié)突觸可塑性的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子。臨床研究顯示,抑郁患者的海馬發(fā)生萎縮,突觸丟失,BDNF表達水平較低〔11〕。Malkesman等〔12〕研究發(fā)現(xiàn),DHEA在抑郁癥的神經(jīng)生物學(xué)中起重要作用,DHEA可能通過調(diào)節(jié)BDNF表達水平改善抑郁癥狀,提高BDNF的含量可以提升受損區(qū)域相關(guān)營養(yǎng)蛋白表達水平,改善突觸可塑性,發(fā)揮抗抑郁的作用〔13〕。NT-3也是一種重要的營養(yǎng)因子,可以修復(fù)損傷的突觸,誘導(dǎo)軸突生長及促進神經(jīng)元分化。Rahmani等〔14〕研究發(fā)現(xiàn),NT-3間接地受到大腦中BDNF水平的影響,增加BDNF表達水平可以促進NT-3分泌。NT-3和BDNF在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮較為重要的作用。本實驗結(jié)果提示,DHEA對VD小鼠抑郁樣行為的改善作用機制可能與調(diào)節(jié)NT表達有關(guān)。

腦血管病變可引起局部或全腦供血不足,導(dǎo)致?lián)p傷腦組織,是VD發(fā)生的主要病因。腦組織對缺血極其敏感,尤其是海馬組織,缺血導(dǎo)致海馬突觸發(fā)生變性和丟失,同時也會改變突觸相關(guān)蛋白表達水平,進而影響突觸可塑性;突觸生長受突觸相關(guān)蛋白所調(diào)控,其蛋白表達水平的改變會導(dǎo)致抑郁和焦慮等精神行為異常的發(fā)生〔15〕。突觸小泡蛋白(SYP)不僅影響突觸結(jié)構(gòu),而且還可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,進而影響突觸可塑性。突觸后致密蛋白(PSD)-95位于突觸后致密區(qū),含量豐富,它在谷氨酸受體動力學(xué)的過程中發(fā)揮重要作用,從而在突觸的功能和可塑性中起重要作用。GAP-43被認為是突觸生長的標(biāo)志物,在神經(jīng)系統(tǒng)損傷的過程中,GAP-43高表達可對軸突生長起促進作用〔16〕。前期的研究〔17〕發(fā)現(xiàn),DHEA可以上調(diào)VD小鼠SYP和PSD-95等突觸相關(guān)蛋白表達水平。本實驗結(jié)果提示,DHEA顯著增加了VD小鼠海馬組織中GAP-43表達,DHEA對VD小鼠抑郁樣行為的改善作用機制可能與調(diào)節(jié)突觸相關(guān)蛋白表達有關(guān)。

綜上所述,DHEA可通過上調(diào)NT-3、BDNF和GAP-43蛋白的表達,調(diào)節(jié)VD小鼠NT的表達,提高突觸的可塑性,發(fā)揮其改善VD抑郁樣行為的作用。