孫云朝 郭娜 葛建立 馬云龍 張欣 蘇坤 白建英

(河北省中醫(yī)院 1周圍血管科,河北 石家莊 050011;2腫瘤二科;3河北中醫(yī)學院護理學院)

肢體動脈硬化閉塞癥(ASO)是外科臨床常見病〔1〕?，F(xiàn)代研究表明,ASO是由于動脈粥樣硬化導致下肢供血動脈內(nèi)膜增厚、管腔狹窄或閉塞,從而使肢體出現(xiàn)一系列缺血癥狀的慢性進展性疾病〔2〕。ASO的發(fā)病機制尚不明確,但多數(shù)學者認為內(nèi)膜損傷對ASO的形成作用更為突出〔3〕。ASO藥物治療尚缺乏理想藥物,外科手術治療存在創(chuàng)傷大、移植物長期通暢率低等問題,介入治療的療效還存疑〔4〕。因此,如何預防和治療ASO仍然是醫(yī)學界的難題。炎癥反應在宿主防御、清除和減緩微生物入侵時的感染方面起著至關重要的作用,在炎癥反應過程中,細胞產(chǎn)生多種細胞因子,觸發(fā)或增強特異性炎癥反應〔5〕。腫瘤壞死因子(TNF)-α在許多免疫和炎癥過程中起著至關重要的作用,如增殖、凋亡、壞死和細胞存活等,其在協(xié)調(diào)細胞因子級聯(lián)和炎癥細胞因子產(chǎn)生的主要調(diào)節(jié)器中起作用。TNF-α信號異?？蓪е略S多疾病,包括類風濕關節(jié)炎、銀屑病、克羅恩病、動脈粥樣硬化和癌癥。由于TNF-α的重要性,調(diào)節(jié)TNF-α活性是治療相關疾病的關鍵〔6〕。miRNA是一類內(nèi)生的不具備編碼功能的小分子RNA,其能對mRNA的翻譯起到阻礙作用,或是促使靶mRNA被降解,參與細胞的生長、凋亡、遷移等〔7〕。有研究證明miR-133a在ASO平滑肌細胞中有明顯表達,其能促進人動脈平滑肌細胞的增殖和遷移〔8〕。但有關miR-133a與ASO關系的研究較少,其具體作用機制仍需要研究和驗證。中醫(yī)學認為ASO屬“脫疽”范疇,認為其發(fā)病病機氣虛推動無力,素體氣陰兩虛,痰瘀互結為癥,日久最終導致痰瘀阻絡形成“脫疽”,治療需以益氣養(yǎng)陰、消癥散結、通經(jīng)活絡為主〔9〕。芪黃疽愈方是本課題組多年臨床經(jīng)驗組成的驗方,而有關芪黃疽愈方在ASO中的研究和應用已有報道〔10,11〕。本實驗通過高脂飲食喂飼聯(lián)合隱動脈內(nèi)膜損傷方法制作大鼠ASO模型,探討芪黃疽愈方對ASO模型大鼠炎癥相關因子與miR-133a表達的影響,為芪黃疽愈方通過抑制炎癥反應、保護動脈內(nèi)皮、防治ASO提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物 選擇雄性SD 大鼠96只,4～6周齡,由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供(合格證號:20194PP22),體質(zhì)量(200±20)g。

1.2藥物 芪黃疽愈方:黃芪20 g、雞血藤15 g、海藻、黃精、延胡索、鬼箭羽、紅花各12 g、土鱉蟲、牛膝各9 g,按照原方組方比例,并根據(jù)體表面積比率折算出200 g大鼠等效用藥劑量作為中濃度組,另取1/2劑量和2倍劑量作為低濃度組和高濃度組,飲片全部取自河北省中醫(yī)院藥劑科,并經(jīng)過2位以上藥劑師鑒定符合各項規(guī)定,水煎后,4 ℃冰箱保存,芪黃疽愈方組最終濃度為0.5、1.0、2.0 g生藥/ml。

1.3試劑及儀器 高脂飼料組方:83.15%基礎飼料、5%豬油(河北醫(yī)科大學實驗動物中心)、10%蛋黃粉(北京金健力科技公司)、1%膽固醇和0.15%膽酸鈉(淮北中邁生物科技有限公司)等。西洛他唑片(浙江大冢制藥有限公司,批號:H10960014)。

