單萍 張繼龍

(武漢市第一醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科,湖北 武漢 430022;2急診科)

腦血管病是導(dǎo)致中國居民殘疾和死亡的重要原因,其中81.9%為缺血性腦卒中〔1〕。由于高血壓的持續(xù)高流行和人口老齡化,我國腦卒中發(fā)病率和死亡率均處于較高水平〔2〕。因此,了解腦缺血后神經(jīng)損傷的機(jī)制,有利于尋找藥物促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。缺血發(fā)生時,神經(jīng)元首先喪失氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng),隨后發(fā)生氧化應(yīng)激、興奮性毒性和細(xì)胞凋亡等多重?fù)p傷,最終引起大腦結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙〔3,4〕。研究〔5〕顯示,氧化應(yīng)激為腦缺血和再灌注的關(guān)鍵有害因素,減輕氧化應(yīng)激可抑制神經(jīng)元凋亡。陳皮、枳實為常用理氣中藥,為中醫(yī)治療“中風(fēng)”“胸痹”的共用藥物〔6〕。柚皮素(NAR)為陳皮、枳實的主要活性成分,具有較強(qiáng)的抗神經(jīng)元凋亡和抗氧化能力〔7〕。Salman等〔8〕指出,NAR可增加紋狀體單胺氧化酶活性,抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化,減弱神經(jīng)元凋亡,減輕3-硝基丙酸誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)損傷。聲波刺猬(SHH)-膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源物(GLI)1通路為中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)節(jié)者,SHH與其受體Patched(Ptch)結(jié)合后會激活GLI,啟動包括腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、c-AMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)等多種靶基因的表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞(神經(jīng)元等)的存活和分化〔9,10〕。然而NAR對SHH-GLI1通路的作用仍待探討。因此,本研究以氧糖剝奪/復(fù)氧復(fù)糖(OGD/R)誘導(dǎo)神經(jīng)元模擬腦缺血所致神經(jīng)元損傷,基于SHH-GLI1通路探討NAR對神經(jīng)元凋亡的調(diào)控作用,以期為缺血性腦卒中的新藥開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞 大鼠皮層神經(jīng)元及專用培養(yǎng)基(武漢普諾賽公司)。

1.2材料及儀器 NAR(≥98%純度,美國Sigma公司);環(huán)巴胺(美國MCE公司);活性氧(ROS)試劑盒(DCFH-DA,上海碧云天公司);丙二醛(MDA)試劑盒、8-羥脫氧鳥苷(OHdG)試劑盒、CCK-8試劑盒(上海生工公司);TUNEL試劑盒、SHH、CREB、Ptch1、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、羊抗兔二抗及4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)試劑(美國CST公司);BDNF、GLI1(JF09-08標(biāo)記)抗體(美國Thermo公司);細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本PHCbi公司);熒光顯微鏡(日本Olympus公司);移液器(德國Eppendorf公司);酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀、低溫離心機(jī)(美國Thermo公司)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和分組 大鼠皮層神經(jīng)元接種在專用培養(yǎng)基中,置于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中復(fù)蘇培養(yǎng),取對數(shù)期神經(jīng)元隨機(jī)分組。(1)正常組:將神經(jīng)元在37 ℃、5%CO2和95%空氣下在專用培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 h;(2)OGD/R組:將神經(jīng)元在37 ℃、5%CO2和95%氮氣下在無葡萄糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h以實現(xiàn)OGD,隨后立即換為專用培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2和95%空氣下培養(yǎng)24 h以實現(xiàn)復(fù)氧復(fù)糖〔11〕;(3)NAR組:將神經(jīng)元在37 ℃、5%CO2和95%氮氣下在無葡萄糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h,隨后立即換為含40 mg/L NAR的專用培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2和95%空氣下培養(yǎng)24 h;(4)NAR+環(huán)巴胺組:將神經(jīng)元在37 ℃、5%CO2和95%氮氣下在無葡萄糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h,隨后立即換為含40 mg/L NAR和46 nmol/L環(huán)巴胺的專用培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2和95%空氣下培養(yǎng)24 h。收集神經(jīng)元檢測。

