鄭金花 韋澤豐 王自強(qiáng)

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液凈化中心,海南 ?？?570100)

慢性腎衰竭(CRF)患者常伴有血管彈性功能低下,極易導(dǎo)致心血管疾病。血管鈣化是CRF患者發(fā)生心血管事件的高危因素〔1〕。自噬作為細(xì)胞的一種保護(hù)性機(jī)制,主要通過(guò)細(xì)胞降解并再利用多余大分子或無(wú)功能細(xì)胞器,為機(jī)體其他生命活動(dòng)提供原料和能量,可有效抑制血管鈣化〔2〕。自噬相關(guān)分子機(jī)制及信號(hào)通路較復(fù)雜,其中哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是諸多通路與分子機(jī)制作用的交匯點(diǎn),是自噬的負(fù)性調(diào)控因子〔3,4〕。雷帕霉素可通過(guò)抑制mTOR通路的 mTOR 復(fù)合物(mTORC)1來(lái)誘導(dǎo)自噬〔5〕。以往研究報(bào)道〔6,7〕,雷帕霉素可促進(jìn)腎小球足細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞的自噬活動(dòng)。然而鮮有研究報(bào)道雷帕霉素是否可抑制腎臟平滑肌細(xì)胞(VSMC)鈣化及其分子機(jī)制。本研究通過(guò)雷帕霉素抑制劑干預(yù)鈣化的大鼠腎臟VSMC,探討雷帕霉素抑制劑對(duì)CRF VSMC鈣化的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí),10～12周齡,雄性,Wistar 大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)自?？谄媪χ扑幱邢薰?動(dòng)物的使用許可證號(hào):SYXK(瓊)2017-0014。大鼠飼養(yǎng)在無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室〔使用許可證號(hào):SYXK(瓊)2017-0014〕,飼養(yǎng)室濕度(50±10)%、溫度(25±2)℃、12 h循環(huán)光照、通風(fēng)良好。正常飼養(yǎng)1 w,第2周開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。本研究中大鼠相關(guān)實(shí)驗(yàn)獲得醫(yī)院動(dòng)物管理倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):IACUC-20180217-61)。

1.2藥品與主要試劑 腺嘌呤(BR沃凱,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),Western印跡試劑盒(美國(guó)BD公司),全蛋白抽提試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司),戊巴比妥鈉(Sigma公司,美國(guó)),茜素紅染料〔購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司,規(guī)格:25 g/瓶,用Tris-HCl將其配制成0.1%茜素紅-Tris-HCl(pH8.3)溶液〕。

1.3動(dòng)物模型建立及分組 按照參考文獻(xiàn)〔8〕的方法構(gòu)建模型,取33只雄性昆明大鼠自由飲用2%葡聚糖硫酸鈉(DSS)水溶液共7 d,再普通飲水14 d。隨機(jī)選取3只大鼠取腎臟組織進(jìn)行病理學(xué)檢查,按照米海燕等〔9〕的方法證實(shí)模型構(gòu)建成功,將剩余30只大鼠隨機(jī)分為模型組、CRF+I組和CRF+I+3-甲基腺嘌呤(MA)組,每組10只。模型組、CRF+I組和CRF+I+3-MA組實(shí)驗(yàn)第1～4周給予腺嘌呤混懸液及含1.8%高磷飼料每日1次喂養(yǎng),第5～8周腺嘌呤改為隔日灌胃。CRF+I組同時(shí)給予雷帕霉素〔西羅莫司口服液,C51H79NO13,0.4 mg/(kg·d),杭州中美華東藥業(yè)有限公司,浙江杭州〕灌胃治療,1次/d。CRF+I+3-MA組給予相同劑量的雷帕霉素和5 mmol/L的3-MA灌胃,劑量2 ml,另取10只大鼠自造模第1天開(kāi)始始終給予生理鹽水灌胃作為對(duì)照組。共給藥8 w。實(shí)驗(yàn)結(jié)束2 d后小鼠斷頸處死。取出腎臟組織,生理鹽水沖洗后一半存儲(chǔ)于-80 ℃冰箱備用,另一半放于4%多聚甲醛溶液固定。

