吳偉 尚玉強(qiáng) 程龍 王杰 楊傳蕾

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院心臟大血管外科,湖北 武漢 430000)

血管鈣化雖然被認(rèn)為是正常衰老過程的一部分,但某些病理過程,如糖尿病、高血壓、慢性腎病(CKD)和罕見的遺傳性疾病,也可能促成這種情況〔1〕,嚴(yán)重威脅著人類的健康。已有研究發(fā)現(xiàn),骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、骨橋蛋白(OPN)、骨保護(hù)素(OPG)及細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(RANKL) 等骨相關(guān)蛋白,在血管鈣化的過程中有重要作用,其中OPG和RANKL的作用最為重要〔2,3〕。RANKL通過調(diào)控巨噬細(xì)胞生成促鈣化細(xì)胞因子,以調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)鈣化,而OPG則相當(dāng)于整個RANKL系統(tǒng)的制動器,其與核因子κB受體激活劑(RANK)競爭性結(jié)合,抑制了RANKL/RANK系統(tǒng)的作用,從而抑制VSMCs鈣化〔3〕。miRNAs可指導(dǎo)VSMCs的基因重新編碼,并且在其他細(xì)胞中也有與血管鈣化相關(guān)的有效應(yīng)答〔4〕,miRNAs被認(rèn)為是調(diào)節(jié)血管鈣化的關(guān)鍵因素,其中miR-26a能夠促進(jìn)VSMCs增殖,同時抑制細(xì)胞分化和凋亡,并改變TGF-β途徑的信號傳導(dǎo)。并且其代表著異常平滑肌細(xì)胞(SMC)生物學(xué)的重要新調(diào)節(jié)劑和某些疾病的潛在治療靶標(biāo)〔5〕。而miR-26a在血管鈣化中的具體作用機(jī)制尚不清楚。因此,本研究通過文獻(xiàn)資料及生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫等篩選出miR-26a探討其在血管鈣化中的表達(dá)差異及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 DMEM購自Gibco(C11995500BT),胎牛血清購自TBD(TBD11HT),PBS和0.25%胰蛋白酶購自雷根(R00088,CC0130),β-甘油磷酸鹽(BGP)、CaCl2均購自Sigma(G9422、C1016),甲醛購自麥克林(F864792),茜素紅法鈣質(zhì)染色試劑盒購自上海歌凡(M040),堿性磷酸酶(ALP)購自南京建成(A059-1-1)。

1.2主要儀器 超凈工作臺購自博科(型號BBS-DDC),生物安全柜購自安泰(型號BSC-1800IIB2),CO2恒溫培養(yǎng)箱購自LabServTM(型號LBS#111112100),移液器購自(型號LH-745021),倒置熒光顯微鏡購自析域(型號BM-38XD),酶標(biāo)儀購自杭州奧盛儀器有限公司(型號AMR-100),微量高速離心機(jī)購自長沙平凡(TG16W),微量移液槍購自美國Rainin PiPet-Lite,水浴鍋購自Leica(HI1210),UPT 優(yōu)普特實驗室超純水器購自法國MilliPORE(ULUPURE,優(yōu)普)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 將大鼠胸大動脈平滑肌細(xì)胞A7r5從液氮中取出后立即置于37 ℃水浴鍋中,不斷搖晃,使其在1 min之內(nèi)溶解,然后迅速置于超凈臺中,將溶解后的細(xì)胞懸液加入含有5 ml 10%胎牛血清(FBS)DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,輕輕吹打均勻后,放入37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞貼壁情況并換液,取生長狀態(tài)良好,形態(tài)正常的VSMCs細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.4主動脈SMC鈣化模型構(gòu)建 收集細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,分于12孔板,1×105個細(xì)胞/孔,每孔1 ml,置 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,使細(xì)胞貼壁。鈣化培養(yǎng)基(CM;DMEM中補(bǔ)充10 mmol/L BGP和3 mmol/L CaCl2)誘導(dǎo)A7r5鈣化,誘導(dǎo)0、12、24、48、72 h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板備用。

1.5模型鑒定 取各組細(xì)胞用PBS洗3遍后,用4%多聚甲醛固定30 min。吸去4%多聚甲醛溶液。加入2 ml茜素紅染色液,室溫染色30 min蒸餾水速洗。在倒置顯微鏡下觀察染色效果,拍照。

