王鈞 王軼楠 肖建波 李海麗

(唐山市人民醫(yī)院,河北 唐山 063001)

惡性淋巴瘤是一大類淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤的總稱,是臨床常見的一類異質(zhì)性極高的惡性腫瘤,據(jù)調(diào)查顯示其發(fā)病與死亡率均呈整體上升趨勢,這對患者的身體健康及生命安全造成了極大威脅〔1〕。目前,針對淋巴瘤的治療方法主要包括化療、放療、免疫治療等,然而臨床治療中常常出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象及有限的治療效果,尋找新的治療靶點至關(guān)重要〔2〕。惡性淋巴瘤病因復(fù)雜,目前尚未完全闡明,但研究表明其可能與免疫缺陷、病毒感染及遺傳因素有關(guān),其中免疫缺陷是目前臨床研究的熱點之一〔3〕。而Th細(xì)胞是一類關(guān)鍵的免疫細(xì)胞,有研究表明,不同亞群的數(shù)量及功能異常可導(dǎo)致機體細(xì)胞免疫功能紊亂,其中輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)1/Th2細(xì)胞失衡是多種免疫疾病的發(fā)病基礎(chǔ),惡性淋巴瘤同樣如此〔4〕。研究表明,程序性細(xì)胞死亡(PD)1與其配體PD-L1結(jié)合后可負(fù)向調(diào)控細(xì)胞的免疫應(yīng)答,從而介導(dǎo)胞凋亡及腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸,因此阻斷PD1/PD-L1信號將成為治療惡性淋巴瘤的新靶點〔5〕。目前隨著對分子信號通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的不斷了解,針對特異性靶點而設(shè)計的分子靶向治療藥物在治療惡性腫瘤方面已經(jīng)取得了革命性的進展〔6〕。Zeste基因增強子同源物(EZH)2是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶,廣泛存在于多種腫瘤細(xì)胞中,研究表明,EZH2存在高度表達與淋巴瘤進展、預(yù)后不良及耐藥性發(fā)生之間的相關(guān)性,因此抑制EZH2活性成為治療淋巴瘤的潛在策略〔7〕。本文探討EZH2抑制劑對惡性淋巴瘤細(xì)胞放療抵抗、Th細(xì)胞分化及PD1/PD-L1表達的作用機制。

1 材料與方法

1.1儀器 電子顯微鏡(型號:DMI6000)、熒光倒置顯微鏡(型號:IX83)均購于上海輔澤有限公司;高能直線加速器(型號:Turebeam,美國Varian公司);低溫冷凍離心機(型號:Medifriger-BL-S,北京金恒祥有限公司);Transwell小室(型號:3422,上海朗喜有限公司);多功能酶標(biāo)儀(型號:Spark,北京賽百奧有限公司)。

1.2細(xì)胞、藥物與試劑 MLMA惡性淋巴瘤細(xì)胞(貨號:YS2749C,上海雅吉有限公司);多柔比星(貨號:IR-12005,上海甄準(zhǔn)有限公司);PD1/PD-L1抑制劑(貨號:EY-22328,上海一研有限公司);EZH2抑制劑GSK343 (貨號:B71421,上海睿鉑賽有限公司);胎牛血清(貨號:RY-F22,蘭州榮曄有限責(zé)任公司);DMEM培養(yǎng)基(貨號:A31600-500 ml,上海吉至有限公司);Hoechst33258染色液(貨號:FS-79086,上海撫生有限公司);噻唑藍(lán)(MTT)試劑(貨號:M8180-1,北京索萊寶科技有限公司);二甲基亞砜(DMSO,貨號:20688,上海嶸崴達實業(yè)有限公司);結(jié)晶紫〔貨號:B5917-04,艾萬拓化工產(chǎn)品貿(mào)易(上海)有限公司〕;酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號:HZ-E001,上海滬震有限公司);十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒(貨號:9998029,江蘇麥格有限公司);PD1抗體(貨號:50124-R345-50)、PD-L1抗體(貨號:10084-RP02-B)均購自北京義翹神州有限公司;GAPDH抗體(貨號:AB0037,上海泊灣有限公司);電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑盒(貨號:BES-3501,上海博爾森有限公司)。

