王偉 何天樂(lè) 李揚(yáng) 楊素清

(1邯鄲市第一醫(yī)院胸外科,河北 邯鄲 056000;2中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)2018級(jí);3河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院感控科)

食管鱗狀細(xì)胞癌(簡(jiǎn)稱(chēng)食管鱗癌)是我國(guó)食管癌的主要類(lèi)型,其惡性程度較高,是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的腫瘤之一〔1〕。雖然近年來(lái)治療食管鱗癌的技術(shù)有了較大提升,但是其患者的5年生存率仍然較低,在20%以下〔2〕。人抗原(Hu)R也被稱(chēng)為胚胎致死異常視覺(jué)蛋白(ELAVL)1,是RNA結(jié)合蛋白的一種,主要參與調(diào)控細(xì)胞的分化和應(yīng)激反應(yīng)。有研究〔3～5〕顯示,HuR在肺癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞中均呈現(xiàn)高表達(dá),其上調(diào)表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展有促進(jìn)作用。然而,HuR在食管鱗癌中的研究非常匱乏。

目前已知的是HuR在食管鱗癌中表達(dá)升高,其下調(diào)表達(dá)可抑制其癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移〔6〕,但是其具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。淋巴細(xì)胞白血病缺失基因(DLEU)2是長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)的一種,已被證實(shí)在食管癌細(xì)胞中上調(diào)表達(dá),其沉默后可抑制食管癌細(xì)胞的生物學(xué)行為〔7〕。此外,starbase軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),DLEU2與HuR可能存在結(jié)合關(guān)系。因此,本研究分析HuR與DLEU2在食管鱗癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況,并探討二者的作用關(guān)系及其對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1組織與細(xì)胞來(lái)源 選取2019年10月至2021年7月在邯鄲市第一醫(yī)院接受食管鱗癌手術(shù)的患者24例,在手術(shù)中收集癌組織與其癌旁組織,立即放入液氮中速凍備用。參與本實(shí)驗(yàn)的患者均簽署知情同意書(shū),且本研究通過(guò)河北省邯鄲市第一醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會(huì)許可。正常人食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1A及食管鱗癌細(xì)胞系KYSE30、KYSE70、KYSE270均由河南省工業(yè)微生物菌種工程技術(shù)研究中心提供。

1.2主要試劑與儀器 5周齡BALB/c裸小鼠購(gòu)自賽業(yè)(固安)生物科技有限公司,許可證號(hào)為SYXK(冀)2021-005;HuR過(guò)表達(dá)載體及其對(duì)照空載體(pc-HuR/pcDNA)、HuR慢病毒干擾載體及其陰性對(duì)照(sh-HuR/sh-NC)、DLEU2小干擾RNA及其陰性對(duì)照(si-DLEU2/si-NC)由上海生工生物公司提供;DMEM培養(yǎng)基、Trizol由美國(guó)Sigma公司提供;Lipofectamime2000試劑由美國(guó)Invitrogen公司提供;2×SYBR Green PCR Mastermix試劑盒由北京索萊寶生物公司提供;CCK-8試劑盒由武漢菲恩生物科技有限公司提供;結(jié)晶紫由沈陽(yáng)思諾達(dá)生物科技有限公司提供;Transwell小室由北京明陽(yáng)科華生物科技有限公司提供;HuR一抗及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)耦聯(lián)的二抗由美國(guó)Abcam公司提供;RNA免疫沉淀試劑盒由蘇州市賽德生物技術(shù)有限公司提供。CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自北京隆福佳生物科技有限公司;CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自山東博科科學(xué)儀器有限公司;光學(xué)顯微鏡購(gòu)自基恩士(中國(guó))有限公司。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組 正常人食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1A及食管鱗癌細(xì)胞系KYSE30、KYSE70、KYSE270放置在含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基上,胎牛血清的體積分?jǐn)?shù)為10%,于CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),溫度調(diào)整至37 ℃。利用Lipofectamime2000試劑對(duì)生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的KYSE30細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,并隨機(jī)分組為對(duì)照組(不轉(zhuǎn)染)、pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA)、pc-HuR組(轉(zhuǎn)染pc-HuR)、sh-NC組(轉(zhuǎn)染sh-NC)、sh-HuR組(轉(zhuǎn)染sh-HuR)、sh-HuR+si-NC組(轉(zhuǎn)染sh-HuR和si-NC)和sh-HuR+si-DLEU2組(轉(zhuǎn)染sh-HuR和si-DLEU2),將轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞在培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)48 h,結(jié)束后收集細(xì)胞備用。