1.4ASO模型建立 雄性SD大鼠96只飼養(yǎng)1 w,隨機選擇18只作為空白組;剩余78只采用高脂飲食喂飼聯(lián)合隱動脈內(nèi)膜損傷的方法建立大鼠ASO模型,造模成功后隨機分為模型組18只,西藥組、芪黃疽愈方高、中、低濃度組各15只。采用高脂飲食喂飼聯(lián)合隱動脈內(nèi)膜損傷方法制作大鼠ASO模型〔10〕,實驗前適應性喂養(yǎng)1 w,然后高脂飼料喂養(yǎng)1 w。采用1%戊苯巴比妥鈉(1 ml/200 g)腹腔注射麻醉大鼠,從腹股溝中點向后肢內(nèi)側縱行切開皮膚,暴露隱動脈,動脈夾阻斷隱動脈,將0.2～0.3 ml注射用無菌蒸餾水緩慢注入阻斷部位血管,至血管充盈為止,壓迫止血,縫合切口,內(nèi)膜損傷模型完成。

1.5給藥方法 空白組:自由飲水,普通飲食喂養(yǎng)。模型組:建立ASO模型,造模1 w后,給予生理鹽水(1 ml/100 g大鼠)灌胃,自由飲水,1次/d,連續(xù)12 w。芪黃疽愈方組(中藥低、中、高濃度組):建立ASO模型,造模1 w后,芪黃疽愈方相應濃度中藥灌胃(0.1、0.5、1.0 ml/100 g體質(zhì)量),自由飲水,1次/d,連續(xù)12 w。西藥組造模1 w后,給予西洛他唑片灌胃治療,藥量18 mg/kg,1次/d,連續(xù)12 w。

1.6各組一般狀態(tài) 包括毛色、體質(zhì)量、活動靈敏度、飲食、飲水量等。治療12 w末次給藥前禁食12 h,給藥1 h后,麻醉同前,切取大鼠左后肢隱動脈,用4%多聚甲醛溶液固定并進行常規(guī)石蠟包埋。分別于治療前、治療12 w后,經(jīng)下腔靜脈采血約8 ml,2 500 r/min 離心5 min后,分離出血清分為2份,于-80 ℃保存,用于免疫學檢測。

1.7血漿血脂檢測 用全自動生化分析系統(tǒng)檢測血漿總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.8全血檢測血流變學指標 由腹主動脈采血4～5 ml至抗凝采血管中,混勻后于血流變分析儀上進行全血測試,包括高切指數(shù)、低切指數(shù)與紅細胞聚集指數(shù)等。

1.9酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中TNF-α含量 取全大鼠血樣本,提取外周血血清,采用ELISA法檢測血清中TNF-α蛋白表達。操作步驟按ELISA試劑盒說明書進行操作,測量樣本490 nm處光密度(OD)值。

1.10基因芯片檢測miRNA表達 選取模型組及空白組各3只,將兩組動脈組織樣本送至上海吉凱基因公司,按照安捷倫miRNA表達譜芯片(大鼠)標準化操作流程進行芯片分析。靶基因預測通過TargetScan、miRWalk和miRDB進行miRNA155-5p 在線數(shù)據(jù)庫預測miRNA的潛在靶基因,并取兩者的交集作為最終候選靶基因。

1.11Western印跡分析 大鼠動脈組織用組織蛋白提取試劑盒提取全蛋白后,用細胞裂解試劑(MO)裂解細胞,提取總蛋白。利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量蛋白(約30 μg)后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后一抗(用5%脫脂奶粉1∶500稀釋)4 ℃孵育過夜后磷酸鹽緩沖液(PBS)進行3次洗滌,5 min/次,洗膜后再用二抗室溫下孵育2 h,加入顯色劑曝光后,使用融合SL成像系統(tǒng)(Viber Lourmat,法國)顯色,以GAPDH為內(nèi)對照。將膠片進行拍照,用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標帶的OD值。

