鄧永文 張全輝 陳教華 張磊昌

(江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江西 南昌 330006)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)病變以結(jié)直腸多見(jiàn),且病程較長(zhǎng),易反復(fù)發(fā)作,具有一定的癌變風(fēng)險(xiǎn),給患者生活質(zhì)量帶來(lái)嚴(yán)重影響〔1,2〕。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,UC屬“下痢”“泄瀉”“赤白痢”等范疇,脾氣虛弱、運(yùn)化失調(diào)是本病主要病機(jī),因此UC治療通常采用健脾益氣、滲濕止瀉為主〔3,4〕。近年來(lái),參苓白術(shù)散開(kāi)始用于治療UC患者,臨床療效理想〔5,6〕。研究表明,采用參苓白術(shù)散治療UC小鼠可明顯改善其結(jié)腸黏膜損傷程度并降低疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)及血清炎性因子含量,下調(diào)結(jié)腸組織中髓過(guò)氧化酶活性和丙二醛含量〔7〕。研究證實(shí),通過(guò)參苓白術(shù)散治療脾虛濕熱性UC患者,可顯著緩解其腹痛腹瀉、黏液膿血便、食少腹脹等癥狀,臨床效果確切〔8〕。然而關(guān)于參苓白術(shù)散作用機(jī)制不甚明確,故本研究旨在探究參苓白術(shù)散加減方對(duì)UC結(jié)腸黏膜損傷的修復(fù)作用及對(duì)UC發(fā)病過(guò)程中炎癥反應(yīng)的影響,并進(jìn)一步闡釋該方對(duì)UC的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只Balb/c小鼠(雌雄各半)購(gòu)于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司,生產(chǎn)批號(hào):SCXK(蘇)2018-0001,體質(zhì)量20～22 g。將30只Balb/c 小鼠置于SPF級(jí)動(dòng)物房中進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng),分籠飼養(yǎng),每籠5只,室溫控制于20～25 ℃,濕度為55%～60%,均自由攝食及飲水。

1.2主要試劑 試劑:聚偏氟乙烯(PVDF)膜(武漢愛(ài)博泰克公司);TriZol(深圳市益百順公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測(cè)試劑盒(廣州一科公司);白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體(廣州永諾公司);β-actin抗體(廣州蘇瑪生物公司);凝膠制備試劑盒(北京綠源大德公司);電化學(xué)發(fā)光(ECL)液(北京蘭博利德公司);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(北京強(qiáng)欣博瑞公司);放射免疫沉淀裂解液(RIPA,深圳市文樂(lè)公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海捷瑞生物工程公司)。

1.3藥物制備 參苓白術(shù)散加減方由山藥、薏苡仁、炒谷芽、炒麥芽 20 g,黨參、茯苓、白及、六月霜、炒枳殼 15 g,炒白術(shù)、陳皮、桔梗、炒扁豆 10 g,砂仁(后下)、炙甘草、黃連6 g構(gòu)成。在16味藥物中加入8倍量水浸泡,30 min后進(jìn)行煎煮,共3次,然后將3次煎液合并濾過(guò)并減壓,使其濃縮至1 000 ml。試驗(yàn)藥物劑量設(shè)置依據(jù):2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》。

1.4分組、建模及藥物治療 隨機(jī)抽取6只Balb/c小鼠作為空白對(duì)照組,余24只小鼠通過(guò)飲用3%葡聚糖硫酸鈉(DSS)建立UC小鼠模型,連續(xù)飲用8 d。建模后隨機(jī)抽取6只UC小鼠作為模型對(duì)照組,余18只UC小鼠模型分為參苓白術(shù)散加減方低、中、高劑量組,每組6只,其中參苓白術(shù)散加減方低、中、高劑量組分別予以7.8、15.6、31.2 g/kg參苓白術(shù)散加減方(200 μl)灌胃,連續(xù)灌胃12 d,另外兩組均通過(guò)等體積蒸餾水灌胃處理。

1.5DAI計(jì)算 觀察各組體質(zhì)量、腹瀉和便血等體征并計(jì)算其DAI,計(jì)算方法為,0分:大鼠體質(zhì)量未下降,大便性狀正常,便血為隱血(-);1分:體質(zhì)量下降1%～5%,大便性狀介于正常與松散之間,便血介于隱血(-)與隱血(+)之間;2分:體質(zhì)量下降6%～10%,大便性狀松散,便血為隱血(+);3分:體質(zhì)量下降11%～20%,大便性狀介于松散與稀便之間,便血介于隱血(+)與肉眼血便之間;4分:體質(zhì)量下降>21%,大便性狀為稀便,便血為肉眼血便。

1.6小鼠結(jié)腸病理組織學(xué)分析 分析各組小鼠結(jié)腸黏膜大體形態(tài)。將各組小鼠麻醉并斷頸處死,取其盲腸至肛門(mén)段結(jié)腸,經(jīng)測(cè)量后取每段結(jié)腸末端部分通過(guò)10%甲醛溶液固定,觀察各組小鼠粘連程度、炎癥及潰瘍形成情況。