1.3放療抵抗細(xì)胞株的建立 取MLMA細(xì)胞,通過體外實驗,在培養(yǎng)皿中將細(xì)胞株暴露在不同劑量的放射線(2、4、6、8 Gray)下,觀察其存活率,選擇適當(dāng)?shù)膭┝?使細(xì)胞存活率50%～70%,進行體外放療后,再次培養(yǎng)并擴增存活的細(xì)胞,重復(fù)該過程,每次增加放療劑量,直到細(xì)胞能夠在高劑量的放療下存活,即放療抵抗細(xì)胞株構(gòu)建完成。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)與分組 取放療抵抗MLMA細(xì)胞,胰蛋白酶消化后接種于含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,將其置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,恒溫下傳代培養(yǎng),2～3 d換液傳代1次,取對數(shù)生長的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后將其接種于48孔板中,將其分為惡性淋巴瘤(A)組、多柔比星(B)組、EZH2抑制劑(C)組、EZH2抑制劑聯(lián)合PD1/PD-L1抑制劑(D)組,A組不加藥,B組加入8 μg/ml的多柔比星,C組加入5 μmol/L的EZH2抑制劑GSK343,D組加入5 μmol/L的GSK343和5 μmol/L的PD1/PD-L1抑制劑Nivolumab,加藥后將每孔液體體積補足,然后將孔板置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)以備后續(xù)實驗。

1.5Hoechst33258染色法檢測細(xì)胞凋亡 取各組細(xì)胞,固定細(xì)胞10～15 min,三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(TBST)洗滌3次,將Hoechst33258染料溶液加入到固定且洗滌好的細(xì)胞中,孵育15～30 min,TBST緩沖液洗滌細(xì)胞3次,使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

1.6MTT法檢測細(xì)胞增殖 取各組細(xì)胞,將其接種于96孔板中,將MTT溶液添加到每個孔中,使其最終濃度為0.5 mg/ml,孵育2～4 h,將培養(yǎng)基中的MTT溶液去除,加入適量的DMSO,使甲基噻唑鹽完全溶解,使用酶標(biāo)儀,在570 nm波長下測量吸光度。

1.7Transwell法檢測細(xì)胞侵襲 首先將24孔的Transwell裝置放入1個含有適量的無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,并在小室內(nèi)鋪膠,然后取各組細(xì)胞制備成懸液,待基質(zhì)膠凝后,向每個Transwell上室中添加相同數(shù)量的細(xì)胞懸液,使其均勻分布在上室底部,將Transwell裝置放入1個恒溫培養(yǎng)箱中,在37 ℃、5% CO2的條件下孵育24～48 h,孵育結(jié)束后,將Transwell裝置取出,將上室液體倒掉,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,結(jié)晶紫染色15 min,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲情況。

1.8ELISA檢測Th細(xì)胞分化相關(guān)因子 取各組細(xì)胞,培養(yǎng)72 h后取細(xì)胞上清液,ELISA試劑盒檢測Th1細(xì)胞因子干擾素(INF)-γ、Th2細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-4含量。

1.9流式細(xì)胞儀檢測Th細(xì)胞分化相關(guān)因子比率 取各組細(xì)胞,吸去培養(yǎng)基,PBS洗滌3次,0.25%的胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液,在1 000 r/min的條件下常溫離心5 min,棄掉上清液后,冰上封閉20 min,再次離心,棄掉上清液后PBS洗滌、重懸后,加入75%的乙醇冰上固定 20 min,將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml,按照抗體說明書加入INF-γ及IL-4抗體,混勻后30 r/min搖床避光孵育30 min,PBS洗滌3次,再用500倍PBS重懸細(xì)胞,然后用流式細(xì)胞儀檢測INF-γ及IL-4的表達比率。

1.10Western印跡檢測 取各組細(xì)胞,在1 000 r/min的條件下離心5 min ,棄掉上清液,用預(yù)冷的PBS洗滌2次,加入1 ml RIPA裂解液,冰上裂解20 min并不時震蕩,在4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min,取上清液,用二喹啉甲酸(BCA)法測定,首先進行蛋白定量,然后加入和上清液相同體積的蛋白上樣緩沖液,煮沸3 min使其變性,然后用SDS-PAGE試劑盒進行電泳,電泳條件為300 V,電泳20 min,將凝膠上蛋白用半干法轉(zhuǎn)移至甲醇活化的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,進行轉(zhuǎn)膜、封閉后,按照說明書以適當(dāng)比例稀釋,然后加入稀釋的PD1、PD-L1一抗,4 ℃孵育過夜后洗膜;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h;洗膜后,用ECL熒光試劑盒測定結(jié)果,設(shè)置拍攝時間并進行連續(xù)曝光,選取最佳圖像保存,用 ImageJ 分析軟件分析各段條帶的灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,計算與GAPDH比值求得PD1、PD-L1蛋白的相對表達含量。