1.12RT-q聚合酶鏈反應(PCR)檢測血清和組織中miR-133a和TNF-α mRNA含量 取同時間組織和全血樣本,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。然后進行實時PCR擴增。引物序列:miR-133a正向引物5′-CAAGCTGGTAAAAATGGAA-3′,反向5′-TATGGTTTTGACGACTGTGTAT-3′;TNF-α正向引物5′-ATCCAGTGAGTTCCGAAAGC-3′,反向5′-ATCCAGTGAGTTCCGAAAGC-3′。應用U6作為內(nèi)參,正向引物5′-TGCGGGTGCTCOGCTTOGGC-3′,反向5′-CA-GTGCAGGGTCCGAGGTCT-3′。具體反應條件為:95 ℃進行5 min預變性,95 ℃ 30 s 變性,60 ℃ 1 min退火,72 ℃進行30 s延伸,共進行45個循環(huán),再72 ℃ 10 min延伸。應用2-△△Ct法計算miR-133a表達量。

1.13病理檢查 脫頸椎處死大鼠,立即打開腹腔,取右下肢股動脈,石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色觀察。

1.14統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.00軟件進行方差分析、t檢驗及Pearson相關分析。

2 結 果

2.1各組一般情況比較 空白組毛色光澤,體質(zhì)量隨飼養(yǎng)時間延長而增,活動靈敏,飲食、飲水量正常,無死亡。與中藥組比較,模型組精神萎靡,活動欠靈敏,毛色暗淡,開始體質(zhì)量增長迅速,然后增長速度減緩,食量相對空白組也減少。中藥組隨著用藥劑量的增加,大鼠恢復正常越顯著,無死亡。

2.2各組TC、TG、LDL-C、HDL-C表達比較 與空白組比較,模型組治療后血清TC、TG、LDL-C值顯著升高,HDL-C值顯著降低(P<0.05);與本組治療前比較,治療后空白組與模型組TC、TG、LDL-C、HDL-C值無統(tǒng)計學差異(P>0.05),西藥組、中藥各濃度組TC、TG顯著降低,西藥、中藥高濃度組LDL-C值顯著降低(P<0.05);與模型組治療后比較,西藥組、中藥各濃度組血清TC、TG值顯著降低,西藥、中藥高濃度組LDL-C值顯著降低(P<0.05);TC值由中藥低濃度組到高濃度組依次降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),中藥高濃度組(LDL-C值)顯著低于中、低濃度組(P<0.05),見表1。

表1 各組TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較

2.3各組用藥前后血流變學指標比較 與空白組比較,治療后模型組紅細胞聚集指數(shù)、低切指數(shù)、高切指數(shù)明顯升高(P<0.05,P<0.01);與本組治療前比較,西藥組、中藥各濃度組以上指標顯著降低(P<0.05,P<0.01);與模型組治療后比較,西藥組、中藥各濃度組以上指標顯著降低(P<0.05,P<0.01);治療后紅細胞聚集指數(shù)、低切指數(shù)、高切指數(shù)由中藥低濃度組到高濃度組依次降低,兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

2.4基因芯片檢測miRNA表達 取模型組和空白組血進行差異基因分析,結果如圖1、2所示。以P<0.05,差異倍數(shù)(FC)>1.5為篩選標準,選取了表達差異較大的miR-133a。

2.5靶基因預測 通過TargetScan、miRWalk和miRDB進行miR155-5p靶基因預測,韋恩圖取交集后,選取TNF-α為目標靶基因,并預測miR-133a和TNF-α的作用靶點,見圖3、圖4。

2.6各組用藥前后miR-133a、TNF-α表達比較 與空白組比較,治療后模型組TNF-α含量、miR-133a、TNF-α mRNA及蛋白表達水平明顯升高(P<0.05,P<0.01);與本組治療前比較,西藥組、中藥各濃度組以上指標明顯降低(P<0.05,P<0.01);與模型組治療后比較,西藥組、中藥各濃度組以上指標明顯降低(P<0.05);治療后,以上指標由中藥低濃度組到高濃度組依次降低,兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01),見表2、表3、圖5。