1.4神經(jīng)元活性檢測 取對數(shù)期神經(jīng)元接種于96孔板(每孔接種5×103個),進(jìn)行如下處理。(1)分別使用含0.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0、320.0 mg/L的NAR專用培養(yǎng)基處理神經(jīng)元24 h,每孔加入10 ml CCK-8檢測液培養(yǎng)2 h,讀取450 nm下光密度(OD)值,計算神經(jīng)元活力,篩選NAR對神經(jīng)元無毒的劑量進(jìn)行實驗。(2)在進(jìn)行OGD/R誘導(dǎo)后,分別使用含0.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L NAR的專用培養(yǎng)基處理24 h,CCK-8法檢測并計算神經(jīng)元活力,篩選NAR抑制OGD/R誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的最佳作用濃度。

1.5神經(jīng)元ROS、8-OHdG、MDA水平檢測 按照1.3中分組培養(yǎng)神經(jīng)元后,更換為含10 mmol/L DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基,繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)25 min,離心收集管底神經(jīng)元,加入上樣緩沖液懸浮并計數(shù),調(diào)整神經(jīng)元懸液密度為1×106個/ml,上流式細(xì)胞儀分析ROS含量。收集1.3中分組培養(yǎng)的神經(jīng)元,加入裂解液,在冰盒中裂解10 min,離心收集上清,轉(zhuǎn)移200 ml上清至新EP管中,加入MDA檢測液(體積比1∶3),蓋緊煮沸60 min,冰浴冷卻后離心取上清,測定530 nm處OD值,計算MDA水平。另外,將預(yù)包被酶標(biāo)板置于48孔板中,加入50 ml神經(jīng)元裂解液上清和50 ml 8-OHdG抗體工作液,封板后孵育45 min;加入100 ml辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記鏈霉素工作液,封板后孵育30 min;加入90 ml顯色液避光孵育15 min,終止反應(yīng),測定450 nm處OD值,計算8-OHdG水平。

1.6神經(jīng)元凋亡率檢測 按照1.3中分組培養(yǎng)神經(jīng)元后,按每孔1×104個細(xì)胞接種至96孔板,每孔加入50 ml預(yù)先配制好的TUNEL檢測液,孵育40 min后移去TUNEL檢測液;每孔加入100 ml反應(yīng)緩沖液;加入DAPI染核后每孔加入100 ml 4%多聚甲醛固定20 min。熒光顯微鏡下檢測綠色熒光強(qiáng)度并拍照。

1.7SHH-GLI1通路及BDNF、CREB蛋白檢測 收集1.3中各組神經(jīng)元,在冰上用RIPA裂解液裂解50 min,提取總蛋白。立即測定其濃度并調(diào)整至濃度一致。蛋白樣品在100 ℃水浴鍋中變性10 min,取30 mg上樣、電泳分離、轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜,膜依次在5 g/L脫脂奶粉中封閉1 h,在一抗(SHH、GLI1、Ptch1、BDNF、CREB、GAPDH,稀釋1∶500或1∶1 000)中作用過夜,在HRP二抗(稀釋1∶2 000)中作用1 h,化學(xué)發(fā)光液顯影并拍照。分析蛋白灰度值。

