鄭彭予 肖靜 黎清俊羽 王閣 律廣富 王雨辰 林喆 徐巖 黃曉巍,4

(1長春中醫(yī)藥大學藥學院臨床藥學與中藥藥理教研室,吉林 長春 130117;2中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所;長春中醫(yī)藥大學 3吉林省人參科學研究院中藥藥理組;4東北亞中醫(yī)藥研究院基礎(chǔ)研究所)

心血管疾病已成為全球最常見的死因之一〔1〕,且心肌細胞屬于終末分化的細胞不能再生。所以,防止心肌細胞損傷和丟失是現(xiàn)代醫(yī)學的治療策略〔2〕,在醫(yī)療領(lǐng)域也是一項重大挑戰(zhàn)。中醫(yī)學認為,腎主水,心腎相通,心腎陽虛是導(dǎo)致心肌損害的主要病機,心陽不足,久病累及腎臟,導(dǎo)致腎臟元陰元陽受損,陽虛不振,陰虛不振,或腎陽不足,氣化不足,水氣逆心,導(dǎo)致心力衰竭,故名曰:“補心,固腎,固心,固心”。從心肌損害的臨床特征來看,心腎陽虛為其病理學基礎(chǔ),但目前尚無有效的治療方法〔3〕。治療該病的要點是“溫陽逐水”“活血化瘀”“通心腎”,陽氣充盛,則水氣運行順暢,五臟才能正常行使其生理功能。心腎陽虛證臨床上最常見的癥狀是心悸、水腫等。心虛膽小、心血虧損、痰阻心脈、水飲逆心、心陽虛損是中醫(yī)辨證的基本特征。中醫(yī)學認為,心陽能下通腎水,腎陰能上通心陽。因此,在治療心腦血管疾病時,如有畏寒肢冷、面色蒼白等陽氣不足之癥,常以鹿茸為藥,以溫腎陽,扶心陽。

鹿茸主要活性成分鹿茸多肽(VAP)具有促進成骨、造血、神經(jīng)、表皮和毛發(fā)生長的作用,而且還含有大量表皮生長因子(EGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等多種細胞生長因子,可以在抗氧化、抗炎、抗癌、心肌保護、腎臟保護等多個方面發(fā)揮防治作用〔4〕。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)〔5〕,VAP對阿霉素所致的心肌損傷大鼠有不同程度的保護作用,但VAP能否改善腎陽虛證下心肌損傷模型大鼠的心腎功能尚不明確。本研究擬探索VAP對腎陽虛證下心肌損傷模型大鼠心腎功能的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器 48只SPF級12周齡雄性健康SD大鼠,體質(zhì)量180～200 g,均購自長春億斯科技有限公司,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK-(吉)-2022-0002。VAP(長春中醫(yī)藥大學藥學院制備,每1 g VAP約含生藥鹿茸28.9 g,批號:20221020),氫化可的松注射液(山西芮城縣紅寶獸醫(yī)有限責任公司,批號:2202121),鹽酸貝那普利片(北京諾華制藥有限公司,批號:2207A06),Protein Marker(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號:P0068),蘇木素-伊紅(HE)染液、依文思藍(北京索萊寶科技有限公司,貨號:D1120、E8010),丙二醛(MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號:A003-2-2、A001-3-1、A020-2-1),環(huán)磷酸腺苷(cAMP)檢測試劑盒、磷酸肌酸同工酶(CK-MB)檢測試劑盒、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)檢測試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司,貨號:A003-4-1、H197-1-1、A020-2-1),轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、VEGF抗體、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,貨號:69012-1-Ig、19003-1-AP、20960-1-AP),超純水制備系統(tǒng)(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司,型號:WP-RO-40B),光學顯微鏡(日本OLSMPUS公司,型號:Gallios),超低溫冰箱(美國Thermo公司,型號:ULT1386-3-V41),多道生理記錄儀(埃德儀器國際貿(mào)易有限公司,型號:ML224),離心機(德國艾本德股份公司,型號:Centrifuge 5810 R),恒溫培養(yǎng)箱(EYEL4公司,型號:SLI-700),熒光發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(英國UVItec公司,型號:Q9-Alliance),多功能微孔板酶標儀(美國賽默飛世爾有限公司,型號:SUNERGY-HTX),電泳儀、電泳槽(美國伯樂Bio-Rad公司,型號:BE6085)。