表2 各組用藥前后血流變學指標及TNF-α蛋白表達比較

N為空白組,T為模型組圖1 基因芯片檢測空白組及模型組中差異miRNA表達

2.7RT-qPCR檢測各組組織中miR-133a、TNF-α mRNA表達 與空白組比較,治療后模型組miR-133a、TNF-α mRNA表達水平顯著升高(P<0.01);與本組治療前比較,西藥組、中藥各濃度組以上指標顯著降低(均P<0.01);與模型組治療后比較,西藥組、中藥各濃度組miR-133a、TNF-α mRNA表達水平明顯降低(均P<0.05);治療后miR-133a、TNF-α相對表達水平由低濃度組到高濃度組依次降低,兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01,P<0.05)。

見表3。這與大鼠血中檢測miR-133a、TNF-α mRNA表達結果具有一致性。

紅色:miRNA高表達,綠色:miRNA低表達圖2 miRNA差異表達

圖3 韋恩圖

圖4 miR-133a和TNF-α的靶基因預測及作用靶點

表3 各組用藥前后血清miR-133a、TNF-α含量及mRNA表達水平比較

圖5 Western印跡檢測各組治療前后TNF-α蛋白表達

2.8各組病理結果 空白組內(nèi)皮細胞層完整,平滑肌層以平滑肌細胞和彈力纖維為主,內(nèi)撣力板連續(xù)規(guī)整,無增殖及脂質(zhì)沉積。模型組纖維母細胞大量代替內(nèi)皮細胞,內(nèi)膜增厚、部分管腔閉塞,空泡細胞、脂質(zhì)沉積。中藥各濃度組纖維母細胞大量代替內(nèi)皮細胞,內(nèi)膜增厚、部分管腔閉塞,空泡細胞、脂質(zhì)沉積隨著中藥濃度增加而減少。西藥組纖維母細胞大量代替內(nèi)皮細胞,內(nèi)膜增厚、部分管腔閉塞,有少量空泡細胞,脂質(zhì)沉積較少,見圖6。

圖6 各組動脈內(nèi)皮病理變化(HE染色,×100)

2.9miR-133a與各指標相關性 miR-133a與TNF-α(r=0.814,P=0.001)、血脂指標〔TC、TG、LDL-C(r=0.633、0.732、0.573,P=0.016、0.002、0.025)〕、血流變學指標〔紅細胞聚集指數(shù)、低、高切指數(shù)及動脈脂肪沉積量呈正相關(r=0.749、0.764、0.832、0.583,P=0.011、0.003、0.001、0.020)〕。

3 討 論

ASO作為動脈粥樣硬化累及周圍動脈的一種臨床表現(xiàn),病殘率和病死率較高,當前在我國的患者數(shù)不斷增多,嚴重危害身體健康和生活質(zhì)量〔12〕。現(xiàn)代研究表明,多種炎癥細胞因子參與了粥樣硬化斑塊的形成、破裂及血栓形成,內(nèi)皮細胞的損傷、血管活性因子的失調(diào),導致內(nèi)膜下基質(zhì)暴露于血流中,促使多種血管活性物質(zhì)釋放,內(nèi)源性及外源性凝血系統(tǒng)被激活,誘導血栓的形成,從而導致ASO的發(fā)生〔13〕。利用大鼠制作ASO模型,通常方法為高脂飲食喂飼聯(lián)合隱動脈內(nèi)膜損傷,其能在較短時間內(nèi)建立較成熟的動脈粥樣硬化斑塊模型〔14〕。