1.7小鼠血清炎性因子水平分析 于小鼠眼球取血,經(jīng)臺(tái)式高速低溫離心機(jī)以1 500 r/min的速度離心后取上層血清,然后通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)相關(guān)因子水平,稀釋提前制備好的樣品及對(duì)照品,并加入檢測(cè)抗體,在37 ℃環(huán)境下孵育1 h,然后通過(guò)ELISA洗板液洗板5次,將底物A、B置于其中,隨后放在37 ℃環(huán)境下避光反應(yīng)15 min后終止。通過(guò)酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定相關(guān)吸光度。

1.8免疫組化法檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞核增殖抗原(Ki-67)表達(dá) 分離小鼠結(jié)腸組織并將其固定在4%多聚甲醛,石蠟包埋切片后烘烤切片,放入二甲苯脫蠟至水,經(jīng)梯度酒精(75%、85%、95%、100%)脫水后通過(guò)檸檬酸鈉熱修復(fù)抗原,完成上述操作后將切片置于3%H2O2,然后通過(guò)正常山羊血清封閉液封閉,經(jīng)一抗、二抗孵育后通過(guò)鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(POD)孵育組織,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染封片,最后分析Ki-67表達(dá)情況。

1.9實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中炎性因子表達(dá)分析 通過(guò)TriZol裂解法提取結(jié)腸組織中總RNA并檢測(cè)其濃度,隨后于20 μl體系中實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物于70 ℃變性10 min并保存于-20 ℃。PCR:2 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,5 μl Taqmix,0.5 μl上游引物(10 μmol/L),0.5 μl下游引物(10 μmol/L),2.0 μl滅菌雙蒸水。條件:首先94 ℃預(yù)變性2 min;然后94 ℃變性30 s,55～62 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,共30個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。引物序列由廣州沛瑜公司合成,引物序列:IL-6:上游5′-AGCCCACCAAGAACGATAG-3′、下游5′-GGTTGTCACCAGCATCAGT-3′,IL-1β:上游5′-TGCCACCTTTTGACAGTGATG-3′、下游5′-TGTGCTGCGAGATTTGA-3′,TNF-α:上游5′-GAT-CGGTCCCCAAAGGGATG-3′、下游5′-TTGCTACGAC-GTGGGCTACA-3′,β-actin:上游5′-GCACCATGAAG-ATCAAGATCATT-3′、下游5′-TAACAGTCCGCCTAG-AAGCATT-3′。以β-actin作內(nèi)參。電泳后觀察、拍照并分析。

1.10Western印跡檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中炎性因子表達(dá) 取小鼠結(jié)腸組織通過(guò)RIPA裂解,隨后對(duì)提取的總蛋白濃度進(jìn)行檢測(cè),濃度檢測(cè)完成后將其置于室溫下自然融化。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)依次將樣品置于上樣孔,然后連接電源實(shí)施電泳,并轉(zhuǎn)至PVDF膜,置于5%脫脂牛奶中行封閉處理。加一抗、二抗孵育后洗膜,并通過(guò)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行膠片曝光,顯影、定影后分析目標(biāo)蛋白IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)量。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析,兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組DAI評(píng)分比較 模型對(duì)照組DAI較空白對(duì)照組明顯升高(P<0.05);與模型對(duì)照組比較,參苓白術(shù)散加減方高劑量組DAI明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2各組結(jié)腸病理組織學(xué)分析 模型對(duì)照組形態(tài)損傷評(píng)分較空白對(duì)照組明顯升高(P<0.05);參苓白術(shù)散加減方中、高劑量組形態(tài)損傷評(píng)分均較模型對(duì)照組明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3各組血清炎性因子水平比較 模型對(duì)照組血清中 IL-6、IL-1β、TNF-α水平均較空白對(duì)照組明顯升高(P<0.05);參苓白術(shù)散加減方高劑量組血清中 IL-6、IL-1β、TNF-α水平均較模型對(duì)照組明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組DAI評(píng)分、形態(tài)損傷評(píng)分、血清炎性因子水平比較

2.4各組結(jié)腸組織形態(tài)變化分析 空白對(duì)照組結(jié)腸組織腺體結(jié)構(gòu)完整,未出現(xiàn)損傷;模型對(duì)照組結(jié)腸組織發(fā)生明顯受損,腺體破碎,且黏膜層損傷嚴(yán)重,出現(xiàn)充血及水腫,炎性細(xì)胞浸潤(rùn);參苓白術(shù)散加減方低、中劑量組結(jié)腸組織中可見(jiàn)肉芽組織增生,腺體結(jié)構(gòu)受損,炎性細(xì)胞浸潤(rùn);參苓白術(shù)散加減方高劑量組出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),偶見(jiàn)組織水腫及充血。圖1。

圖1 各組結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)(免疫組化,×100)

