包歡歡,王修俊,*,于沛,何春霞,李佳敏,許九紅, 馮廷萃,吳擁軍

1(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院,貴州 貴陽,550025)2(貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽,550025) 3(貴州大學(xué) 辣椒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,貴州 貴陽,550025)4(鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣名城食品廠,貴州 鎮(zhèn)遠(yuǎn),557700)

三穗鴨蛋具有營(yíng)養(yǎng)豐富的特點(diǎn),其制成咸鴨蛋后具有松沙出油和口感鮮香的特點(diǎn)[1-2]。蛋黃是三穗咸鴨蛋的品質(zhì)體現(xiàn)與價(jià)值所在,因此常被應(yīng)用于月餅和粽子等食品的餡料中[3-4]。目前,三穗咸鴨蛋的腌制方式主要有鹽水浸泡法和鹽泥涂抹法[5-6],但這2種方式的產(chǎn)品都存在蛋清鹽含量高的問題,從而導(dǎo)致口感過咸。為解決這個(gè)問題,本研究團(tuán)隊(duì)利用兩段式鹽水浸泡法,將蛋清鹽含量控制在3.65%左右,且蛋黃出油量保持在68.82%左右,在保證咸蛋品質(zhì)良好的同時(shí)改善了口感[7]。

三穗鴨蛋黃和市售鴨蛋相似,其腥味較雞蛋更重,不適于鮮食。鹽水的腌制,能在一定程度上降低三穗鴨蛋黃的腥味,同時(shí)給予其特殊的香味[8]。腌制過程中,NaCl的滲透會(huì)引起蛋黃內(nèi)脂肪酸等物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng),進(jìn)而使咸蛋黃的風(fēng)味發(fā)生變化,同時(shí)蛋黃的色澤、口感和質(zhì)構(gòu)等理化指標(biāo)也會(huì)發(fā)生變化[9-12]。有研究報(bào)道腌制過程中蛋黃理化性質(zhì)的變化和品質(zhì)的變化之間具有較強(qiáng)的相關(guān)性,AI等[13]研究指出咸蛋在腌制過程中,NaCl會(huì)引起蛋黃蛋白質(zhì)分子間作用力的變化,導(dǎo)致蛋白質(zhì)三、四級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而形成凝膠。DOU等[14]研究發(fā)現(xiàn)在NaCl的滲透作用下,蛋黃內(nèi)部分脂質(zhì)游離出來,在O2的參與下脂肪酸的組成發(fā)生改變,從而形成蛋黃“出油”的特性。然而,咸鴨蛋腌制過程中蛋黃的揮發(fā)性成分的變化規(guī)律尚未清晰。此外,三穗鴨蛋與其他鴨蛋在營(yíng)養(yǎng)成分和揮發(fā)性物質(zhì)組成上均存在差異,導(dǎo)致腌制中蛋黃揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化規(guī)律更為復(fù)雜,但目前關(guān)于三穗咸鴨蛋的風(fēng)味物質(zhì)變化等方面的理論研究鮮有報(bào)道。因此以三穗鴨蛋黃為對(duì)象,研究?jī)啥问诫缰七^程中蛋黃揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化規(guī)律十分必要。

本研究以本課題組研制的兩段式腌制為基礎(chǔ),采用GC-MS對(duì)腌制過程中蛋黃的揮發(fā)性成分進(jìn)行定性和定量分析,探究咸蛋黃腌制過程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化規(guī)律。利用正交偏最小二乘法預(yù)測(cè)不同腌制階段的咸蛋黃在揮發(fā)性物質(zhì)組成上的差異,并對(duì)咸蛋黃風(fēng)味差異有主要貢獻(xiàn)作用的物質(zhì)進(jìn)行篩選,旨在探究?jī)啥问诫缰乒に囅?三穗咸鴨蛋蛋黃的揮發(fā)性風(fēng)味變化,從而為三穗咸鴨蛋的兩段式腌制技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三穗麻鴨蛋、食鹽、紅星二鍋頭,購買于貴陽市花溪區(qū)合力超市。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2002B型分析天平,上海越平科學(xué)儀器有限公司;GZX-GF101-3-BS-Ⅱ型電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海賀德試驗(yàn)設(shè)備有限公司;50/30umCAR/PDMS/DVB型手動(dòng)固相微萃取裝置,美國Supelco公司;SCIONSQ-456-GC型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國布魯克公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 咸蛋黃的制備