1.2實驗動物分組及模型制備 大鼠自由進食和飲水,飼養(yǎng)環(huán)境:12 h光/暗循環(huán)、恒溫(23～25 ℃)、恒濕(40%～70%),適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。采用隨機平行對照分配法將48只大鼠分為空白組、模型組、陽性藥組〔鹽酸貝那普利片0.5 mg/(kg·d)〕、低、中、高劑量VAP組〔100、200、300 mg/(kg·d)VAP〕。除空白組外,各組肌肉注射氫化可的松25 mg/(kg·d),1次/d,連續(xù)肌注21 d,同時腹腔注射阿霉素2.2 mg/(kg·d),復(fù)制腎陽虛證下心肌損傷大鼠模型。造模結(jié)束后以大鼠體征變化、心電圖ST段明顯升高為模型成功判斷標準。造模成功后連續(xù)給藥28 d。陽性藥組灌胃右歸丸600 mg/(kg·d)和酒石酸美托洛爾片20 mg/(kg·d),不同劑量VAP組灌胃相應(yīng)劑量VAP,空白組、模型組灌胃相等體積蒸餾水。末次給藥2 h后,麻醉大鼠進行腹主動脈取血,將每只大鼠血清低溫-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3各組體征監(jiān)測 觀察大鼠體質(zhì)量、食欲、大便、毛發(fā)的光澤度、活動度、精神狀態(tài)等并做記錄。

1.4各組心電圖檢測 以戊巴比妥鈉(30 mg/kg)作為麻醉藥物腹腔注射,在大鼠失去翻正反射時將大鼠與心電圖處理系統(tǒng)相連進行測量。

1.5HE染色觀察各組心肌組織及腎臟組織纖維化和微血管損傷情況 將各組大鼠處死后,取出心臟及腎臟,用生理鹽水漂洗,使用4%多聚甲醛進行固定后分別加入不同濃度酒精梯度脫水,再使用二甲苯進行透明處理,最后用石蠟包埋制成石蠟切片。經(jīng)過HE染色,中性樹脂封片,在顯微鏡下觀察其纖維化和微血管損傷情況改變表現(xiàn)并拍照記錄。

1.6生化法檢測各組血清SOD活性、LDH和MDA水平 按照試劑盒說明書方法步驟分別檢測大鼠血清生化指標SOD活性、LDH和MDA水平。

1.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組血清cAMP、cGMP和CK-MB水平 按照ELISA試劑盒說明書步驟進行。

1.8Western印跡檢測各組腎臟組織中VEGF、HIF-1和TGF-β1蛋白表達水平 按照常規(guī)方法提取各組腎臟組織蛋白,檢測VEGF、HIF-1和TGF-β1蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組體征 空白組眼睛有神,動作敏捷,毛發(fā)光澤濃密,緊貼軀體,食量和排泄均正常;模型組出現(xiàn)兩眼無神,精神萎靡,行動遲緩,活動耐力下降,皮毛干枯易脫落,相互扎堆,足背水腫,體質(zhì)量下降,食欲不振,尿量減少等腎陽虛證特征性表現(xiàn);陽性藥組和高劑量VAP組一般狀態(tài)接近于正常組。與空白組比較,模型組體質(zhì)量增長速度明顯降低(P<0.01);與模型組比較,陽性藥組、中和高劑量VAP組體質(zhì)量增長速度明顯升高(P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 各組體質(zhì)量比較