1.8免疫熒光染色 按照1.3中分組培養(yǎng)神經(jīng)元,待神經(jīng)元爬片后取出玻片,置于磷酸鹽緩沖液(PBS)中浸洗,轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛中固定,滴加山羊血清封閉,滴加熒光標(biāo)記的GLI1抗體(稀釋1∶100)孵育過夜,滴加DAPI復(fù)染45 min,封片,熒光顯微鏡下分析紅色熒光強(qiáng)度并拍照。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS25軟件和GraphPad8.0進(jìn)行方差分析和SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1篩選NAR的作用濃度 經(jīng)計算,NAR半抑制濃度(IC50)為167.0 mg/L,與0.0 mg/L NAR〔(100.00±8.96)%〕比較,2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg/L NAR神經(jīng)元活力〔(99.68±7.36)%、(98.79±7.12)%、(100.16±6.97)%、(98.98±6.35)%、(96.43±5.16)%〕無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),80、160、320 mg/L NAR顯著抑制神經(jīng)元活力〔(74.68±9.02)%、(43.25±3.41)%、(36.12±2.33)%,P<0.05〕。表明40 mg/L NAR對神經(jīng)元無毒。

2.2篩選NAR抑制OGD/R誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的最佳作用濃度 單純OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元活力〔(49.73±5.14)%〕顯著低于未經(jīng)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元〔(100.13±7.65)%,P<0.05〕。與單純OGD/R誘導(dǎo)后比較,聯(lián)合5、10、20、40 mg/L NAR〔(58.71±5.08)%、(62.83±5.46)%、(72.35±5.41)%、(81.49±6.50)%〕均可顯著提高神經(jīng)元細(xì)胞活力(P<0.05)。后續(xù)實驗均采用效果最好的40 mg/L NAR進(jìn)行。

2.3NAR改善OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元氧化損傷 相較于正常組,OGD/R組神經(jīng)元中ROS相對熒光強(qiáng)度、8-OHdG、MDA水平顯著增加(P<0.05);相較于OGD/R組,NAR組神經(jīng)元中ROS相對熒光強(qiáng)度、8-OHdG、MDA水平顯著降低(P<0.05);相較于NAR組,NAR+環(huán)巴胺組神經(jīng)元中ROS相對熒光強(qiáng)度、8-OHdG、MDA水平顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組ROS相對熒光強(qiáng)度、8-OHdG、MDA比較

2.4NAR減輕OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡 TUNEL結(jié)果顯示,正常組神經(jīng)元細(xì)胞核呈規(guī)則圓形;OGD/R組部分神經(jīng)元細(xì)胞核皺縮、破碎;NAR組神經(jīng)元細(xì)胞核趨于規(guī)則;NAR+環(huán)巴胺組細(xì)胞核皺縮、破碎的神經(jīng)元增多。與正常組〔(6.80±0.52)個/視野〕比較,OGD/R組TUNEL+神經(jīng)元數(shù)量〔(35.33±4.27)個/視野〕顯著增加(P<0.05);與OGD/R組比較,NAR組TUNEL+神經(jīng)元數(shù)量〔(11.60±0.46)個/視野〕顯著減少(P<0.05);與NAR組比較,NAR+環(huán)巴胺組TUNEL+神經(jīng)元數(shù)量〔(24.80±3.91)個/視野〕顯著增加(P<0.05),見圖1。

圖1 各組神經(jīng)元凋亡(TUNEL染色,×200)

2.5NAR促進(jìn)GLI1核轉(zhuǎn)位并上調(diào)BDNF、CREB表達(dá) 相較于正常組,OGD/R組神經(jīng)元中BDNF、CREB蛋白及核/質(zhì)GLI1水平明顯升高(P<0.05);相較于OGD/R組,NAR組神經(jīng)元中BDNF、CREB蛋白及核/質(zhì)GLI1水平明顯升高(P<0.05);相較于NAR組,NAR+環(huán)巴胺組神經(jīng)元中BDNF、CREB蛋白及核/質(zhì)GLI1水平明顯降低(P<0.05),見表2、圖2。

圖2 各組GLI1核轉(zhuǎn)位觀察(免疫熒光染色,×1 000)

2.6NAR上調(diào)SHH-GLI1通路蛋白表達(dá) 相較于正常組,OGD/R組神經(jīng)元中SHH、GLI1、Ptch1蛋白水平明顯升高(P<0.05);相較于OGD/R組,NAR組神經(jīng)元中SHH、GLI1、Ptch1蛋白明顯升高(P<0.05);相較于NAR組,NAR+環(huán)巴胺組神經(jīng)元中SHH、GLI1、Ptch1蛋白無明顯變化(P>0.05),見表2、圖3。

