王進 霍穎浩 樊登云 殷立新

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院 1藥學部,河北 石家莊 050000;2神經內科)

細胞外β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積和細胞內神經原纖維纏結的形成是阿爾茨海默病(AD)的主要病理特征〔1〕。Aβ是體內新陳代謝產物,其過度積累可促進線粒體分裂,破壞線粒體膜電位,增加細胞內活性氧水平,促進細胞氧化應激和凋亡〔2〕。目前,雖然對AD的診斷和治療給予極大關注,但預防AD發(fā)展策略仍然有限。小白菊內酯是一種倍半萜稀內酯類化合物,具有抗炎、抗癌和免疫調節(jié)活性等藥理作用〔3〕。研究表明,小白菊內酯可影響小鼠帕金森病模型黑質中炎癥因子環(huán)氧合酶(COX)-2及其產物的表達進而對多巴胺能神經元起到保護作用〔4〕。小白菊內酯還可保護神經細胞免受糖氧剝奪誘導的凋亡和氧化應激〔5〕。研究表明,長鏈非編碼RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)等ncRNA與AD的發(fā)病機制有關,是AD治療、診斷和預防的潛在靶點。AD患者中miR-590-3p表達降低〔6〕。過表達miR-590-3p可減弱1-甲基-4苯基吡啶(MPP+)誘導的SH-SY5Y細胞線粒體功能障礙和氧化應激〔7〕。DIANA預測到miR-590-3p可能是LINC00299的潛在靶點。已有研究顯示,敲減LINC00299可改善氧化型低密度脂蛋白誘導的人主動脈平滑肌損傷〔8〕。但小白菊內酯是否調控LINC00299/miR-590-3p對AD細胞損傷發(fā)揮保護作用并不清楚。本研究擬以Aβ1～42誘導SK-N-SH復制AD細胞損傷模型〔9〕,探討小白菊內酯對AD模型細胞損傷的保護作用,并評估其機制是否與調控LINC00299/miR-590-3p通路相關。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人神經母細胞瘤細胞SK-N-SH購自中國科學院上海細胞庫;小白菊內酯(純度≥98%,貨號B21375)購于上海源葉生物;Aβ1～42購自美國Sigma-Aldrich公司;熒光素酶報告載體、pcDNA-RNA、si-RNA、miRNA mimics購于廣州銳博生物公司;cDNA逆轉錄試劑盒購于美國Thermo Fisher公司;實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)試劑盒購于北京百奧萊博生物公司;膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒、細胞計數(shù)試劑盒(CCK-8)購于福州飛凈生物公司;丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購于北京索萊寶生物公司;羊抗鼠IgG二抗,鼠源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司。

1.2細胞培養(yǎng)、轉染和實驗分組 SK-N-SH細胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用5 μmol/L的Aβ1～42作用于SK-N-SH細胞24 h復制AD細胞模型〔9〕,記為模型(Model)組。利用脂質體Lipofectamine2000分別將si-NC、si-LINC00299、pcDNA、pcDNA-LINC00299轉染SK-N-SH細胞,轉染48 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。分別用含5 μmol/L的Aβ1～42和10、20、50 μmol/L小白菊內酯〔10〕培養(yǎng)液孵育SK-N-SH細胞,分別記為Model+小白菊內酯低劑量(Parthenolide-L)組、Model+Parthenolide-中劑量(M)組、Model+Parthenolide-高劑量(H)組。用含5 μmol/L的Aβ1～42和50 μmol/L 小白菊內酯培養(yǎng)液孵育轉染pcDNA-LINC00299、轉染pcDNA細胞,分別記為Model+Parthenolide-H+pcDNA-LINC00299組、Model+Parthenolide-H+pcDNA組。Con組為正常培養(yǎng)的SK-N-SH細胞。

1.3RT-qPCR檢測LINC00299和miR-590-3p表達 Trizol法提取細胞總RNA,逆轉錄后,采用一步法熒光定量PCR試劑盒進行RT-qPCR。2-ΔΔCt法評估LINC00299(內參為GAPDH)和miR-590-3p(內參為U6)表達量。

1.4CCK-8法檢測SK-N-SH細胞活力 將轉染或未轉染細胞以每孔2×103個/100 μl的密度接種于96孔板,按照上述分組加入含不同濃度小白菊內酯或(和)5 μmol/L的Aβ1～42的培養(yǎng)液,24 h后,加入CCK-8工作液孵育2.5 h。酶標儀測定450 nm處的吸光度(OD)以評估細胞活力。