1.6實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) Trizol提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性5 s,56 ℃退火10 s,72 ℃延伸25 s,共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算miR-26a相對表達(dá)水平,引物序列(5′-3′)為:miR-26a正向:GGGGTTCAAGTAATCCAGGA,反向:CTGGTGTCGTGGAGTCGG,骨保護(hù)素(OPG)正向:CGAGTGATGAATGCGTGTA,反向:CAGGAGGCCAAGTGAGC,骨橋蛋白(OPN)正向:ACAGTATCCCGATGCCACA,正向:GCTGGTCTTCCCGTTGC,骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2正向:TCTGTCCCTACTGATGAGTTTCT,反向:GGCTGTGGCAGGCTTTAT,膠原蛋白(Collagen)Ⅱ正向:GCCTAGCAACATGCCAATC,反向:GCAGCAAAGTTCCCAGTAAGA,GAPDH正向:CAAGTTCAACGGCACAG,反向:CCAGTAGACTCCACGACAT,U6正向:CTCGCTTCGGCAGCACATATACT,反向:ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC。

1.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實驗分為對照(control)組、miR-26a-5p mimics組、miR-26a-5p mimics NC組、miR-26a-5p inhibitor組、miR-26a-5p inhibitor NC組。進(jìn)行貼壁和懸浮細(xì)胞,對于每個轉(zhuǎn)染樣品,按下面的方法準(zhǔn)備:①取100 pmol miRNA稀釋于250 μl Opti-MEM中,輕輕吹吸5次混勻。②取5 μl Lipofectamine?RNAiMAX稀釋于250 μl Opti-MEM中,輕輕吹吸5次混勻,室溫下靜置 5 min。③將①中液體緩慢加入②液體中,輕輕吹吸5次混勻,室溫孵育20 min。④將500 μl復(fù)合物加到含有細(xì)胞和換有1.5 ml新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)板孔中,來回輕柔搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板。⑤將細(xì)胞板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,轉(zhuǎn)染 4 h后換新鮮培養(yǎng)基,培養(yǎng) 24 h。⑥檢測轉(zhuǎn)入基因表達(dá)情況。

1.8細(xì)胞鈣化沉積檢測 將實驗進(jìn)行分組,除正常對照組不進(jìn)行任何處理,其余組構(gòu)建血管鈣化模型(VSMC細(xì)胞誘導(dǎo)鈣化),分為模型組、miR-26a mimic組(miR-26a mimic轉(zhuǎn)染)、mimic NC組(mimic NC轉(zhuǎn)染)、miR-26a inhibitor組(miR-26a inhibitor轉(zhuǎn)染)、inhibitor NC組(inhibitor NC轉(zhuǎn)染)。模型誘導(dǎo):鈣化培養(yǎng)基被用來誘導(dǎo)VSMC鈣化,誘導(dǎo)48 h。取各組細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3遍后,用4%多聚甲醛固定30 min,吸去4%多聚甲醛溶液;加入2 ml茜素紅染色液,室溫染色30 min,蒸餾水速洗,在倒置顯微鏡下觀察染色效果,拍照。

1.9細(xì)胞ALP檢測 采用南京建成試劑盒檢測細(xì)胞ALP活性,操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD檢驗。

2 結(jié) 果

2.1VSMC鈣化模型的構(gòu)建及miR-26a表達(dá)量 與0 h比較,隨著誘導(dǎo)時間延長,細(xì)胞鈣化加劇,在48 h和72 h細(xì)胞鈣化明顯。見圖1。與0 h(0.96±0.04)比較,鈣化12、24、48、72 h VSMC細(xì)胞miR-26a表達(dá)水平(0.61±0.28、0.19±0.00、0.07±0.01、0.07±0.00)顯著下降(均P<0.05),且在48 h時miR-26a表達(dá)水平達(dá)到最低。因此,細(xì)胞鈣化最佳誘導(dǎo)時間為48 h。

2.2miR-26a-5p模擬劑、抑制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率鑒定 與miR-26a-5p mimics NC組(0.92±0.13)相比,轉(zhuǎn)染miR-26a-5p mimics后miR-26a-5p的表達(dá)量(9.24±0.26)顯著升高(P<0.05)。與miR-26a-5p inhibitor NC組(1.02±0.07)相比,轉(zhuǎn)染miR-26a-5p inhibitor 后miR-26a-5p表達(dá)量(0.19±0.01)顯著降低(P<0.05),而miR-26a-5p inhibitor NC組和miR-26a-5p mimics組miR-26a-5p水平無明顯變化(P>0.05)。說明miR-26a-5p mimics和miR-26a-5p inhibitor可以用于后續(xù)實驗。

2.3miR-26a對細(xì)胞鈣化的影響 與mimic NC組比較,miR-26a mimic組鈣化程度明顯改善;與模型組和inhibitor NC組比較,miR-26a inhibitor組的鈣化程度明顯嚴(yán)重;而mimic NC組和inhibitor NC與模型組相比無明顯變化。見圖2。