咸蛋腌制液配制:第一階段腌制液為25%的食鹽溶液;第二階段腌制液為食鹽10%、香辛料0.6%、白酒0.7%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)),工藝流程如下:

三穗麻鴨蛋→洗凈晾干→第一階段腌制8 d→取出晾干→第二階段腌制20 d

1.3.2 樣品預(yù)處理和揮發(fā)性風(fēng)味成分測(cè)定

取搗碎均勻的5.0 g咸蛋黃樣品置于20 mL頂空瓶中,將老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭插入樣品瓶頂空部分,于60 ℃吸附30 min,吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進(jìn)樣口,于250 ℃熱解析3 min,同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

GC條件:色譜柱為DB-Wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管柱;載氣為高純He(99.999%);恒流,載氣流速1.0 mL/min;升溫程序,初始40 ℃,保持3 min,10 ℃/min升溫至230 ℃,保持5 min;汽化室溫度250 ℃。

MS條件:離子源為EI源;發(fā)射電流1.0 mA;電子能量70 eV;界面溫度250 ℃;離子源溫度200 ℃;檢測(cè)電壓2 000 V。

1.3.3 咸蛋黃揮發(fā)性成分的定量與定性

對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對(duì)NIST14和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖,結(jié)合保留指數(shù)(retention index, RI值)為定性依據(jù),確定揮發(fā)性化學(xué)成分的種類;用峰面積歸一化法測(cè)定各化學(xué)成分的相對(duì)含量。

1.3.4 正交偏最小二乘法判別分析

將不同腌制階段的蛋黃揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis, OPLS-DA),利用解釋變量(R2Y)和預(yù)測(cè)能力(Q2Y)驗(yàn)證模型的有效性,同時(shí)驗(yàn)證模型是否存在過擬合現(xiàn)象。

1.3.5 潛在差異物質(zhì)的篩選和鑒定

根據(jù)OPLS-DA模型中的投影變量重要性因子(variable importance in projection,VIP),即VIP值篩選潛在的差異特征物質(zhì)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Excel 2019整理數(shù)據(jù),Origin 2018、SIMCA 14.1 和TBtools軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 腌制過程中咸鴨蛋蛋黃揮發(fā)性風(fēng)味成分組成

圖1為腌制過程中鴨蛋黃的總離子流圖(total ion chromatogram,TIC),表1和圖2為蛋黃中具體的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及其相對(duì)含量的變化圖。由圖1可知,鮮蛋黃中檢出31種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),腌制7和14 d的蛋黃檢出36種,腌制21 d的蛋黃檢出37種,腌制28 d的蛋黃檢出42種,說明隨著NaCl的滲入,蛋黃的風(fēng)味發(fā)生了顯著的變化。

圖1 腌制過程中蛋黃的總離子流圖Fig.1 TIC for fresh duck egg yolk

由表1可知,腌制過程中蛋黃醛類物質(zhì)的種類最為豐富,共有14種,其中3-苯基-2-丙烯醛、(E)-2-庚烯醛和對(duì)甲氧基苯醛3種物質(zhì)在鮮蛋黃中未檢出,而鮮蛋黃中(Z)-2-庚烯醛在鹽水腌制的作用下消失。由圖2可知,在腌制前14 d醛類物質(zhì)含量升高速率較快,可能原因之一是NaCl的滲透促進(jìn)了蛋黃中不飽和脂肪酸的氧化分解作用和氨基酸的Strecker降解,從而生成較多的醛類物質(zhì)[15-16]。另一方面,腌制液中所添加的香辛料也對(duì)醛類等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生影響。

烷烯烴類物質(zhì)主要來源于脂肪酸烷氧自由基的均裂,烷烴類物質(zhì)感覺閾值較高,一般認(rèn)為對(duì)食品的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)較小[17-18]。表1展示了腌制過程中共檢測(cè)出的9種烷烯烴類物質(zhì),由表1可知,鮮蛋黃中烷烯烴類物質(zhì)相對(duì)含量最高(39.949%),隨著腌制時(shí)間的延長(zhǎng),其相對(duì)含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),最終降低至23.159%。腌制過程中烷烯烴類物質(zhì)相對(duì)含量的降低是食鹽的滲透作用導(dǎo)致的,這與吳涵等[19]關(guān)于腌制對(duì)魚肉風(fēng)味物質(zhì)的影響的研究結(jié)果相似。另外,茴香烯在鮮蛋黃中未檢出,而在腌制的蛋黃中出現(xiàn),并且其相對(duì)含量隨腌制時(shí)間的延長(zhǎng)呈升高的趨勢(shì),因茴香烯主要存在于香辛料中[20],故判斷咸蛋黃中茴香烯相對(duì)含量的升高來源于腌制中所添加的香辛料。