1.11統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞凋亡 與A組相比,B、C、D細(xì)胞凋亡率明顯升高,且C組比B組升高更明顯,D組比C組升高更明顯(均P<0.05),見表1、圖1。

2.2各組細(xì)胞增殖 與A組相比,培養(yǎng)48 h時B、C、D組細(xì)胞增殖率明顯降低,且C組比B組降低更明顯,D組比C組降低更明顯(均P<0.05),見表1。

2.3各組細(xì)胞侵襲 與A組相比,B、C、D組細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯降低,且C組比B組降低更明顯,D組比C組降低更明顯(均P<0.05),見表1、圖2。

表1 各組細(xì)胞凋亡率、增殖率及侵襲數(shù)量、細(xì)胞中INF-γ、IL-4含量及PD1、PD-L1蛋白表達比較

圖1 各組細(xì)胞凋亡(Hoechst33258染色,×200)

圖2 各組細(xì)胞侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

2.4各組細(xì)胞Th分化果 與A組相比,B、C、D組細(xì)胞中INF-γ水平明顯升高,IL-4水平明顯降低,且C組比B組變化更明顯,D組比C組變化更明顯(均P<0.05),見表1、圖3。

圖3 各組細(xì)胞中INF-γ、IL-4流式細(xì)胞儀分析

2.5各組細(xì)胞PD1/PD-L1蛋白表達 與A組相比,B、C、D組細(xì)胞中PD1、PD-L1蛋白表達明顯降低,且C組比B組降低更明顯,D組比C組降低更明顯(均P<0.05),見表1、圖4。

圖4 各組細(xì)胞PD1、PD-L1蛋白表達

3 討 論

惡性淋巴瘤是一種起源于淋巴組織的惡性腫瘤,通常發(fā)生在淋巴結(jié)、脾臟、骨髓和其他淋巴組織中,我國該病的發(fā)病率男性多于女性,且呈低齡化趨勢,其死亡率也可占惡性腫瘤的第十位,可見早期認(rèn)識、診斷和治療非常重要,可以提高患者的生存率和生活質(zhì)量〔8,9〕。

本文結(jié)果說明,EZH2抑制劑可有效降低惡性淋巴瘤細(xì)胞放療抵抗。放療是臨床治療腫瘤的有效手段,其使大多數(shù)患者得以生存,但盡管如此,仍有部分患者對一線放療方案治療無效,故復(fù)發(fā)、放療抵抗仍舊是淋巴瘤臨床治療上的一個巨大挑戰(zhàn)〔10〕。放療主要是通過利用高能射線殺死或抑制腫瘤細(xì)胞的生長和分裂來達到治療目的,而放療抵抗是指腫瘤細(xì)胞對放療具有抵抗性,從而導(dǎo)致放射線殺傷腫瘤細(xì)胞作用不明顯,故細(xì)胞的凋亡、增殖及侵襲可作為顯示放療抵抗的有效指標(biāo)〔11〕。多柔比星是臨床治療惡性淋巴瘤的常用藥物,其療效確切,但具有心臟毒性,同時還可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)胃腸道反應(yīng),且近年來由于廣泛使用使得其耐藥性顯著增加,因此探尋一種新型的治療手段顯得尤為重要。研究發(fā)現(xiàn),表觀遺傳學(xué)修飾導(dǎo)致的表型及功能改變在腫瘤的發(fā)生進展中發(fā)揮著重要作用,而EZH2作為核心組分,有研究證實,其在多種腫瘤中異常表達,在淋巴瘤中是呈高表達,因此EZH2抑制劑治療應(yīng)運而生〔12〕。對于惡性淋巴瘤細(xì)胞,EZH2抑制劑可能是通過抑制相關(guān)甲基轉(zhuǎn)移酶活性,來抑制EZH2基因的轉(zhuǎn)錄及表達,從而抑制下游相關(guān)信號通路及因子的表達,進而達到抑制細(xì)胞增殖及侵襲、促進細(xì)胞凋亡的目的,最終有效恢復(fù)癌細(xì)胞自穩(wěn)態(tài),降低細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng),降低放療抵抗。蔡露青〔13〕研究表明,抑制EZH2的表達可顯著增強自然殺傷(NK)-T淋巴瘤細(xì)胞的凋亡,降低其放療抵抗,這說明其有可能成為今后治療NK/T淋巴瘤的一個新型治療靶點,這與本文結(jié)果類似。

