馬亞飛

(河南省中醫(yī)院藥學(xué)部,河南 鄭州 450000)

阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病均表現(xiàn)出年齡依賴性〔1〕,神經(jīng)細(xì)胞衰老是神經(jīng)退行性病變的主要誘因,促進(jìn)衰老的因子可能參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生與發(fā)展,延緩衰老有助于降低發(fā)病風(fēng)險〔2〕。衰老的機(jī)制十分復(fù)雜,包括表觀遺傳改變、基因穩(wěn)定性降低、端?？s短、線粒體功能障礙、蛋白水解遺傳等,氧化應(yīng)激在其中發(fā)揮重要作用〔3〕。近年來研究發(fā)現(xiàn),總黃酮可通過調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等氧化應(yīng)激關(guān)鍵因子表達(dá),降低活性氧水平,進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用〔4〕;此外總黃酮還可通過清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過氧化來延緩機(jī)體衰老過程〔5〕。生物堿和黃酮是苦參的主要有效成分,目前已對生物堿類成分進(jìn)行了較多研究報道,評價苦參的質(zhì)量也主要通過生物堿含量來決定〔6〕,但對于黃酮類成分的研究仍十分少見。本研究旨在探討苦參總黃酮對D-半乳糖致神經(jīng)細(xì)胞衰老的改善作用及相關(guān)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1細(xì)胞與主要試劑 PC12神經(jīng)元細(xì)胞購于北京伊萊瑞生物科技有限公司;苦參總黃酮(批號:ST15692)購于成都彼樣生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于哈靈(上海)生物科技有限公司;D-半乳糖購于美國Sigma公司;超氧化物歧化酶、丙二醛、乳酸脫氫酶檢測試劑盒購于上海舜冉生物科技有限公司;鼠抗人B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax)單克隆抗體、兔抗人細(xì)胞色素(Cyt)-C單克隆抗體、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、鼠抗人核因子E2相關(guān)因子(Nrf)2單克隆抗體、兔抗人血紅素氧合酶1單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體及羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG購于天津卡梅德生物科技有限公司。

1.2PC12神經(jīng)元細(xì)胞衰老模型建立與分組 PC12神經(jīng)元細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),取傳至第4代的細(xì)胞按2×108個/L,每孔200 μl的密度接種到96孔板中,用含D-半乳糖的完全培養(yǎng)基孵育24 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育,D-半乳糖終濃度為40 mg/ml。造模成功后分為模型組,10、20、40 μg/ml苦參總黃酮組,每組10個復(fù)孔,同時設(shè)置空白對照組?？瞻讓φ战M使用正常PC12細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng);模型組使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng);不同劑量苦參總黃酮組完全培養(yǎng)基中分別加入終濃度為10、20、40 μg/ml的苦參總黃酮。上述各組繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞存活率、衰老細(xì)胞情況、凋亡率檢測 四甲基唑藍(lán)(MTT)法檢測各組細(xì)胞存活率,細(xì)胞存活率=(苦參總黃酮組或模型組吸光度值-陰性對照組吸光度值)/(空白對照組吸光度值-陰性對照組吸光度值)×100%。β-半乳糖苷酶染色試劑盒檢測各組細(xì)胞衰老情況,光學(xué)顯微鏡下計數(shù)染藍(lán)色的衰老細(xì)胞數(shù)目,計算β-半乳糖苷酶陽性染色率。細(xì)胞凋亡檢測:向各組細(xì)胞中加入膜聯(lián)蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)結(jié)合緩沖液(10倍)工作液將細(xì)胞重懸,加入Annexin V-PE/7-AAD熒光雙染色劑各5 μl,避光靜置20 min,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.4細(xì)胞周期分布情況檢測 取各組細(xì)胞接種到96孔板中,孵育24 h,2 000 r/min離心5 min,棄去上清,磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞,再次離心后棄去上清,輕彈離心管底部將細(xì)胞分散,避免成團(tuán)聚集,加入預(yù)冷的70%酒精1 ml,吹打混合均勻,4 ℃固定40 min,2 000 r/min離心5 min,棄去上清。向離心管中加入碘化丙啶(PI)染色液500 μl重懸細(xì)胞沉淀,37 ℃避光靜置30 min,使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.5各組細(xì)胞抗氧化指標(biāo)檢測 取各組細(xì)胞制成約10%勻漿液,放于-20 ℃中冰融3次,光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞破碎情況,若破碎不完全繼續(xù)冰融2次;3 000 r/min離心10 min,收集上清液,按照試劑盒檢測說明書測定超氧化物歧化酶、丙二醛、乳酸脫氫酶濃度。