2.4miR-26a對鈣化細(xì)胞ALP活性的影響 與mimic NC組相比較,miR-26a mimic組ALP活性顯著降低(P<0.05)。而inhibitor NC組和miR-26a inhibitor組ALP活性無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.5miR-26a對OPG、OPN、BMP-2和CollagenⅡ基因表達(dá)影響 與正常對照組比較,模型組OPG、miR-26a表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),OPN、BMP-2和CollagenⅡ表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與mimic NC組比較,miR-26a mimic組miR-26a、OPG表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),OPN、BMP-2和CollagenⅡ表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與inhibitor NC組比較,miR-26a inhibitor組的miR-26a、OPG、OPN、BMP-2和CollagenⅡ表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。見表1。

圖1 VSMC鈣化模型鑒定(茜素紅染色,×200)

圖2 各組細(xì)胞鈣化沉積(茜素紅染色,×200)

表1 miR-26a對鈣化細(xì)胞ALP活性和OPG、OPN、BMP-2和CollagenⅡ蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

血管鈣化被定義為礦物質(zhì)沉積在血管系統(tǒng)中,以鈣-磷酸復(fù)合物形式存在,是主動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病血管病變等普遍存在的病理表現(xiàn),易致心室肥大、心力衰竭、主動脈夾層形成,是心腦血管病高死亡率的重要因素〔6〕。其鈣化的過程被認(rèn)為源自凋亡SMC或這些細(xì)胞在內(nèi)部彈性層附近釋放的基質(zhì)囊泡(外泌體),這發(fā)生在鈣化調(diào)節(jié)蛋白〔如骨鈣素(OC)和BMP2〕的內(nèi)膜含量發(fā)生變化之前,但與未羧化基質(zhì)gla蛋白(MGP)的表達(dá)增強(qiáng)〔7〕。

微小RNA(miRNAs)是一類由20～22個核苷酸組成的小片段非編碼RNA,通過靶向結(jié)合基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)調(diào)控其表達(dá)〔8〕。通常來說,一種miRNA可以靶向結(jié)合調(diào)控多個mRNAs,一個mRNA也可能由多種miRNAs調(diào)控的。miRNAs是由含有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的miRNAs的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在細(xì)胞核內(nèi)由Drosha加工成60～90 nt miRNAs前體,然后pre-miRNAs通過核輸出蛋白5途徑轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì),在細(xì)胞質(zhì)中由核糖核酸酶Ⅲ剪切為成熟miRNAs,目前已發(fā)現(xiàn)的miRNA有28,600多種,其中人源性miRNA有4 500多種,研究顯示,很多miRNA在機(jī)體生命活動過程中發(fā)揮重要作用〔9〕。有研究證明,microRNAs在骨代謝中發(fā)揮重要作用,包括血管鈣化〔10,11〕。而miR-26a能夠促進(jìn)VSMC增殖,同時抑制細(xì)胞分化和凋亡,并改變轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β途徑的信號傳導(dǎo)。ALP是骨形成和 VC 的表型標(biāo)志物〔12,13〕。在軟骨內(nèi)骨化過程中,ALP 活性對于羥基磷灰石的形成很重要,并且在異位鈣化中觀察到在脈管系統(tǒng)中的類似作用。本研究發(fā)現(xiàn),在過表達(dá)miRNA-26a后顯著降低了ALP的活性。

而OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是骨代謝中的一個重要的信號通路,OPG是腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族的成員,是一種成骨細(xì)胞分泌的誘餌受體,是骨吸收的負(fù)調(diào)節(jié)因子。RANKL通過調(diào)控巨噬細(xì)胞生成促鈣化細(xì)胞因子以調(diào)節(jié)VSMC鈣化,而OPG則相當(dāng)于整個RANKL系統(tǒng)的制動器,其與RANK競爭性結(jié)合,抑制了RANKL/RANK系統(tǒng)的作用,從而抑制VSMC鈣化〔14〕。Bennett等〔15〕研究發(fā)現(xiàn),在小鼠敲除OPG基因后動脈粥樣硬化、VC和骨質(zhì)疏松加劇嚴(yán)重,同時RANKL表達(dá)水平升高。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致,進(jìn)一步解釋了在細(xì)胞鈣化時,miR-26a通過靶向結(jié)合某個基因調(diào)控了OPG/RANKL/RANK的信號通路。

綜上,在細(xì)胞鈣化模型中,過表達(dá)miR-26a后,可使OPG的表達(dá)量上調(diào),使OPN、BMP-2、CollagenⅡ表達(dá)水平下調(diào),其作用機(jī)制可能與miR-26a結(jié)合某個基因后,調(diào)控了OPG/RANKL/RANK信號通路有關(guān)。