吳翠翠 張雪琦 吳志堅

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科,吉林 吉林 132011)

甲狀腺乳頭狀癌(PTC)的發(fā)病率呈逐年增加趨勢,尤其是發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后其生存期更短,這主要因為發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移后腫瘤更易侵犯甲狀腺外血管和器官及與自身因素密切相關(guān)〔1〕。微小RNA(miR)在多種腫瘤中均有異常表達,在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和腫瘤發(fā)展方面起重要作用,包括生長、轉(zhuǎn)移和凋亡。既往研究表明,miR-145在大多數(shù)腫瘤組織中均呈低表達,發(fā)揮抑癌基因的作用。蘭天等〔2〕通過體內(nèi)、體外實驗研究證實,miR-145-5p在甲狀腺癌細胞中低表達,miR-145-5p過表達可顯著降低甲狀腺癌細胞的遷移和侵襲能力,并降低裸鼠體內(nèi)移植瘤的體積和重量,表明miR-145的異常表達有望作為PTC進展的生物標(biāo)志物,但目前尚缺乏miR-145在人PCT組織中表達的報道。本文擬分析miR-145在PTC組織中的表達情況及其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2021年12月在北華大學(xué)附屬醫(yī)院甲狀腺外科進行手術(shù)后經(jīng)病理確診為PTC患者64例,平均年齡(59.4±5.6)歲,伴頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者23例。

1.2組織標(biāo)本的采集與處理 患者行全身麻醉或局部麻醉后,依據(jù)腫瘤發(fā)生部位、病變范圍、類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況行針對性手術(shù)治療。手術(shù)切除組織離體后,取部分癌組織和距癌組織邊緣3 cm處癌旁組織,用焦碳酸二乙酯(DEPC)-磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后迅速置于液氮中保存?zhèn)溆谩２樵儾±畔⒐芾硐到y(tǒng),詳細了解并記錄患者年齡、性別、腫瘤直徑及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等基本信息。

1.3主要儀器與試劑 Applied Biosystems 7500 Fast逆轉(zhuǎn)錄-熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)儀購自美國ABI公司,RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司,RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒購自美國Life Technologies公司,FS Universal SYBR Green Master實時熒光定量PCR試劑購自瑞士羅氏公司。根據(jù)NCBI GeneBank數(shù)據(jù)庫及Primer6.0設(shè)計引物,miR-145-5p-RT引物:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-CGGCAATTCAGTTGAG-AGGGAT-3′,miR-145-5p正向引物:5′-ACACTCC-AGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3′,反向:5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。U6正向引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向:5′-AACGCTTCACGAAT-TTGCGT-3′,引物由蘇州吉瑪基因公司合成。

1.4RT-qPCR法檢測甲狀腺癌組織及癌旁組織中miR-145水平 將收集的組織從液氮中取出,剪碎后取適量體積的組織置于研磨器中研磨成粉末,加入1 ml Trizol充分混合,裂解15 min。依次加入氯仿、異丙醇、80%乙醇洗脫純化析出,超微量分光光度計檢測RNA濃度及純度,脂凝膠電泳成像檢測RNA完整性。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA保存于-20 ℃冰箱中。取2 μl cDNA作為模板配制25 ml RT-qPCR體系,按照FS Universal SYBR Green Master說明書,以U6為內(nèi)參,在Applied Biosystems 7500 Fast實時熒光定量PCR儀上進行PCR。反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 5 min,擴增步驟95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,共40個循環(huán),擴增結(jié)束后繪制溶解曲線,根據(jù)2-ΔΔCt方法計算各組miR-145-5p表達水平差異。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、非參數(shù)檢驗、Kaplanmeier法及Logrank檢驗。通過非條件單因素和多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析影響PTC患者預(yù)后的相關(guān)因素。

2 結(jié) 果

2.1PTC及其癌旁組織中miR-145相對表達量比較 PTC組織中miR-145的相對表達量(0.437±0.099)顯著低于癌旁組織(1.076±0.216;t=-21.333,P<0.001)。

2.2PTC患者甲狀腺癌組織miR-145表達與臨床病理特征的關(guān)系 甲狀腺癌組織中miR-145表達水平與患者年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤部位及病灶情況無顯著相關(guān)性(P>0.05),與病理分級、UICC分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性(P<0.05,P<0.01),見表1。