1.6Western印跡檢測各組細(xì)胞中Bax、Cyt-C、Bcl-2、Nrf2、血紅素氧合酶1蛋白表達(dá)水平 RIPA細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白,二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度,電泳后將目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,封閉2 h,加入鼠抗人Bax單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗人Cyt-C單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體(1∶500稀釋)、鼠抗人Nrf2單克隆抗體(1∶500稀釋)、兔抗人血紅素氧合酶1單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶2 000稀釋),4 ℃孵培育過夜,加入二抗:辣根過氧化物沒標(biāo)記的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG,均為1∶4 000稀釋,室溫下孵育1 h,電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影,使用ImageJ軟件讀取各條帶的灰度值。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞存活率、衰老細(xì)胞情況、凋亡率比較 模型組細(xì)胞存活率明顯低于空白對照組,β-半乳糖苷酶陽性染色率、細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對照組(P<0.01);苦參總黃酮組細(xì)胞存活率明顯高于模型組,β-半乳糖苷酶陽性染色率、細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組,且隨著苦參總黃酮給藥濃度的增加變化逐漸明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2各組細(xì)胞周期分布情況比較 各組G0/G1期、S期細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);模型組G0/G1期細(xì)胞比例明顯高于空白對照組,S期細(xì)胞比例明顯低于空白對照組(P<0.01);苦參總黃酮組G0/G1期細(xì)胞比例明顯低于模型組,S期細(xì)胞比例明顯高于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞存活率、衰老細(xì)胞、凋亡率及細(xì)胞周期分布比較

2.3各組細(xì)胞抗氧化指標(biāo)水平比較 各組超氧化物歧化酶、丙二醛、乳酸脫氫酶濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.001);模型組超氧化物歧化酶濃度明顯低于空白對照組,丙二醛、乳酸脫氫酶濃度明顯高于空白對照組(P<0.01);苦參總黃酮組超氧化物歧化酶濃度明顯高于模型組,丙二醛、乳酸脫氫酶濃度明顯低于模型組,且隨著苦參總黃酮給藥濃度的增加變化逐漸明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.4各組細(xì)胞中Bax、Cyt-C、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較 各組Bax、Cyt-C、Bcl-2蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);模型組Bax蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對照組,Cyt-C、Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯低于空白對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);苦參總黃酮組Bax蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組,Cyt-C、Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯高于模型組,且隨著苦參總黃酮給藥濃度的增加變化逐漸明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 各組細(xì)胞抗氧化指標(biāo)水平及細(xì)胞中Bax、Cyt-c、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較

1～5:空白對照組、模型組、10、20、40 μg/ml苦參總黃酮組;下圖同圖1 各組細(xì)胞中Bax、Cyt-C、Bcl-2蛋白表達(dá)

2.5各組細(xì)胞中Nrf2、血紅素氧合酶1蛋白表達(dá)水平比較 各組Nrf2、血紅素氧合酶1蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);模型組Nrf2、血紅素氧合酶1蛋白表達(dá)水平明顯高于空白對照組(P<0.01);苦參總黃酮組明顯低于模型組,且隨著苦參總黃酮給藥濃度的增加變化逐漸明顯,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 各組細(xì)胞中Nrf2、血紅素氧合酶1蛋白表達(dá)