1.4qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 采用Trizol法提取食管鱗癌組織和細(xì)胞系中的總RNA,測(cè)定濃度后對(duì)其定量,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,并利用2×SYBR Green PCR Mastermix試劑盒配制反應(yīng)體系,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后,使用2-ΔΔCt法分析HuR mRNA與DLEU2表達(dá)水平,β-actin為二者的內(nèi)參基因。HuR的引物序列為:正向5′-GGGTGACATCGGGAGAACG-3′,反向5′-CTGAACAGGCTTCGTAACTCAT-3′;DLEU2正向5′-GGCGGCGGGTACTTATCTC-3′,反向5′-CCAGGGAAGGATGTAGCTG-TG-3′;β-actin正向5′-CCCGAGCCGTGTTTCCT-3′,反向5′-GTCCCAGTTGGTGACGATGC-3′。

1.5CCK-8法檢測(cè)KYSE30細(xì)胞活性 收集經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞,將其接種在96孔細(xì)胞板上,分別在培養(yǎng)至24、48、72 h時(shí)加入20 μl CCK-8試劑,2 h后采用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)其吸光度(OD)值。

1.6平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KYSE30細(xì)胞增殖能力 將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的KYSE30細(xì)胞接種在直徑為6 cm的圓形培養(yǎng)皿上,每個(gè)培養(yǎng)皿細(xì)胞數(shù)控制在103個(gè),分別加入3 ml DMEM培養(yǎng)基,輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)基使細(xì)胞平均分布在培養(yǎng)皿上,每2 d更換1次培養(yǎng)基,2 w后棄去培養(yǎng)基,先固定10 min,然后用結(jié)晶紫染色,30 min后在顯微鏡下觀察并記錄克隆形成數(shù)目,以克隆形成數(shù)與接種細(xì)胞數(shù)的百分比代表克隆形成率。

1.7荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)觀察KYSE30細(xì)胞在體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)能力 將對(duì)照組、pcDNA組、pc-HuR組、sh-NC組、sh-HuR組、sh-HuR+si-NC組和sh-HuR+si-DLEU2組細(xì)胞胰蛋白酶化成單細(xì)胞懸液,重懸于濃度為2×106/150 μl KYSE30細(xì)胞中。將5周齡BALB/c裸小鼠置于無(wú)菌條件下,隨機(jī)分成7組,每組6只,分別于右側(cè)皮下注射細(xì)胞懸液150 μl。每隔7 d用卡尺測(cè)量腫瘤,腫瘤體積(mm3)=0.5×長(zhǎng)×寬2。28 d后處死小鼠,解剖腫瘤并稱(chēng)重。

1.8Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KYSE30細(xì)胞侵襲能力 實(shí)驗(yàn)前首先將稀釋好的基質(zhì)膠均勻鋪在Transwell小室的上層,然后將收集好的各組細(xì)胞進(jìn)行重懸,細(xì)胞濃度調(diào)整為3×104個(gè)/ml,在上室加入細(xì)胞懸液100 μl,下室加入培養(yǎng)基650 μl,24 h后進(jìn)行固定和染色,最后在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)挑選5個(gè)互不重疊的視野觀察細(xì)胞侵襲情況并記錄細(xì)胞侵襲數(shù)目。

1.9Western印跡檢測(cè)HuR蛋白表達(dá) 將各組KYSE30細(xì)胞裂解后提取其總蛋白,使用BCA試劑盒檢測(cè)其蛋白含量,然后取等量的蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和封閉,再加入HuR、β-actin抗體,稀釋比例為1∶1 000,次日加入HRP耦聯(lián)的二抗,繼續(xù)孵育1 h,最后加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑進(jìn)行顯影,并用Quantity One Image軟件分析HuR蛋白印跡,以HuR條帶與β-actin的比值表示HuR蛋白表達(dá)水平。