2.2各組心電圖檢測 除空白組外,其他實驗組ST段均明顯升高;與模型組比較,陽性藥組,低、中和高劑量VAP組ST段明顯降低。見圖1。

圖1 各組心電圖

2.3各組血清SOD活性、LDH和MDA水平比較 與空白組比較,模型組血清SOD活性明顯降低,LDH和MDA水平明顯升高(P<0.01);與模型組比較,陽性藥組、中、高劑量VAP組血清中SOD活性明顯升高,LDH和MDA水平明顯降低(P<0.05,P<0.01)。見表2。

2.4各組血清cAMP、cGMP和CK-MB水平與空白組比較,模型組血清cGMP水平明顯升高,cAMP和CK-MB水平明顯降低(P<0.01);與模型組比較,陽性藥組、中、高劑量VAP組cGMP水平明顯降低,cAMP和CK-MB水平明顯升高(P<0.05,P<0.01)。見表2。

表2 各組血清SOD活性、LDH和MDA水平及cGMP、cAMP和CK-MB水平比較

2.5各組心肌組織病理形態(tài)表現(xiàn) HE染色結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組心肌纖維排列混亂,纖維化明顯,有大量炎癥細胞浸潤,間隔變大;與模型組比較,陽性藥組、中、高劑量VAP組心臟組織侵襲及纖維化程度均明顯降低。見圖2。

2.6各組腎臟組織病理形態(tài)表現(xiàn) HE染色結(jié)果顯示:與空白組比較,模型組腎組織結(jié)構(gòu)異常,部分腎小管上皮細胞萎縮,管腔擴張,如黃色箭頭所示;部分腎小球萎縮,毛細血管袢結(jié)構(gòu)不清晰,如紅色箭頭所示;間質(zhì)可見纖維組織及炎癥細胞增生,如黑色箭頭所示;與模型組比較,陽性藥組、中劑量VAP組和高劑量VAP組腎小球萎縮,纖維化及炎癥細胞均有所減輕。見圖2。

圖2 各組心肌、腎臟組織病理形態(tài)(HE染色,×200)

2.7各組腎臟組織中VEGF、HIF-1和TGF-β1蛋白表達水平比較 與空白組比較,模型組腎臟組織中HIF-1和TGF-β1蛋白表達水平明顯升高,VEGF蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)。與模型組比較,陽性藥組和中、高劑量VAP組腎臟組織中HIF-1和TGF-β1蛋白表達水平明顯降低(P<0.05,P<0.01),低劑量組VAP組HIF-1顯著降低(P<0.01),陽性藥組和中、高劑量VAP組VEGF蛋白表達水平明顯升高(P<0.05,P<0.01)。見表3、圖3。