醇類物質(zhì)一般是由脂肪氧化分解或羰基化合物還原而生成的,其風(fēng)味閾值較高,對(duì)食品的風(fēng)味影響較小[21-22]。從表中可以看出,腌制7 d后,蛋黃中醇類化合物相對(duì)含量由10.642%增加至16.91%,之后的7 d其相對(duì)含量又降低至9.509%,并在腌制后半段(14～28 d)未有明顯變化,相對(duì)含量維持在10%左右。分析其原因,可能是由于腌制第一階段中腌制液的鹽濃度較高,高滲透壓促進(jìn)了體系內(nèi)脂肪氧化分解和羰基化合物還原,從而使醇類物質(zhì)迅速提高。而腌制第二階段中體系內(nèi)滲透壓發(fā)生變化,抑制了醇類物質(zhì)的生成而促進(jìn)了其他反應(yīng)的發(fā)生,已生成的醇類化合物又被轉(zhuǎn)化為其他揮發(fā)性物質(zhì)[23-24]。

酮類物質(zhì)是脂肪氧化的另一主要產(chǎn)物,酮類物質(zhì)具有特別的清香和花香風(fēng)味,且呈味較持久[25]。由表1和圖2可知,酮類物質(zhì)相對(duì)含量較低,在腌制前7 d呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),而在腌制14～28 d呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。另外僅在腌制21 d與28 d后的咸鴨蛋黃中檢測(cè)出2-壬酮,相對(duì)含量分別為0.366%和0.269%。

由表1可知,蛋黃中酯類和醚類化合物種類較少。在整個(gè)腌制過程中僅檢測(cè)出3-丁烯基異硫氰酸酯和丙酸丁酯2種酯類化合物。隨著腌制液的滲入,蛋黃中3-丁烯基異硫氰酸酯的相對(duì)含量由3.425%降低至0.269%,而丙酸丁酯在鹽水腌制的作用下消失。蛋黃中醚類化合物也會(huì)受到NaCl的影響,其中二甲基三硫醚隨腌制時(shí)間延長(zhǎng)呈先升高后降低的趨勢(shì),而二丁醚只在腌制后期(21～28 d)被檢測(cè)出,其相對(duì)含量在0.185%～0.249%范圍之間。1,3-二氯苯和乙苯等芳香族化合物也參與了咸鴨蛋黃風(fēng)味的形成,在腌制過程中,蛋黃芳香族揮發(fā)性物質(zhì)含量呈先升高后降低的趨勢(shì),這與醇類物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果相類似。余平蓮[26]研究指出咸蛋黃中1,3-二氯苯等物質(zhì)的生成來自膽固醇的氧化,較高濃度的NaCl能夠抑制這一氧化反應(yīng),因此芳香族類化合物的相對(duì)含量在腌制后期逐漸下降。

a-相對(duì)含量;b-種類數(shù)圖2 咸蛋黃腌制過程中風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量變化Fig.2 Change of flavor substance categories in salted egg yolk curing process

2.2 基于正交偏最小二乘法的咸蛋黃風(fēng)味差異分析

OPLS-DA是一種有監(jiān)督的邏輯回歸模型,該模型能夠較為準(zhǔn)確地體現(xiàn)各個(gè)樣品之間的差異,并按照差異物質(zhì)的相關(guān)性將樣品進(jìn)行分類。投影變量重要性因子是OPLS-DA中的重要參數(shù)之一,它可量化OPLS-DA中每個(gè)變量對(duì)樣本分類的貢獻(xiàn)度,從而有助于篩選潛在的差異特征物質(zhì)。VIP值>1說明該物質(zhì)對(duì)咸蛋黃的風(fēng)味差異有主要的貢獻(xiàn)作用,VIP值越大說明該物質(zhì)在樣品間的差異越顯著[27-29]。

