張彥收 劉學良 張庚 曹淼 劉運江

(1河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院乳腺中心,河北 石家莊 050011;2滄州市人民醫(yī)院甲乳外科)

中國國家癌癥中心發(fā)布的全國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示:乳腺癌是國內(nèi)女性發(fā)病首位的惡性腫瘤,每年發(fā)病人數(shù)約為30.4萬〔1〕。當前,隨著精準化治療模式的推進和新型藥物的不斷涌現(xiàn),乳腺癌的治療效果已取得了巨大提升。然而,乳腺癌發(fā)病機制復雜,探尋乳腺癌發(fā)病、增殖和轉(zhuǎn)移關鍵基因,建立新的治療途徑和靶點對提高乳腺癌的生存率至關重要。富亮氨酸α-2糖蛋白(LRG)1是富亮氨酸重復序列(LRR)超家族蛋白成員之一,LRG1在多種惡性腫瘤中表達上調(diào),并在細胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成方面扮演著重要角色。目前國內(nèi)、外關于LRG1在乳腺癌中表達的研究報道較少。本研究通過檢測原發(fā)性乳腺癌組織中LRG1的表達,探討其與臨床病理參數(shù)的關系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 收集2019年1～6月河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院乳腺中心收治的125例原發(fā)性乳腺癌患者石蠟包埋組織標本及臨床病理資料,均為女性,中位年齡50歲;組織切片包括乳腺癌組織及癌旁組織。納入標準:(1)經(jīng)病理診斷確診為浸潤性乳腺癌;(2)均接受手術治療(保乳或乳房切除術),腋窩接受前哨淋巴結(jié)活檢或淋巴結(jié)清掃。(3)術前未接受過放、化療及內(nèi)分泌治療。排除標準:(1)合并其他惡性腫瘤;(2)初診有遠處轉(zhuǎn)移;(3)復發(fā)轉(zhuǎn)移性乳腺癌。(4)病理檢查結(jié)果為乳腺導管上皮重度不典型增生和導管原位癌。本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院倫理委員會批準,患者均已知情同意。

1.2免疫組織化學染色方法 所有組織標本中LRG1蛋白的表達均由醫(yī)院病理科醫(yī)師采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)法進行檢測,具體操作步驟如下:石蠟切片脫蠟、乙醇脫水;加3% H2O237 ℃下孵育10 min,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性;磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次×5 min;行抗原修復,山羊血清孵育,加LRG1抗體(1∶200)、4 ℃下孵育過夜;PBS沖洗3次×5 min;加生物素標記,37 ℃下孵育20 min;PBS沖洗3次×5 min;加辣根過氧化物酶標記,37 ℃下孵育30 min;PBS沖洗3次×5 min;加新配制的DAB 顯色,蘇木素復染10 s,PBS反藍,脫水、透明、封片。PBS 替代一抗作為陰性對照。

1.3結(jié)果判讀 兩位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師,采用雙盲法對免疫組化結(jié)果進行判讀。LRG1著色部位主要為胞膜和胞質(zhì),陽性信號表現(xiàn)為褐色顆粒狀外觀。在病灶處隨機選取10個高倍視野,每個視野計數(shù)100個細胞。半定量分析LRG1呈陽性的癌細胞在所觀察細胞中的百分比和染色強度。染色百分比為:陽性細胞數(shù)<5%=0分,5%～25%=1分,26%～50%=2分,≥51%=3分。染色強度分為:無染色=0分,輕度染色=1分,中度染色=2分,重度染色=3分。然后,根據(jù)染色強度與陽性細胞比率評分的乘積,確定每個標本的染色評分:≥3分為陽性,<3分為陰性。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1LRG1在腫瘤組織及正常乳腺組織中的表達情況 在125例原發(fā)性乳腺癌患者中,59.2%(74/125例)患者LRG1呈陽性表達。LRG1著色部位主要位于胞膜和胞質(zhì),陽性信號表現(xiàn)為褐色顆粒狀外觀,見圖1。乳腺癌組織中LRG1表達高于癌旁組織〔36.7%(46/125)〕,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.96,P=0.04)。

圖1 LRG1 在乳腺癌組織中表達(×200)

2.2LRG1表達與臨床病理參數(shù)的關系 不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期患者LRG1陽性表達差異顯著(P<0.01,P<0.05)。未發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中LRG1蛋白陽性表達與患者年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤直徑、組織學分級、乳腺癌分型的相關性(P>0.05)。見表1。

表1 乳腺癌組織中LRG1陽性表達與臨床病理參數(shù)的關系(n)

3 討 論

LRG1是最早被發(fā)現(xiàn)的含有LRR結(jié)構的蛋白。早期研究認為LRG1可能是中性粒細胞早期分化的一種標志物〔2〕。近些年研究顯示LRG1在人類多種惡性腫瘤組織、血液、腦脊液、外泌體中異常表達,并且可以作為部分腫瘤早期診斷和預后判斷的生物標記物。LRG1可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和異常血管生成過程中扮演重要角色。