1.10免疫沉淀(RIP)實(shí)驗(yàn)分析HuR與DLEU2的結(jié)合關(guān)系 使用將KYSE30細(xì)胞使用RIP裂解液進(jìn)行裂解,并與磁珠共同孵育,磁珠與陰性對(duì)照正常小鼠IgG或HuR抗體結(jié)合,將收集的磁珠復(fù)合物進(jìn)行洗脫,然后提取免疫沉淀RNA,并用qRT-PCR檢測(cè)DLEU2水平,具體操作根據(jù)免疫沉淀試劑盒制造商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析、Student-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1食管鱗癌組織和細(xì)胞系HuR與DLEU2表達(dá)水平 與癌旁組織或正常人食管鱗狀上皮細(xì)胞Het-1A相比,食管鱗癌組織和細(xì)胞系KYSE30、KYSE70、KYSE270中HuR mRNA和蛋白表達(dá)及DLEU2水平均明顯升高(P<0.05),見(jiàn)圖1、表1。由于KYSE30細(xì)胞中HuR mRNA和蛋白表達(dá)及DLEU2水平最高,故選擇KYSE30細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2HuR對(duì)KYSE30細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組和pcDNA組比較,pc-HuR組KYSE30細(xì)胞中HuR蛋白表達(dá)明顯增加,48、72 h細(xì)胞活性明顯增強(qiáng),克隆形成率顯著提高(P<0.05);與對(duì)照組和sh-NC組比較,sh-HuR組KYSE30細(xì)胞中HuR蛋白表達(dá)明顯減少,48、72 h細(xì)胞活性明顯減弱,克隆形成率顯著下降(P<0.05),見(jiàn)圖1、表2。

2.3HuR對(duì)KYSE30細(xì)胞侵襲的影響 pc-HuR組KYSE30細(xì)胞侵襲數(shù)明顯較pcDNA組多(P<0.05);而sh-HuR組KYSE30細(xì)胞侵襲數(shù)明顯比sh-NC組少(P<0.05),pcDNA組、sh-NC組與對(duì)照組細(xì)胞侵襲數(shù)差異不顯著(P>0.05),見(jiàn)表2、圖2。

2.4HuR對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響 與對(duì)照組和pcDNA組比較,pc-HuR組14、21、28 d腫瘤體積明顯增加,腫瘤重量顯著升高(P<0.05);與對(duì)照組和sh-NC組比較,sh-HuR組14、21、28 d的腫瘤體積明顯減小,腫瘤重量顯著降低(P<0.05),見(jiàn)表3。

表1 食管鱗癌組織和細(xì)胞中HuR mRNA和蛋白質(zhì)DLEU2表達(dá)水平比較

表2 HuR對(duì)KYSE30細(xì)胞增殖、侵襲的影響

圖2 HuR對(duì)KYSE30細(xì)胞侵襲的影響(結(jié)晶紫染色,×200)

表3 HuR對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響

2.5HuR與DLEU2的相互作用關(guān)系 在KYSE30細(xì)胞中,HuR組DLEU2水平(6.54±1.16)明顯高于IgG組(0.23±0.02;t=13.322,P<0.05)。

2.6HuR通過(guò)調(diào)控DLEU2對(duì)KYSE30細(xì)胞增殖、侵襲的影響 與sh-HuR+si-NC組相比,sh-HuR+si-DLEU2組KYSE30細(xì)胞中DLEU2水平明顯降低,48、72 h細(xì)胞活性顯著下降,克隆形成率明顯降低,細(xì)胞侵襲數(shù)也明顯變少(P<0.05);與sh-HuR組相比,sh-HuR+si-NC組KYSE30細(xì)胞中DLEU2水平、8、72 h的細(xì)胞活性與克隆形成率、細(xì)胞侵襲數(shù)均無(wú)明顯改變(P>0.05),見(jiàn)圖3、表4。

圖3 各組KYSE30細(xì)胞侵襲(結(jié)晶紫染色,×200)

表4 HuR通過(guò)調(diào)控DLEU2對(duì)KYSE30細(xì)胞增殖、侵襲的影響

2.7HuR通過(guò)調(diào)控DLEU2對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響 與sh-HuR+si-NC組相比,sh-HuR+si-DLEU2組14、21、28 d的腫瘤體積明顯減小,腫瘤重量明顯下降(P<0.05);而sh-HuR組與sh-HuR+si-NC組以上指標(biāo)無(wú)明顯差異(P>0.05),見(jiàn)表5。