表2 各組SHH-GLH1通路蛋白及BDNF、CREB蛋白及核/質(zhì)GLI1水平比較

1～4:正常組、OGD/R組、NAR組、NAR+環(huán)巴胺組圖3 Western印跡檢測各組SHH-GLI1通路蛋白及BDNF、CREB蛋白水平

3 討 論

近年,缺血性腦卒中仍然是導(dǎo)致殘疾和死亡的重點腦血管病,其所造成的中國乃至全球負(fù)擔(dān)均呈增加趨勢〔2,12〕。缺血腦區(qū)域產(chǎn)生的ROS可引起神經(jīng)元損傷或凋亡,積極干預(yù)以減輕ROS造成的氧化損傷,逐漸有望成為挽救缺血性神經(jīng)損傷的保護(hù)策略〔13〕。本研究證實了NAR的神經(jīng)元保護(hù)作用。篩選中藥材的有效活性成分,并對其生物活性進(jìn)行證明,有利于提高中藥認(rèn)可度,擴(kuò)大中藥的使用范圍。作為陳皮、枳實等重要的活性成分,NAR抗氧化活性受到廣泛關(guān)注。Li等〔14〕研究表明,NAR可激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)α/沉默信息調(diào)節(jié)因子(Sirt)1信號通路,增加ROS清除,發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮損傷的作用。Xu等〔15〕研究顯示,NAR對缺血/再灌注心肌的氧化應(yīng)激和鐵死亡有明顯抑制效果,可以激活核因子相關(guān)因子2抗氧化軸,并抑制鐵沉積。與Olugbemide等〔16〕研究一致,本研究也證實,NAR可降低ROS、8-OHdG、MDA水平,減輕氧化損傷,表明NAR可減輕OGD/R誘導(dǎo)神經(jīng)元氧化損傷。

氧化應(yīng)激是腦缺血神經(jīng)損傷的關(guān)鍵病理變化,由ROS產(chǎn)生、升高引起,ROS會對細(xì)胞的所有成分(包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA)造成損害〔17〕。氧化性DNA或脂質(zhì)等損傷可觸發(fā)多種促死亡信號,進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡并危及腦卒中后功能損傷〔18〕。已有研究〔19〕發(fā)現(xiàn),NAR可減輕腦缺血再灌注引起的皮層組織DNA損傷。本研究表明,NAR可以減輕OGD/R誘導(dǎo)的因氧化劑水平增多而發(fā)生的損傷。

SHH-GLI1通路參與調(diào)節(jié)神經(jīng)存活、再生和分化,在缺血/缺氧的早期,神經(jīng)元中的SHH、GLI1、Ptch1蛋白表達(dá)上調(diào),是機(jī)體啟動的創(chuàng)傷后自保護(hù)機(jī)制〔20〕。另外,抑制SHH-GLI1通路可加劇大鼠的缺血性損傷,可能與GLI1、Ptch表達(dá)下調(diào)相關(guān);激活SHH-GLI1通路則可保護(hù)神經(jīng)元,減輕神經(jīng)膠質(zhì)增生,恢復(fù)新生大鼠缺血性神經(jīng)功能缺損〔21〕。本文提示,SHH信號通路為缺血性腦卒中的治療靶點。本研究說明,NAR對神經(jīng)元氧化損傷和凋亡的保護(hù)作用是通過激活SHH-GLI1通路,促進(jìn)BDNF、CREB的表達(dá)實現(xiàn)的。SHH-GLI信號的激活也可通過保護(hù)神經(jīng)血管單元〔22〕、減輕神經(jīng)炎癥〔23〕等發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,提示NAR還可能具有保護(hù)神經(jīng)血管單元、減輕神經(jīng)炎癥的功效,這些均有待研究。