LRG1在健康人視網(wǎng)膜新生血管中表達水平較高,在其他正常組織如乳房、皮膚和胃腸道組織中呈現(xiàn)弱的不完全表達〔3〕。目前多項報道LRG1在惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)表達上調(diào)。在239例胃癌患者中,44%的患者LRG1呈現(xiàn)高表達〔4〕;在肝癌患者中,LRG1的表達水平為85.8%(667/777)〔5〕。此外,在胰腺癌和非小細胞肺癌中,同樣發(fā)現(xiàn)LRG1表達水平的升高〔6,7〕?；诎┌Y基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)錄組測序技術(RNA-seq)測序結(jié)果,使用基因表達譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析(GEPIA)數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)〔8〕分析TCGA中1 085例乳腺浸潤性癌和112例正常乳腺組織的數(shù)據(jù),結(jié)果顯示LRG1 mRNA在乳腺癌組織中表達明顯高于正常乳腺組織。分析Breast Cancer Gene-Expression Miner數(shù)據(jù)庫〔9〕中乳腺癌資料,LRG1 mRNA表達在不同激素受體狀態(tài)和HER-2表達中存在顯著差異,雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)均陽性患者LRG1 mRNA表達顯著高于ER、PR均陰性組;HER-2陰性組LRG1 mRNA表達高于HER-2過表達組。本研究結(jié)果證明,LRG1蛋白在浸潤性乳腺癌組織的表達與LRG1 mRNA表達情況一致。但在不同分子亞型中未發(fā)現(xiàn)LRG1蛋白表達差異性,可能與本研究中納入HER-2陽性型和三陰性乳腺癌標本例數(shù)較少有關,可進一步擴大樣本量進行驗證。

目前研究顯示,LRG1不僅在惡性腫瘤組織中異常表達,且與惡性腫瘤的進展相關。于菁等〔10〕發(fā)現(xiàn),乳酸脫氫酶(LDH)、LRG1及β2-微球蛋白(MG)在腫瘤分期晚、存在淋巴結(jié)結(jié)外侵犯及骨髓受累的彌漫大B細胞淋巴瘤患者血清中表達水平異常升高,血清中LRG1水平是影響彌漫大B胞淋巴瘤復發(fā)的獨立危險因素。先前的研究也證實,LRG1蛋白的表達是影響乳腺癌無疾病生存期(DFS)、總生存期(OS)的獨立危險因素,LRG1表達水平與DFS、OS呈負相關〔11〕。梁棟等〔12〕研究顯示,LRG1 mRNA表達還與子宮內(nèi)膜癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移和臨床分期有關。Sun等〔13〕研究了結(jié)直腸癌組織中LRG1的表達與臨床病理相關指標的關系,結(jié)果顯示,LRG1蛋白的表達與血管微密度、腫瘤分期、組織分化和脈管浸潤等病理參數(shù)顯著相關。在胃癌研究中,有學者發(fā)現(xiàn)LRG1在胃癌組織中的表達與組織學類型、脈管浸潤、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及疾病分期顯著相關,抑制LRG1的表達可以降低體外胃癌細胞的遷移和侵襲〔14〕。進一步分析Breast Cancer Gene-Expression Miner數(shù)據(jù)庫〔9〕中乳腺癌資料發(fā)現(xiàn),LRG1在1 525例淋巴結(jié)陽性患者中的表達高于2 345例淋巴結(jié)陰性組。本研究同樣發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中LRG1蛋白的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)、病理TNM分期顯著相關,LRG1表達可能反映了疾病的進展。

LRG1主要通過轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β信號通路作用于血管生成、EMT和細胞凋亡的調(diào)控機制,影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔15,16〕。Wang等〔17〕在小鼠視網(wǎng)膜疾病模型的研究中發(fā)現(xiàn)LRG1可能通過TGF-β1信號途徑發(fā)揮促腫瘤血管生成作用。在TGF-β1存在時,LRG1可以與內(nèi)皮糖蛋白相互作用,激活TGF-β1/活化素受體樣激酶(ALK)1信號通路引起致病性血管生成。在非小細胞肺癌研究中發(fā)現(xiàn)細胞外泌體中富含LRG1蛋白,來自患者樣品或癌細胞外泌體可以顯著增加人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)中血管生成標記物血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)A和血管生成素(Ang)1的表達,并增強HUVEC的成管能力〔18〕。其他研究還表明LRG1參與了誘導EMT過程,并可促進結(jié)直腸癌細胞中VEGFA表達,促進腫瘤血管生成。此外,LRG1還可以通過以濃度和時間依賴性方式誘導缺氧誘導因子(HIF)-1促進血管生成〔19〕。證據(jù)表明通過調(diào)節(jié) LRG1抑制腫瘤遷移、侵襲具有很高的潛在臨床價值〔20,21〕。而針對LRG1作為新的抗體藥物耦聯(lián)物(ADC)靶點藥物,已證實在細胞外與標準化療相比具有相似的抗腫瘤活性〔22〕,LRG1在未來抗腫瘤領域可能作為新的治療靶點。

綜上,LRG1在浸潤性乳腺癌組織表達上調(diào),并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)、病理TNM分期相關。LRG1可能在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵作用,通過進一步機制的進一步探索,可能為將來乳腺癌的診斷和治療提供新的思路。