1.4血生化檢測(cè) 大鼠稱(chēng)重后,以2%戊巴比妥鈉麻醉固定于操作臺(tái),剖開(kāi)腹腔,使用負(fù)壓采血針從腹主動(dòng)脈采血,離心,吸取上清液置于Ep管,保存于-20 ℃冰箱。用于后續(xù)生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色檢測(cè)大鼠腎臟組織形態(tài):看組織病理變化 腎臟組織在多聚甲醛中浸泡,經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片(厚度約4 μm)、脫蠟,HE染色、二甲苯充分浸泡2 h直至透明、干燥。常規(guī)封片,光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.6茜素紅染色及細(xì)胞鈣沉積量檢測(cè) 每組隨機(jī)選取5只大鼠,剝離胸主動(dòng)脈,包埋、切片、脫蠟、石蠟切片、水洗;加入1%茜素紅-Tris-HCl(pH8.3)液染色;水洗;常規(guī)脫水透明,封片。顯微鏡下觀察鈣化結(jié)節(jié)。

1.7免疫組化檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈上α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)和runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2蛋白表達(dá) 按照免疫組化試劑盒操作說(shuō)明書(shū),將主動(dòng)脈組織石蠟切片脫蠟水化,修復(fù)抗原,先后予以3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min、10%山羊血清封閉15 min,各加入大鼠抗α-SMA和兔抗Runx2單抗,經(jīng)4 ℃冰箱過(guò)夜后,加入生物素標(biāo)記二抗,清潔后二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,鏡檢。采用Image-Pro Plus6.0分析,各切片隨機(jī)選取視野,測(cè)定陽(yáng)性部位(棕黃色顆粒)的吸光度值。

1.8透射電鏡觀察VSMC內(nèi)自噬體的數(shù)量 分別收集各組樣本,將各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h,棄掉培養(yǎng)基,加入電鏡固定液,收集細(xì)胞,更換固定液,固定2 h。透射電鏡下觀察自噬體。

1.9免疫熒光檢測(cè)微管相關(guān)蛋白輕鏈(LC)3蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后,磷酸鹽緩沖液清洗3次,固定20 min。磷酸鹽緩沖液洗3次,破膜5 min。山羊血清封閉2 h,LC3抗體(1∶200倍稀釋)在4 ℃孵育過(guò)夜,后續(xù)操作均避光,二脒基苯基吲哚(DAPI)室溫染核5 min,DAPI藍(lán)色熒光曝光100 ms、拍照,200倍熒光顯微鏡下拍攝。

1.10Western印跡檢測(cè)大鼠腎臟組織激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/mTOR信號(hào)通路蛋白及自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 分別收集各組樣本,提取組織勻漿總蛋白,測(cè)定蛋白含量。制備蛋白樣品并進(jìn)行凝膠電泳,轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,封閉液封閉2 h。加入一抗4 ℃封閉過(guò)夜。次日加入二抗,室溫孵育1 h,加入顯色液顯影。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),作圖工具采用Graphpad5.01。

2 結(jié) 果

2.1雷帕霉素對(duì)大鼠24 h尿蛋白定量(Upro)的影響 與對(duì)照組相比,模型組中24 h Upro明顯升高(P<0.05);與模型組相比,CRF+I組中24 h Upro明顯降低(P<0.05);與CRF+I組相比,CRF+I+3-MA組中24 h Upro顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表1。

2.2雷帕霉素對(duì)大鼠尿液和血液相關(guān)生化指標(biāo)的影響 與對(duì)照組相比,模型組中尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)、血磷(P)顯著升高,血鈣(Ca)顯著下降(P<0.05);與模型組相比,CRF+I組中BUN和Scr、血P顯著降低,血Ca顯著升高(P<0.05);與CRF+I組相比,CRF+I+3-MA組中BUN和Scr、血P顯著升高,血Ca顯著下降(P<0.05),見(jiàn)表1。