表3 各組腎臟組織中VEGF、HIF-1和TGF-β1蛋白表達水平

1～6:空白組,模型組,陽性藥組,高、中、低劑量VAP組圖3 各組腎臟組織中VEGF、HIF-1和TGF-β1表達

3 討 論

無論在發(fā)展中國家還是在發(fā)達國家,心血管疾病發(fā)病率均不斷攀升〔6〕。針對冠心病、高血壓等多種心腦血管疾病,目前尚無有效防治藥物。大部分植物產(chǎn)物作為藥材可以發(fā)揮其保護效益,通過降低機體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化作用,恢復(fù)鈣離子平衡,減少心肌損傷標志物和促炎細胞因子表達,調(diào)節(jié)凋亡水平下降來修復(fù)及保護心肌損傷〔7～9〕。而鹿茸作為動物藥含有多種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑,可對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生更加積極的作用進而有益于健康〔10〕。研究表明〔11〕,鹿茸能夠升高心肌損傷后大鼠血管內(nèi)皮細胞生長因子的含量,從而促進血管生成并對血管內(nèi)皮細胞損傷進行修復(fù),具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗凋亡、清除組織自由基、減少體內(nèi)毒素蓄積、延緩神經(jīng)組織纖維化進程、抑制炎癥因子和神經(jīng)保護功能等作用,進而保護腎臟損傷。心肌缺血后,機體迅速生成大量自由基,過多自由基是造成心臟損害的主要原因,氧化自由基的清除可以通過兩種方式進行:(1)直接提供電子,還原氧自由基;(2)對氧自由基進行及時清除,使體內(nèi)抗氧化酶活性得到提高。SOD是一種十分重要的氧自由基清除劑,可以將氧自由基徹底清除進而保護機體不受損傷〔12,13〕。CK-MB是判斷心肌損傷程度的主要指標。LDH在各種組織中均有表達,以心臟和腎為最高,是一種普遍判斷心病及腎病的指標〔14〕。本研究結(jié)果顯示,VAP治療腎陽虛證心肌損傷大鼠可顯著改善其心肌及腎臟功能。近年來研究發(fā)現(xiàn)〔15,16〕,細胞內(nèi)cGMP的增加會使心肌細胞自律性下降。本研究結(jié)果提示,VAP可顯著改善腎陽虛證心肌細胞的凋亡,保護大鼠心肌功能。研究表明〔17〕,激活cAMP信號途徑可以對心肌起到保護作用,cAMP可以釋放具有活性的亞基,并將其轉(zhuǎn)移到細胞核中。也有研究證明〔18,19〕,cAMP的激活可以減輕因各種理化因素導(dǎo)致的心肌細胞凋亡。本研究結(jié)果提示VAP可顯著改善腎陽虛證心肌損傷大鼠的心肌功能,發(fā)揮心臟保護作用。腎組織中有豐富的間質(zhì)-肌成纖維細胞,而TGF-β1可調(diào)控成纖維細胞活化,當腎陽虛證大鼠心臟損傷后,腎臟TGF-β1蛋白水平高表達,腎臟纖維化程度明顯升高,且隨損傷程度增加而升高,是導(dǎo)致腎陽虛大鼠腎臟纖維化的重要原因〔20～22〕。本研究結(jié)果表明,VAP可以通過降低TGF-β1蛋白表達對大鼠腎臟發(fā)揮保護作用。VEGF是一種多功能肝素結(jié)合糖蛋白,可以促進內(nèi)皮細胞的有絲分裂和遷移,起到抗凋亡作用,還可以參與新生血管生成〔23,24〕。研究表明〔25～27〕,在腎臟發(fā)生纖維化時,VEGF表達顯著降低,與腎臟發(fā)生微循環(huán)障礙時相似。在腎臟損傷進程中,由于血液流量降低,腎小管上皮細胞出現(xiàn)HIF-1,導(dǎo)致腎臟內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)失衡。本實驗結(jié)果表明,HIF-1對VEGF的表達不利。本研究表明VAP可以改善腎纖維化中的微血管損傷。VAP可以影響腎陽虛證心肌損傷大鼠腎臟中HIF-1和VEGF蛋白表達水平來改善腎臟損傷。

綜上,用不同濃度VAP治療后,腎陽虛證下心肌損傷大鼠的宏觀體征及客觀指標等均有不同程度改善,且其作用效果與VAP劑量相關(guān)。其治療腎陽虛證心肌損傷大鼠可能通過抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗凋亡、糾正體內(nèi)自由基紊亂、調(diào)節(jié)cAMP、cGMP通路來減輕心肌及腎臟損傷、介導(dǎo)TGF-β1通路來調(diào)控成纖維細胞活化,使腎臟纖維化程度減輕和HIF-1與VEGF之間相互調(diào)節(jié)來保護心臟及腎臟的微血管損傷。然而,腎陽虛證心肌損傷的機制比較復(fù)雜,其中涉及的信號通路及蛋白并不是單獨作用,而是多條通路相互配合發(fā)揮治療作用。因此VAP發(fā)揮治療腎陽虛證心肌損傷的作用機制還有待進一步研究。