本文結(jié)果說明,EZH2抑制劑可顯著促進Th細(xì)胞向Th1分化,抑制其向Th2分化。Th1和Th2細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)中的兩種T細(xì)胞亞群,其在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中起著重要的作用,然而,當(dāng)涉及癌癥時,Th1和Th2細(xì)胞的平衡可能被擾亂〔14〕。Th1細(xì)胞主要參與細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答,產(chǎn)生INF-γ和其他細(xì)胞因子,能夠激活巨噬細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞,對抗腫瘤細(xì)胞,Th1細(xì)胞的免疫應(yīng)答有助于控制和消除腫瘤細(xì)胞;Th2細(xì)胞主要參與體液免疫應(yīng)答,產(chǎn)生IL-4等細(xì)胞因子,并促使B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞,產(chǎn)生抗體,故高水平的Th2細(xì)胞反應(yīng)可能與腫瘤發(fā)展有關(guān),因為其可能促進炎癥反應(yīng)和腫瘤微環(huán)境的形成,從而支持腫瘤生長和轉(zhuǎn)移〔15,16〕。因此,調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡可能是癌癥治療的一個重要策略。對于惡性淋巴瘤細(xì)胞,EZH2抑制劑可能是通過調(diào)控相關(guān)特異性轉(zhuǎn)錄因子,來促進INF-γ、抑制IL-4分泌,從而糾正Thl/Th2細(xì)胞免疫失衡,進而到達抑制免疫反應(yīng)、抑制致癌基因激活及抑癌基因突變等目的,最終有效殺傷癌細(xì)胞。陳朝倫等〔17〕研究發(fā)現(xiàn),與健康對照組相比,淋巴瘤組中INF-γ明顯升高,IL-4明顯降低,這說明監(jiān)測其水平有助于淋巴瘤的診斷與預(yù)后判斷,這與本文結(jié)果類似。

本文結(jié)果說明,EZH2抑制劑可顯著PD1/PD-L1的轉(zhuǎn)錄及合成。PD1和PD-L1 蛋白屬于一對共抑制分子,是一種Ⅰ型跨膜蛋白,有研究表明,其相互結(jié)合可對T細(xì)胞的免疫應(yīng)答有負(fù)性調(diào)控作用,同時其與細(xì)胞凋亡有關(guān),可作為細(xì)胞死亡的標(biāo)記蛋白〔18〕。目前已有研究證實,PD1/PD-L1在包括淋巴瘤在內(nèi)多種腫瘤中表達上調(diào),從而參與機體免疫反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等進程,并介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免受監(jiān)視,因此PD1和PD-L1作為腫瘤免疫治療的靶點已經(jīng)成為臨床研究的熱點及焦點〔19〕。而對于惡性淋巴瘤細(xì)胞,EZH2抑制劑可能是通過抑制相關(guān)蛋白激酶活化及上游相關(guān)信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),來調(diào)控機體免疫應(yīng)答,從而抑制PD1/PD-L1表達、抑制其相互結(jié)合,進而促進T細(xì)胞的活化、增殖及對腫瘤的殺傷、抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白活化等,最終有效抑制腫瘤細(xì)胞免疫逃逸及生長,促進細(xì)胞凋亡。王平等〔20〕研究發(fā)現(xiàn), PD1/PD-L1蛋白表達在淋巴瘤中均上調(diào)表達,說明其在腫瘤的發(fā)病或進展中可能具有重要作用,這與本文結(jié)果類似。

綜上,EZH2抑制劑可顯著抑制惡性淋巴瘤細(xì)胞放療抵抗,有效調(diào)控Th細(xì)胞分化,并抑制PD1/PD-L1蛋白表達。