2.3雷帕霉素對(duì)α-SMA、Runx2蛋白表達(dá)水平的影響 對(duì)照組主動(dòng)脈平滑肌層大量表達(dá)α-SMA,胞質(zhì)呈棕黃色;與對(duì)照組相比,模型組α-SMA表達(dá)顯著降低(P<0.05);與模型組相比,CRF+I組α-SMA表達(dá)明顯升高(P<0.05),CRF+I+3-MA組無(wú)明顯變化;且CRF+I+3-MA組α-SMA明顯低于CRF+I組(P<0.05)。此外,對(duì)照組主動(dòng)脈壁上Runx2微量表達(dá);與對(duì)照組相比,模型組Runx2表達(dá)明顯升高(P<0.05);與模型組相比,CRF+I組中Runx2表達(dá)顯著降低(P<0.05),CRF+I+3-MA組Runx2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01);且CRF+I+3-MA組主動(dòng)脈上Runx2表達(dá)明顯高于CRF+I組(P<0.05),見(jiàn)表1、圖1。

表1 雷帕霉素抑制劑對(duì)大鼠24 h Upro、BUN、Scr、血P、α-SMA、Runx2蛋白表達(dá)水平的影響

圖1 各組主動(dòng)脈上α-SMA和Runx2蛋白表達(dá)(免疫組化,×400)

2.4雷帕霉素對(duì)大鼠腎組織形態(tài)的影響 除對(duì)照組外,其他各組腎臟均可見(jiàn)明顯病變,主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)空亮、空泡變性、增生伴擴(kuò)張,有脫落和管腔內(nèi)蛋白小滴,皮質(zhì)淺層腎小管擴(kuò)張。與對(duì)照組相比,模型組上述病變發(fā)生率明顯升高;與模型組相比,CRF+I組上述病變發(fā)生率明顯降低;與CRF+I組相比,CRF+I+3-MA組上述病變發(fā)生率明顯升高,見(jiàn)圖2。

圖2 各組腎組織形態(tài)(HE染色,×400)

2.5茜素紅染色觀察主動(dòng)脈壁鈣化情況 茜素紅染色顯示,對(duì)照組主動(dòng)脈壁未見(jiàn)深紅色。模型組主動(dòng)脈壁中膜層出現(xiàn)呈線(xiàn)性連續(xù)的鈣化結(jié)節(jié),呈深紅色,彈性纖維斷裂。用雷帕霉素預(yù)處理后,CRF+I組鈣化結(jié)節(jié)減少。加入3-MA抑制自噬后,CRF+I+3-MA組鈣化結(jié)節(jié)又顯著增加,見(jiàn)圖3。

圖3 各組主動(dòng)脈壁鈣化情況(茜素紅染色,×100)

2.6雷帕霉素通過(guò)抑制AMPK/mTOR信號(hào)通路激活自噬減輕VSMC鈣化 透射電鏡觀察各組中VSMC內(nèi)自噬體數(shù)量,對(duì)照組中有少量自噬體;與對(duì)照組相比,模型組有大量自噬體形成;與模型組相比,CRF+I組VSMC內(nèi)自噬體數(shù)量明顯增加;與CRF+I組相比,CRF+I+3-MA組VSMC內(nèi)自噬體數(shù)量明顯減少。說(shuō)明雷帕霉素可以激活VSMC的自噬活動(dòng)。見(jiàn)圖4。與對(duì)照組相比,模型組LC3Ⅱ/Ⅰ及自噬相關(guān)蛋白(Beclin)1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01);但給予雷帕霉素預(yù)處理后,LC3Ⅱ/Ⅰ及Beclin1蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01);給予3-MA預(yù)處理后,LC3Ⅱ/Ⅰ及Beclin1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖5。免疫熒光染色也顯示,與對(duì)照組相比,模型組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)LC3點(diǎn)狀聚集增多;與模型組相比,CRF+I組LC3點(diǎn)狀聚集明顯增加;與CRF+I組相比,CRF+I+3-MA組LC3點(diǎn)狀聚集也明顯減少。見(jiàn)圖6。

紅色箭頭表示自噬體圖4 透射電鏡觀察各組VSMC內(nèi)自噬體數(shù)量(×20 000)

表2 雷帕霉素對(duì)LC3、Beclin1表達(dá)的影響

圖5 各組LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表達(dá)

2.7Western印跡檢測(cè)p-mTOR蛋白表達(dá) 4組p-mTOR蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.602,P=0.028)。與對(duì)照組(1.08±0.21)相比,模型組p-mTOR表達(dá)顯著升高(1.61±0.35,P<0.01);與模型組相比,CRF+I組p-mTOR表達(dá)顯著降低(0.50±0.11,P<0.01);與CRF+I組相比,CRF+I+3-MA組p-mTOR蛋白表達(dá)顯著升高(0.92±0.18,P<0.05),見(jiàn)圖7。

