楊楊 姚偉祥 葉旭瑩 鄒戈

(廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院,廣東 廣州 510000)

膀胱癌已成為全球范圍內(nèi)最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一。根據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù),約90%的膀胱癌病例經(jīng)組織學檢查被定義為膀胱尿路上皮癌。2020年,膀胱癌的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位居第10位,而在男性泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中,其發(fā)病率和死亡率均排名第2〔1,2〕。據(jù)統(tǒng)計,全球膀胱癌的患者數(shù)量已經(jīng)超過40萬,且男性患者比例比女性更大,好發(fā)于60歲以上的人群,40歲及以下年齡段的個體更容易受到膀胱癌的影響,這主要歸因于他們更容易接觸到一些有毒物質(zhì),例如尼古丁,這也是膀胱癌的主要誘因之一〔3,4〕。當前診斷膀胱癌的金標準仍然是通過膀胱鏡檢查進行組織活檢。核基質(zhì)蛋白22和膀胱腫瘤抗原的膠體金免疫層析法作為無創(chuàng)的檢查方法,是美國食品和藥物管理局批準的臨床方法,然而,它們的靈敏度太低,且血尿容易導致假陽性結(jié)果〔5～7〕。因此,迫切需要一種平衡靈敏度和特異性的膀胱癌診斷方法。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類閉合的RNA分子,通過3′和5′兩端相連而形成的閉合環(huán)形分子,具有多樣的序列構(gòu)成,可以由外顯子或內(nèi)含子形成。越來越多的研究表明它們在許多生物學過程中起著重要作用〔8〕。盡管circRNA的具體作用尚未被完全揭示,但目前研究表明,circRNA充當微小RNA(miRNA)的“分子海綿”,與miRNA通過競爭性結(jié)合相互作用,并且可以間接影響信使RNA(mRNA)下游目標基因的表達,構(gòu)建出一個復雜的調(diào)控機制〔9〕。研究表明〔10〕,尿液中circRNA在多種疾病中的表達水平會發(fā)生變化,這為circRNA作為一種新型診斷和治療方法提供了潛在機會。與其他采樣方法不同,尿液采集是一種非侵入性、非創(chuàng)傷性、無痛苦的采樣方法,非常方便和實用,可以提高疾病的早期診斷及治療的準確性和有效性〔11〕。但circRNA在膀胱癌患者尿液中的臨床診斷價值仍需探究。因此,本研究通過前期研究發(fā)現(xiàn)circRNA-0071196在膀胱癌組織中過表達,并研究circRNA-0071196在膀胱癌患者尿液中的表達及進行臨床病理特征分析,旨在探究尿液中circRNA作為膀胱癌生物標志物的潛力。

1 材料與方法

1.1實驗分組與標本處理 共采集40例膀胱尿路上皮癌尿液樣本(膀胱癌組)和30例正常樣本(對照組),均來自廣州市番禺中心醫(yī)院。膀胱癌組男27例,女13例;平均年齡(63.15±15.18)歲;對照組男16例,女14例,平均年齡(62.4±9.38)歲。兩組性別構(gòu)成及年齡無顯著差異(P>0.05)。樣本均經(jīng)過組織病理學驗證。在使用前,尿液樣本被存儲在-80 ℃的冰箱中。本研究已獲得廣州市番禺中心醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2總RNA抽提及qRT-聚合酶鏈反應(PCR) 通過Trizol法從尿液樣本中提取RNA,提取后的RNA使用 Nanodrop2000 微量紫外分光光度計檢測其濃度及純度,使用RNase R消化總RNA以去除線性RNA并富集circRNA濃度和純度后進行下一步反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄使用Super-ScriptTMⅢ Reverse Transcriptase試劑盒,按說明書要求進行操作。實時定量PCR 使用Step One Plus PCR儀,反應體系為20 μl,反應條件:以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因,circRNA-0071196相對表達量采用2-ΔΔCt進行計算。circRNA-0071196 引物序列為:上游:5′-TGCTTATAGAAGGAACAAGCAG-3′,下游:5′-TACTCATATTTGAAACCGGATCT-3′;GAPDH引物序列為:上游:5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′,下游:5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件進行學生t檢驗。采用受試者工作特征(ROC)曲線和ROC曲線下面積(AUC)對circRNA-0071196的診斷特異性和靈敏性進行評價。

2 結(jié) 果

2.1兩組尿液中circRNA-0071196表達水平差異 與對照組(1.75±1.01)比較,膀胱癌組尿液中circRNA-0071196表達水平(5.10±1.88)顯著上調(diào)(t=8.840,P<0.05)。