表1 甲狀腺癌組織中miR-145的表達與患者臨床病理特征的關(guān)系及影響PTC患者預(yù)后的影響因素〔n(%)〕

2.3PTC患者預(yù)后生存情況 PTC患者自出院后隨訪8～62個月,中位時間686 d,生存分析結(jié)果表明,miR-145高表達(≥0.448)和低表達(<0.448)患者5年總生存率分別為93.75%(30/32)和81.25%(24/32),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.267,P=0.039)。Kaplan-meier生存分析結(jié)果顯示,低表達miR-145患者與高表達患者相比預(yù)后較差,具有顯著差異(P<0.05),見圖1。

圖1 不同miR-145表達PTC患者生存分析

2.4影響PTC患者預(yù)后的危險因素 經(jīng)單因素分析得出,腫瘤直徑越大、病理分級越高、分期越晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及miR-145低表達時,患者5年生存率越低(P<0.05,P<0.01),見表1。

2.5影響PTC患者預(yù)后的獨立危險因素 經(jīng)多因素Cox 比例風(fēng)險回歸模型分析得出,Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及miR-145低表達均為PTC患者預(yù)后的獨立危險因素(P<0.05,P<0.01),見表2。

表2 影響PTC患者預(yù)后的COX多因素分析

3 討 論

miRNA是一類短小的非編碼RNA分子,可以通過調(diào)節(jié)基因表達來參與細胞的生物學(xué)過程。研究表明,miRNA在PTC的發(fā)生和發(fā)展中起到重要調(diào)控作用〔3～6〕。miR-146b、miR-221和miR-222等miRNA的表達水平在PTC中顯著上調(diào),而miR-181b和miR-21等miRNA的表達水平則下調(diào),這些miRNA的異常表達可能與PTC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)〔7〕。研究發(fā)現(xiàn),miR-146b的上調(diào)與PTC的增殖和侵襲能力增強有關(guān)〔8〕,而miR-221和miR-222的上調(diào)則與PTC的預(yù)后不良和復(fù)發(fā)有關(guān)〔9〕。另外,miR-181b和miR-21的下調(diào)可能會促進PTC的細胞增殖和侵襲〔10〕。

miRNA可以作為PTC的潛在生物標(biāo)志物,用于診斷、預(yù)后評估和治療監(jiān)測。研究表明,特定miRNA的表達模式可以用于區(qū)分PTC和甲狀腺良性病變,為臨床診斷提供了新手段〔11～13〕。此外,一些miRNA也被發(fā)現(xiàn)與PTC的預(yù)后相關(guān),可以作為預(yù)后評估的潛在標(biāo)志物〔14～16〕。PTC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其預(yù)后評估中的重要指標(biāo)之一。研究表明,PTC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是其常見的臨床特征之一〔17,18〕。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的存在與PTC的預(yù)后密切相關(guān),可以影響患者生存率和疾病復(fù)發(fā)率。一般來說,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的程度越大,預(yù)后越差〔19〕。研究還發(fā)現(xiàn),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)量、大小和位置對于預(yù)后的評估具有重要意義〔20〕。近年來,有研究發(fā)現(xiàn),一些基因突變和表達異常與PTC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)〔21～23〕。此外,一些長鏈非編碼(lnc)RNA或環(huán)狀RNA也可以通過靶向某些miRNA的表達,進而影響PTC增殖、遷移和侵襲,促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和改變患者預(yù)后〔24～26〕。

miR-145作為一種重要的調(diào)控分子,參與了多種生物學(xué)過程的調(diào)節(jié),包括細胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移等。在PTC中,miR-145下調(diào)可能與腫瘤的惡性程度和預(yù)后有關(guān)。本研究表明,miR-145可能與PTC的惡性程度及病情嚴重程度有關(guān),且可能在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了一定調(diào)控作用。此外,本研究還提示miR-145可能作為一個潛在的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點,有助于指導(dǎo)PTC患者的治療策略和預(yù)后評估。然而,本研究還存在一些限制:首先,本研究是基于單一中心的回顧性研究,可能存在選擇偏倚;其次,本文樣本量相對較小,需要進一步擴大樣本量以驗證。