表3 各組細(xì)胞中Nrf2、血紅素氧合酶1蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

正常生理狀態(tài)下D-半乳糖經(jīng)肝臟代謝,當(dāng)其濃度異常升高時會逐漸積累,造成細(xì)胞滲透壓改變、腫脹及細(xì)胞膜脂受損,還能夠與胺相互作用,生成高級糖基化終產(chǎn)物,引發(fā)細(xì)胞衰老〔7,8〕。本研究使用D-半乳糖建立PC12神經(jīng)元細(xì)胞衰老模型。氧化應(yīng)激是引發(fā)細(xì)胞衰老的主要原因之一,主要由抗氧化反應(yīng)系統(tǒng)與自由基生成水平之間平衡失調(diào)所致,中樞神經(jīng)系統(tǒng)對氧化應(yīng)激損傷的敏感度最高。近年來研究發(fā)現(xiàn),總黃酮具有抗氧化作用,能夠防止細(xì)胞退化、衰老;其中金雀異黃酮對衰老H9c2細(xì)胞具有保護(hù)作用〔9〕;歐亞旋覆花總黃酮能夠?qū)筁929細(xì)胞衰老和自噬〔10〕;但關(guān)于苦參總黃酮對神經(jīng)元細(xì)胞衰老影響的研究仍十分少見。

本研究結(jié)果提示,苦參總黃酮能夠提高衰老神經(jīng)細(xì)胞的存活率,減少衰老神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量,降低細(xì)胞凋亡率,且呈劑量依賴性,隨著給藥濃度的增加作用效果更加明顯。細(xì)胞衰老時細(xì)胞周期會停留在G1期,細(xì)胞快速增殖時細(xì)胞周期會停留在S期〔11〕。本研究結(jié)果說明苦參總黃酮能夠有效降低停留在G1期的細(xì)胞比例,升高S期細(xì)胞比例,進(jìn)而提高衰老細(xì)胞的增殖活力?？寡趸瘧?yīng)激能力直接影響到對抗細(xì)胞衰老的效果,超氧化物歧化酶參與維持機(jī)體的氧化與抗氧化平衡〔12〕。當(dāng)機(jī)體存在大量超氧自由基時會與膜脂質(zhì)反應(yīng)生成丙二醛,過量累積的丙二醛會損傷細(xì)胞膜的正常結(jié)構(gòu)和功能〔13〕。乳酸脫氫酶是一種氧化還原酶,與氧化應(yīng)激水平密切相關(guān)〔14〕。結(jié)合本研究結(jié)果可知苦參總黃酮可通過升高超氧化物歧化酶水平,降低丙二醛、乳酸脫氫酶水平來降低衰老神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷程度。

細(xì)胞凋亡是一個多種因子共同參與的復(fù)雜過程,其中促凋亡因子Bax、Cyt-C與抗凋亡因子Bcl-2平衡失調(diào)發(fā)揮重要作用〔15〕。本研究結(jié)果提示,苦參總黃酮可通過下調(diào)Bax蛋白表達(dá),上調(diào)Cyt-C、Bcl-2蛋白表達(dá)來降低衰老神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率。Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子,具有很高的敏感性,同時也是抗氧化防御細(xì)胞的調(diào)控因子,與下游抗氧化酶表達(dá)水平密切相關(guān)〔16〕。血紅素氧合酶1是Nrf2信號通路下游的抗氧化蛋白,能夠降低氧化應(yīng)激損傷,抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔17〕。本研究提示,苦參總黃酮可通過促進(jìn)Nrf2表達(dá)來提高下游抗氧化蛋白血紅素氧合酶1水平,進(jìn)而抵抗氧化應(yīng)激的發(fā)生,改善D-半乳糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞衰老,在神經(jīng)退行性疾病防治中具有潛在的應(yīng)用價值。