圖6 免疫熒光檢測(cè)LC3蛋白表達(dá)(×200)

圖7 各組p-mTOR蛋白表達(dá)水平

3 討 論

許多研究發(fā)現(xiàn)〔8,9〕,mTOR信號(hào)通路在成骨分化中起著重要的調(diào)控作用。雷帕霉素抑制劑對(duì)CRF具有一定的防治作用〔10〕,但其作用機(jī)制研究還很少。本研究證明,雷帕霉素抑制劑對(duì)CRF大鼠有較好的治療效果。VSMC的病理變化是構(gòu)成CRF血管鈣化的主要原因。有研究證實(shí)〔11〕,自噬在血管及VSMC的病理生理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。驗(yàn)證自噬的主要方法有Western印跡結(jié)果檢測(cè)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達(dá)、熒光顯微鏡下觀察LC3點(diǎn)狀聚集及電鏡下觀察自噬體的形成〔12,13〕。有研究證實(shí),阿托伐他汀通過(guò)下調(diào)β-連環(huán)蛋白(catenin)來(lái)誘導(dǎo)VSMC自噬,進(jìn)而抑制VSMC鈣化〔14〕。研究顯示,自噬可通過(guò)減少VSMC基質(zhì)囊泡的釋放而減緩VSMC鈣化〔15,16〕。沈鳳等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)可通過(guò)誘導(dǎo)VSMC自噬而降低鈣調(diào)蛋白和α-SMA蛋白表達(dá),上調(diào)波形蛋白和骨橋蛋白的表達(dá),從而增強(qiáng)細(xì)胞鈣化。本研究使用雷帕霉素治療CRF大鼠發(fā)現(xiàn),雷帕霉素會(huì)促進(jìn)腎臟VSMC自噬,從而抑制VSMC鈣化,進(jìn)而發(fā)揮對(duì)CRF的治療作用。

mTOR處于許多細(xì)胞信號(hào)通路的關(guān)鍵位置,在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及調(diào)控自噬過(guò)程中起著重要作用〔18〕。有研究發(fā)現(xiàn),敲除小鼠軟骨中的mTOR 相關(guān)基因,自噬信號(hào)明顯增加,降低細(xì)胞凋亡〔19〕。有研究報(bào)道〔20〕,雷帕霉素通過(guò)上調(diào)自噬相關(guān)因子的表達(dá),從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞生存。楊羽菲等〔21〕在探討治療性低溫(TH)在缺氧期對(duì)心肌細(xì)胞自噬活性及自噬流的影響機(jī)制研究中,使用雷帕霉素作用于TH作用的缺氧期H9c2細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬活性激活,且逆轉(zhuǎn)了TH對(duì)p-mTOR和p-S6的促表達(dá)作用。雷帕霉素對(duì)自噬的調(diào)控機(jī)制在其他器官研究較多,但是雷帕霉素抑制劑對(duì)腎臟VSMC鈣化的影響機(jī)制還鮮有研究。雷帕霉素可通過(guò)激活自噬改善足細(xì)胞損傷,這可能與雷帕霉素抑制mTOR/4EBP1/P70S6K信號(hào)通路有關(guān)〔22〕。劉磊〔23〕研究腎臟足細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能改變?cè)谔悄虿∧I病(DN)發(fā)病過(guò)程中的作用機(jī)制,證實(shí)雷帕霉素可通過(guò)mTOR-S6K1-LC3Ⅱ通路調(diào)控DN大鼠腎臟足細(xì)胞自噬。本研究提示,雷帕霉素抑制劑可通過(guò)抑制p-mTOR的生物學(xué)活性,減弱其對(duì)下游蛋白的作用,進(jìn)而激活VSMC的自噬機(jī)制,減輕VSMC的鈣化。

綜上,雷帕霉素抑制劑對(duì)大鼠CRF起到一定療效,其機(jī)制可能與雷帕霉素抑制劑對(duì)AMPK/mTOR信號(hào)通路的調(diào)控,從而促進(jìn)自噬,減弱VSMC鈣化有關(guān)。