中醫(yī)歷代醫(yī)家從病因病機到診斷治療均有記載,雖療效尚可,但多不穩(wěn)定,每易復發(fā),且大多僅為臨床經(jīng)驗的總結,尚缺乏系統(tǒng)的科學論證。根據(jù)“氣血津液”“標本虛實”及“久病入絡”等理論,ASO屬中醫(yī)學“脫疽”等范疇〔15〕。脫疽是氣陰兩虛為本,病位在血脈,為本虛標實之證,經(jīng)絡癥積瘀結為標,在治療上需要益氣養(yǎng)陰、消癥散結、通經(jīng)活絡〔16〕。在芪黃疽愈方中,黃芪益氣固表;黃精補氣養(yǎng)陰,益腎填精;紅花活血化瘀;鬼箭羽、延胡索、雞血藤通經(jīng)活血,行氣止痛;土鱉蟲、海藻破瘀通經(jīng),化痰散結;牛膝破血通經(jīng),引藥下行。諸藥合用可行血通絡?，F(xiàn)代醫(yī)學認為黃芪皂苷可延長電刺激大鼠頸總動脈形成血栓的時間,有較好的抗內(nèi)皮細胞損傷的作用〔17〕。黃精具有調(diào)節(jié)高脂血癥血脂代謝和抗動物粥樣硬化形成的作用,也具有增強免疫功能及抗脂質(zhì)過氧化的作用〔18〕。紅花也抑制血小板聚集和抑制凝血系統(tǒng),也可以通過降血脂和抗氧化來干預動脈粥樣硬化〔19〕。鬼箭羽、土鱉蟲等都具有延緩動脈粥樣硬化形成的作用。延胡索、雞血藤、牛膝都具有擴血管、抗血小板聚集的作用。血脂代謝紊亂與動脈粥樣硬化形成有相關性,血脂可刺激纖維組織增生,形成動脈粥樣斑塊〔20〕。在血液流變學指標中,血液黏度升高,增加了血液對血管壁的浸潤機會,使血管壁的內(nèi)皮增厚〔21〕。也有研究表明,血液流變學異常先于動脈硬化的形成,其改變對微循環(huán)障礙、促進血管損傷等具有重要作用〔22〕。臨床研究也表明芪黃疽愈方能明顯改善ASO患者的患肢血液循環(huán),降低致殘率〔23〕。本研究提示,芪黃疽愈方能明顯改善ASO癥狀和血脂指標,這與以往研究結果具有一致性。同時本研究還發(fā)現(xiàn),芪黃疽愈方可能通過改變血液流變學異,改變微循環(huán)障礙,促進血管內(nèi)皮的修復;病理學分析發(fā)現(xiàn),芪黃疽愈方能夠明顯降低脂質(zhì)沉積,隨中藥濃度增加而減少,這與本研究其他結果一致。

ASO主要發(fā)生于下肢中小動脈,其病因尚不明確〔24〕。目前認為多種炎癥細胞因子在粥樣硬化斑塊的形成、破裂及血栓形成中起促進作用〔25〕?，F(xiàn)代研究認為,TNF-α等因子在炎癥反應過程中較為關鍵,因此調(diào)節(jié)機體炎癥細胞因子,抑制炎癥反應,能保護血管內(nèi)皮,達到防治ASO的目的〔26〕。本研究提示,TNF-α可能參與了ASO發(fā)生的炎癥反應。通過芪黃疽愈方治療后,本研究還發(fā)現(xiàn)TNF-α表達顯著降低,這與以往研究發(fā)現(xiàn)芪黃疽愈方具有抗病毒、抗炎癥細胞因子、免疫調(diào)節(jié)、補血活血、抗腫瘤等多種作用一致,其也與擴張冠狀動脈,抑制血小板聚集,抗心律失常,增加冠脈血流量,改善心肌供氧等藥理作用〔27〕的結果具有一致性。其機制可能是通過TNF、集落刺激因子等影響,增加其免疫活性,可使血管再生因子的數(shù)量增加。不過由于時間、經(jīng)費等原因,本研究未能闡明芪黃疽愈方單味中藥對炎癥細胞因子的作用機制,將在后續(xù)的研究中進行深入分析。

miRNA為一類內(nèi)生性非編碼小分子RNA,可作用于多個靶基因,從而參與細胞的增殖、凋亡等,調(diào)控多種疾病的發(fā)生發(fā)展。miR-133a由位于7號染色體的基因編碼和轉(zhuǎn)錄,在機體發(fā)生炎癥過量釋放時表達上調(diào),可具有一定的組織特異性〔28〕。研究表明,miR-133a主要位于ASO的平滑肌細胞中〔29〕,其通過靶向腎素-血管緊張素系統(tǒng)同源基因家族成員(Rho)A調(diào)節(jié)動脈平滑肌細胞增殖和遷移,miR-133a可能參與了ASO的發(fā)病機制〔30〕。本研究結果提示,miR-133a可對上述指標產(chǎn)生影響,在ASO病程中發(fā)揮作用。推測芪黃疽愈方可能通過抑制miR-133a表達降低炎癥因子TNF-α表達水平,從改變血脂指標、血流變學指標及動脈脂肪沉積量,這與本研究靶基因預測結果具有一致性。