1.5流式細胞術檢測SK-N-SH細胞凋亡率 用500 μl 1×結合緩沖液(含5 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl PI)在暗室孵育SK-N-SH細胞15 min。流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.6SK-N-SH細胞中MDA含量、SOD和LDH活性檢測 SK-N-SH細胞處理完畢后,分別收集細胞培養(yǎng)液和細胞。使用LDH活性試劑盒檢測培養(yǎng)液中的LDH活性。同時,向含有SK-N-SH細胞沉淀的離心管中加入1 ml提取液,超聲波破碎細胞,超低溫離心機(10 000 r/min)離心10 min收集上清液,采用MDA、SOD、MDA試劑盒測定。

1.7Western印跡檢測SK-N-SH細胞中Bax和Bcl-2蛋白表達 RIPA法提取蛋白。按照每泳道50 μg加載蛋白,設置電壓100 V、時間120 min進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。設置電流20 mA轉膜過夜。膜封閉后,用鼠源GAPDH、Bcl-2或Bax一抗孵育膜2 h,再用羊抗鼠酶標二抗孵育膜1 h。將膜置于孵育盒內,加入化學發(fā)光顯色液進行顯色反應。ImageJ軟件分析目的條帶相對灰度值。

1.8雙熒光素酶報告實驗驗證LINC00299和miR-590-3p靶向關系 合成LINC00299野生型(WT)序列(包含miR-590-3p結合位點)或LINC00299突變型(MUT)序列(含有miR-590-3p突變位點)并分別插入pmirGLO載體WT-LINC00299、MUT-LINC00299。將這些載體與miR-590-3p mimic或miR-NC共轉染至SK-N-SH細胞。轉染48 h測定相對熒光素酶活性。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1小白菊內酯對Aβ1～42處理SK-N-SH損傷的影響 與Con組比較,Model組SK-N-SH細胞LINC00299表達量、凋亡率、Bax蛋白表達量顯著升高,miR-590-3p表達量、細胞活力(OD值)、Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05);與Model組比較,Model+Parthenolide-M組、Model+Parthenolide-H組SK-N-SH細胞LINC00299表達量、凋亡率、Bax蛋白表達量顯著降低,miR-590-3p表達量、細胞活力(OD值)、Bcl-2蛋白表達量顯著升高(P<0.05);與Model+Parthenolide-M組比較,Model+Parthenolide-H組SK-N-SH細胞LINC00299表達量、凋亡率、Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05),miR-590-3p表達量、細胞活力(OD值)、Bcl-2蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見圖1、表1、圖2。

表1 小白菊內酯對Aβ1～42處理SK-N-SH損傷的影響

2.2小白菊內酯對Aβ1～42處理SK-N-SH氧化應激的影響 與Con組比較,Model組SK-N-SH細胞MDA含量、LDH釋放量顯著增加,SOD活性顯著降低(P<0.05);與Model組比較,Model+Parthenolide-M組、Model+ Parthenolide-H組SK-N-SH細胞MDA含量、LDH釋放量顯著降低,SOD活性顯著升高(P<0.05);與Model+Parthenolide-M組比較,Model+Parthenolide-H組MDA含量、LDH釋放量顯著降低,SOD活性顯著升高(P<0.05)。見表2。

1～7:Con組、Model組、Model+Parthenolide-L組、Model+Parthenolide-M組、Model+Parthenolide-H組、Model+Parthenolide-H+pcDNA組、Model+Parthenolide-H+pcDNA-LINC00299組圖2 各組Bax、Bcl-2蛋白表達

表2 小白菊內酯減輕Aβ1～42誘導的SK-N-SH細胞氧化應激

2.3過表達LINC00299可逆轉小白菊內酯對Aβ1～42處理SK-N-SH損傷的影響 與Model+Parthenolide-H+pcDNA組比較,Model+ Parthenolide-H+pcDNA-LINC00299組SK-N-SH細胞LINC00299表達量、凋亡率、Bax蛋白表達量顯著升高,miR-590-3p表達量、細胞活力(OD值)、Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。見圖2、圖3、表3。