表5 HuR通過(guò)調(diào)控DLEU2對(duì)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響

3 討 論

食管鱗癌屬于消化道腫瘤,由于早期癥狀不明顯和分子診斷標(biāo)志物的缺乏,大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已到中晚期,可能錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)間,進(jìn)而導(dǎo)致患者生存率下降。同時(shí),癌細(xì)胞的易侵襲性和易轉(zhuǎn)移性是引起食管鱗癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的主要原因,也是導(dǎo)致患者低生存率的重要原因〔8〕。因此,明確食管鱗癌發(fā)病機(jī)制并尋找有效的治療靶點(diǎn)對(duì)食管鱗癌患者5年生存率的提高來(lái)說(shuō)意義重大。

HuR是ELAV家族的成員之一,在多種細(xì)胞中均有表達(dá),通過(guò)與靶基因mRNA的3'UTR端的ARE元件結(jié)合來(lái)穩(wěn)定靶mRNA,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為〔9〕。在結(jié)直腸癌〔10〕中,HuR通過(guò)與細(xì)胞分裂周期(CDC)6 3'-UTR結(jié)合上調(diào)CDC6,進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和體內(nèi)異種移植瘤的生長(zhǎng)及對(duì)奧沙利鉑的耐藥性。在卵巢癌〔11〕中,HuR和線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)位酶(TIMM)44均上調(diào)表達(dá),且HuR通過(guò)調(diào)控TIMM44 mRNA的穩(wěn)定性促進(jìn)其細(xì)胞增殖。在肝癌〔12〕中,沉默HuR表達(dá)能夠抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,其機(jī)制與調(diào)控Bcl-2表達(dá)有關(guān)。此外,經(jīng)HuR穩(wěn)定后的致癌基因SEMA4D對(duì)食管鱗癌的增殖和遷移有促進(jìn)作用,對(duì)細(xì)胞凋亡有抑制作用〔13〕。以上研究均顯示,HuR作為促癌基因在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮作用,但是其在食管鱗癌中的研究極少,其發(fā)展機(jī)制也不甚清楚。本研究結(jié)果與Xu等〔6〕結(jié)果一致,提示HuR與食管鱗癌的進(jìn)展有關(guān)。因?yàn)镠uR在KYSE30細(xì)胞中表達(dá)水平最高,所以選擇KYSE30細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。文獻(xiàn)〔14〕顯示,細(xì)胞的異常增殖和侵襲是腫瘤發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)HuR可明顯降低KYSE30細(xì)胞活性,降低克隆形成率和細(xì)胞侵襲數(shù);而抑制HuR表達(dá)可顯著提高KYSE30細(xì)胞活性,增加克隆形成率和細(xì)胞侵襲數(shù),揭示HuR促進(jìn)食管鱗癌的增殖和侵襲,其可能是食管鱗癌的分子標(biāo)志物。而且,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明,HuR在體內(nèi)也能促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。然而,HuR如何促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲還需進(jìn)一步研究。

starbase在線軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,HuR可與DLEU2的3'-UTR端結(jié)合。DLEU2位于染色體13q14.3～14.4,參與多種腫瘤的發(fā)展過(guò)程〔15〕。據(jù)報(bào)道〔16〕,DLEU2在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中均高表達(dá),其沉默后可通過(guò)調(diào)控miR-30c-5p/性別決定區(qū)Y框轉(zhuǎn)錄因子(SOX)9軸顯著抑制A549細(xì)胞進(jìn)展。He等〔17〕發(fā)現(xiàn),DLEU2在宮頸癌組織中上調(diào)表達(dá),能夠通過(guò)抑制p53表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期起促進(jìn)作用。Liu等〔18〕研究顯示,骨肉瘤組織和細(xì)胞中DLEU2水平明顯升高,其敲除后可通過(guò)海綿吸收miR-337-3p有效減弱細(xì)胞的增殖和遷移能力。本研究與Lu等〔7〕研究一致,提示DLEU2可能是食管鱗癌的分子標(biāo)志物。另外,RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明,HuR在食管鱗癌細(xì)胞中能與DLEU2相互作用,而且HuR與DLEU2共同作用不僅在體外促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖和侵襲,還在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。

綜上,HuR可穩(wěn)定DLEU2表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖、侵襲和移植瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)。