2.2膀胱癌患者的基本臨床特征與尿液標本中circRNA-0071196表達水平的關(guān)系 circRNA-0071196相對表達水平在性別組成、年齡、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。circRNA-0071196相對表達量與膀胱癌T分期、肌層浸潤及病理分級具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 膀胱癌患者的基本臨床病理特征與尿液標本中circRNA-0071196相對表達量比較

2.3circRNA-0071196水平檢測膀胱癌患者的敏感性和特異性 通過ROC曲線結(jié)果顯示:circRNA-0071196水平檢測能有效區(qū)分膀胱癌組和對照組〔AUC=0.935(95%CI:0.876～0.994)〕。見圖1。

圖1 尿液中circRNA-0071196對預估診斷膀胱癌的ROC曲線

3 討 論

近年來,我國膀胱癌的發(fā)病率和死亡率都呈現(xiàn)出明顯的上升趨勢。即使患者采取手術(shù)、化療、放療等治療措施,膀胱癌的復發(fā)率仍然較高,同時也致使患者的5年生存率處于較低水平〔12,13〕。針對膀胱癌患者治療和預后面臨的挑戰(zhàn),在積極探索新的治療手段和方法的同時,尋找和識別新的膀胱癌生物標志物具有重大意義。通過分析生物標志物,醫(yī)師能夠精細檢測、識別、分析患者的健康情況,為他們制定有效的治療策略,從而大大提高臨床治愈率,有利于患者的預后。目前,膀胱癌診斷主要依賴于影像學檢查方法(比如泌尿系統(tǒng)的彩色多普勒超聲檢查和增強CT掃描)、尿細胞學檢查、膀胱鏡檢及實驗室特異性標志物篩查〔14～17〕。然而,這些檢查手段在靈敏度、特異性和患者接受程度方面存在較大的不同。因此,迫切需要開發(fā)一種新型的檢查方法,能夠快速、便捷且更精確的提升對膀胱癌的診斷能力。

本文前期實驗中通過使用基因芯片技術(shù)檢測了4例膀胱癌和匹配的癌旁組織中circRNAs的表達譜,最終發(fā)現(xiàn)127個在膀胱癌及其癌旁組織中差異表達的circRNA,其中上調(diào)circRNA 89個,下調(diào)circRNA 38個。結(jié)果顯示,circRNA-0071196可能參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展〔18〕,有證據(jù)表明,circRNA的作用機制是充當“miRNA 海綿”。在這個過程中,circRNA 可能會和 miRNA 進行競爭,從而抑制 miRNA 的轉(zhuǎn)錄,阻礙 mRNA 的轉(zhuǎn)錄。一些研究已經(jīng)確定了多種能夠充當 miRNA 海綿的 circRNA,并展示了它們作為基因表達重要調(diào)節(jié)因子的潛力〔19〕。尿液circRNA是一個新的研究領(lǐng)域,由于尿液中的circRNA可以穩(wěn)定存在,并反映機體內(nèi)的病理生理變化,越來越多的研究結(jié)果顯示,它可能作為多種疾病生物標記物〔20,21〕。目前已有用于膀胱癌診斷的一些實驗室生物標志物,例如核基質(zhì)蛋白(NMP)22、膀胱腫瘤抗原(BTA)和纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP),雖已投入使用,但這些標記物的敏感性和特異性仍有待提高。據(jù)報告,NMP22的敏感性為73%,特異性為80%;而BTA的敏感性為50%,特異性為86%;FDP的敏感性為61%,特異性為79%〔22,23〕,因此,尋找一種新的液體實驗室標志物具有重要意義。由于尿液樣本的非侵入性和易于采集的特點,預示尿液circRNA作為腫瘤標志物具有廣闊應用價值。尿液circRNA已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌等多種癌癥類型中有顯著變化,因此它們可能用于癌癥早期診斷及預測腫瘤的臨床進展情況。盡管目前的研究還需要進一步驗證,但尿液circRNA可能成為未來癌癥篩查、診斷和治療領(lǐng)域中一個重要的研究方向〔24～28〕。

本實驗結(jié)果表明,尿液中circRNA-0071196的表達與膀胱癌細胞的分化程度和浸潤性生長可能存在密切聯(lián)系;ROC曲線結(jié)果表明,circRNA-0071196表達水平在膀胱癌的診斷中具有一定價值。未來可以將尿液中circRNA-0071196水平檢測納入膀胱癌診斷的實驗室指標,以更好地評估患者的病情和監(jiān)測治療效果,對于探尋新的膀胱癌候選腫瘤標志物及治療靶點具有重要意義。