2.5各組結(jié)腸組織中Ki-67表達(dá)比較 模型對(duì)照組結(jié)腸組織中Ki-67表達(dá)較空白對(duì)照組明顯升高(P<0.05);參苓白術(shù)散加減方高劑量組結(jié)腸組織中Ki-67表達(dá)較模型對(duì)照組明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.6各組結(jié)腸組織炎性因子表達(dá)比較 模型對(duì)照組結(jié)腸組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA及蛋白表達(dá)量均較空白對(duì)照組明顯升高(P<0.05);參苓白術(shù)散加減方高劑量組結(jié)腸組織中IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA及蛋白表達(dá)量均較模型對(duì)照組明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組Ki-67表達(dá)、結(jié)腸組織炎性因子mRNA及蛋白表達(dá)比較

1～5:空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、參苓白術(shù)散加減方低、中、高劑量組圖2 各組結(jié)腸組織炎性因子蛋白表達(dá)

3 討 論

UC在任何年齡段均可發(fā)病,尤以20～40歲患者為最多,且該病病程較長(zhǎng),易反復(fù)發(fā)作,存在癌變的可能〔9〕。一項(xiàng)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示,我國(guó)UC患病率約為11.6/105,然而由于人們飲食結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣變化及醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步,本病患病率呈逐年增加趨勢(shì),給患者及家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)〔10,11〕。目前研究認(rèn)為UC發(fā)病可能與感染、免疫及精神等因素密切相關(guān),然而關(guān)于本病發(fā)生的病因及機(jī)制尚未完全闡明〔12〕。近年來(lái),中醫(yī)藥在治療UC方面取得較大的進(jìn)展,其已被證實(shí)可有效改善UC患者臨床癥狀,延緩病情進(jìn)展,提高患者生存質(zhì)量。參苓白術(shù)散可發(fā)揮益氣健脾、滲濕止瀉之功效,其已被證實(shí)可有效提高胃腸動(dòng)力并促進(jìn)胃腸黏膜屏障修復(fù)〔13〕。閆文慧等〔14〕報(bào)道顯示參苓白術(shù)散加減方中的活性成分可明顯抑制UC患者腸黏膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),有利于緩解黏膜損傷程度。朱磊等〔15〕研究通過(guò)建立UC大鼠模型并予以其參苓白術(shù)散加減方干預(yù),發(fā)現(xiàn)UC大鼠模型血清中IL-5、IL-6等炎性因子含量降低,IL-4等抑炎因子含量升高,在改善UC大鼠癥狀方面具有一定效果。提示,參苓白術(shù)散加減方可在一定程度上改善UC小鼠病情嚴(yán)重程度及結(jié)腸組織損傷情況。這與畢殿勇等〔16〕研究結(jié)果基本一致。

Ki-67在分辨生長(zhǎng)中的正常細(xì)胞及癌細(xì)胞中具有重要價(jià)值,張慧等〔17〕發(fā)現(xiàn),在正常組織內(nèi)Ki-67并未出現(xiàn)表達(dá),然而其在腫瘤組織及增殖的細(xì)胞核中表達(dá)出現(xiàn)異常,尤其是前者,除此之外該研究亦發(fā)現(xiàn),其在UC組織及結(jié)腸癌組織中含量無(wú)明顯差異。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),UC小鼠模型結(jié)腸組織中Ki-67表達(dá)明顯增加,而經(jīng)參苓白術(shù)散加減方干預(yù)后UC小鼠結(jié)腸組織中Ki-67表達(dá)明顯降低。畢殿勇等〔16〕報(bào)道顯示,細(xì)胞因子失衡在UC發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,UC患者出現(xiàn)腸黏膜損傷,主要是由于患者體內(nèi)促炎因子含量超過(guò)抑炎因子含量,進(jìn)而引發(fā)機(jī)體組織損傷。、IL-1β、IL-6、TNF-α作為促炎因子,在UC發(fā)生過(guò)程中大量釋放,可引發(fā)腸過(guò)度炎癥反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)腸組織水腫、出血、壞死等〔16〕。袁星華〔18〕報(bào)道顯示,UC患者血清中IL-6、TNF-α含量均較健康人群顯著升高,且其含量與UC進(jìn)展呈正相關(guān)。唐舒婷等〔19〕報(bào)道顯示,UC患者血清、腸道黏膜及腸道平滑肌中IL-1β含量均明顯上調(diào),其可導(dǎo)致患者平滑肌功能發(fā)生變化,進(jìn)而引發(fā)結(jié)腸平滑肌細(xì)胞對(duì)神經(jīng)激肽A的收縮作用顯著減弱,此時(shí)細(xì)胞中鈣離子儲(chǔ)存亦隨之減少。本研究提示,參苓白術(shù)散加減方可調(diào)節(jié)UC小鼠體內(nèi)促炎性因子含量,有利于減少UC小鼠血清及結(jié)腸組織中IL-6、IL-1β、TNF-α水平,并改善UC小鼠腸黏膜損傷。這與李姿慧等〔7〕、趙文曉等〔20〕報(bào)道結(jié)果相同。以上研究結(jié)果說(shuō)明,參苓白術(shù)散加減方可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)而改善UC小鼠病情,有利于促進(jìn)結(jié)腸黏膜修復(fù)。

參苓白術(shù)散加減方可有效降低UC小鼠DAI評(píng)分并改善其結(jié)腸組織損傷程度,其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的,可為參苓白術(shù)散加減方臨床治療UC提供實(shí)驗(yàn)支持。