圖3 LINC00299可逆轉小白菊內酯對Aβ1～42處理SK-N-SH凋亡的影響

表3 LINC00299可逆轉小白菊內酯對Aβ1～42誘導的SK-N-SH細胞損傷

2.4過表達LINC00299可逆轉小白菊內酯對Aβ1～42處理SK-N-SH氧化應激的影響 與Model+Parthenolide-H+pcDNA組MDA含量、LDH釋放量、SOD活性〔(44.29±1.98)nmol/ml、(163.48±11.66)U/L、(274.46±11.07)U/L〕比較,Model+Parthenolide-H+pcDNA-LINC00299組SK-N-SH細胞MDA含量〔(100.44±4.49)nmol/ml〕、LDH釋放量〔(290.04±4.19)U/L〕顯著增加,SOD活性〔(135.92±5.15)U/L〕顯著降低(t=19.819、17.692、19.654,均P=0.000,n=3)。

2.5LINC00299靶向miR-590-3p DIANA工具預測到miR-590-3p與LINC00299序列間存在互補結合位點。見圖4。轉染miR-590-3p mimic后細胞中WT-LINC00299的相對熒光素酶活性(0.13±0.01)與轉染miR-NC(1.01±0.07)比較顯著降低(t=21.566,P=0.000)。而轉染miR-590-3p mimic后細胞中MUT-LINC00299的相對熒光素酶活性(0.97±0.05)與轉染miR-NC(0.99±0.07)無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

圖4 LINC00299和miR-590-3p的互補序列

3 討 論

小白菊內酯是草本植物艾菊的主要活性成分,廣泛用于治療發(fā)熱、偏頭痛、關節(jié)炎和淺表炎癥,臨床應用安全性高。Wang等〔11〕采用腦卒中模型證實小白菊內酯可抑制促炎因子分泌、抵抗氧化應激、減少凋亡。有研究〔12〕發(fā)現(xiàn),小白菊內酯通過促進M2小膠質細胞/巨噬細胞極化可緩解神經疼痛。Tao等〔13〕指出,小白菊內酯還可促進軸突再生,增加髓鞘重建,減少硫酸軟骨素的形成,抑制瘢痕增生,調節(jié)M1/M2極化促進脊髓損傷修復。以上研究表明,小白菊內酯具有潛在的神經保護作用。本研究發(fā)現(xiàn),中、高劑量的小白菊內酯處理可有效提高Aβ1～42誘導的SK-N-SH細胞活力、SOD活性,抑制細胞凋亡和LDH釋放,降低MDA含量。同時,小白菊內酯還上調Bcl-2蛋白、下調Bax蛋白表達。Aβ過度積累可增加細胞內活性氧水平,當活性氧生成大于SOD等抗氧化酶的清除能力時可促進脂質過氧化,進而導致終產物MDA生成及細胞損傷標志物LDH釋放〔14〕。Bax細胞內重要促凋亡蛋白,其上調可轉位到線粒體膜,改變線粒體膜電位等一系列凋亡促進因子釋放進而加劇細胞凋亡,抗凋亡蛋白Bcl-2通過結合Bax起著相反作用〔15〕。以上結果表明,小白菊內酯減弱了Aβ1～42誘導的SK-N-SH細胞凋亡和氧化應激。

lncRNA和miRNA是類內源性RNA轉錄本,其通過調控細胞生理過程,參與包括AD在內多種人類疾病進展。如抑制lncRNA核富集轉錄體(NEAT)1通過負調控miR-107表達可抑制AD模型細胞凋亡〔16〕。本研究中Aβ1～42處理顯著增加SK-N-SH細胞中LINC00299表達,降低miR-590-3p表達,而小白菊內酯處理顯著減弱Aβ1～42對LINC00299和miR-590-3p表達的影響,提示小白菊內酯對AD模型細胞保護作用可能與調控LINC00299和miR-590-3p表達相關。有研究指出,動脈粥樣硬化患者LINC00299表達增加,抑制LINC00299表達可抑制血管平滑肌細胞和血管內皮細胞增殖和遷移,并改善氧化型低密度脂蛋白誘導的血管平滑肌細胞氧化損傷〔17,8〕。深入分析發(fā)現(xiàn),miR-590-3p是LINC00299的直接靶點,提示可能存在LINC00299/miR-590-3p軸。過表達LINC00299顯著逆轉小白菊內酯對Aβ1～42誘導SK-N-SH細胞凋亡、氧化應激及miR-590-3p表達的影響,表明小白菊內酯可能通過調控LINC00299/miR-590-3p途徑對AD模型細胞發(fā)揮保護作用。

綜上,小白菊內酯可減弱Aβ1～42誘導的SK-N-SH細胞損傷,其機制可能與調控LINC00299/miR-590-3p途徑相關,豐富了小白菊內酯的神經保護作用機制。