本試驗(yàn)將所測(cè)咸蛋黃揮發(fā)性成分的相對(duì)含量進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析,旨在對(duì)不同腌制階段的咸蛋黃揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成進(jìn)行差異性分析。該模型中,解釋變量(R2Y)和預(yù)測(cè)能力(Q2Y)分別為0.99和0.96,說明該模型對(duì)咸蛋黃的差異性風(fēng)味物質(zhì)的預(yù)測(cè)和篩選是有效的,下面將對(duì)OPLS-DA結(jié)果進(jìn)行分析和討論。

2.2.1 不同腌制階段蛋黃揮發(fā)性物質(zhì)的差異性分析

由圖3可知,不同腌制時(shí)期的咸蛋黃在揮發(fā)性組分上存在組間差異,且組內(nèi)樣本的一致性較好。在X軸上,未腌制的和鹽水腌制的咸蛋黃之間存在顯著的差異,說明鹽水的滲透能夠使咸蛋黃的揮發(fā)性成分發(fā)生較大的變化。在Y軸上,腌制7 d與14 d的咸蛋黃揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量差異較小,而腌制14、21和28 d咸蛋黃的揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量差異顯著,由此可將咸蛋黃的揮發(fā)性成分組成變化大致分為0～14 d、14～21 d和21～28 d 3個(gè)階段。

圖3 不同階段的蛋黃OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA score of egg yolk at different stages

2.2.2 不同腌制階段蛋黃的潛在差異風(fēng)味物質(zhì)分析

如圖4所示,紅色標(biāo)記的物質(zhì)為篩選出的VIP值>1的物質(zhì),包括3-辛烯-2-醇、3-苯基-2-丙烯醛、苯乙醇、3-辛酮、對(duì)甲氧基苯醛、1,3-二氯苯、2,5-二甲基吡嗪、十三烷、(E)-2-庚烯醛、反-2-辛烯醛、5,6-十一碳二烯、間二甲苯、苯并吡咯、2-正戊基呋喃、對(duì)二甲苯、甲基肼、乙苯、苯甲醛、正己醇、二丁醚、正庚醇、3-丁烯基異硫氰酸酯、磺?；淄?、丙酸丁酯、(Z)-2-庚烯醛、正十七烷等26種揮發(fā)性物質(zhì)。其中3-辛烯-2-醇(VIP=1.205)、3-苯基-2-丙烯醛(VIP=1.202)、苯乙醇(VIP=1.163)、3-辛酮(VIP=1.144)、對(duì)甲氧基苯醛(VIP=1.136)、1,3-二氯苯(VIP=1.119)、2,5-二甲基吡嗪(VIP=1.084)等物質(zhì)VIP值相對(duì)較大,推測(cè)可能是影響咸蛋黃香味差異的重要揮發(fā)性物質(zhì)。

圖4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)VIP值Fig.4 VIP value of volatile flavor substances

2.2.3 蛋黃差異風(fēng)味物質(zhì)的層次聚類分析

為了直觀地體現(xiàn)各腌制階段咸蛋黃揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)特征的差異,將OPLS-DA篩選出的27種揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行層次聚類分析,并利用熱圖進(jìn)行展示。如圖5所示,顏色表示各物質(zhì)相對(duì)含量的高低,藍(lán)色越深表示其相對(duì)含量越低,紅色越深表示其相對(duì)含量越高。從圖中可以看出,5個(gè)腌制階段的咸蛋黃可按照其揮發(fā)性物質(zhì)組成的差異分為2類,第一類是未腌制的咸蛋黃(0 d),第二類是腌制7 d至28 d的咸蛋黃,這與2.2.1節(jié)中OPLS-DA分析的結(jié)果相類似。腌制結(jié)束后,5,6-十一碳二烯、正庚醇、3-辛酮、反-2-辛烯醛、(E)-2-庚烯醛、苯甲醛、(Z)-1-丁烯醛、己醛和2,5-二甲基吡嗪的相對(duì)含量較高。其中3-辛酮、反-2-辛烯醛、(E)-2-庚烯醛、(Z)-1-丁烯醛、己醛和2,5-二甲基吡嗪香氣閾值較低,對(duì)咸蛋黃的風(fēng)味影響較大,并賦予了咸蛋黃苦杏仁、青草、柑橘、油脂香、水果香和花香等多種風(fēng)味[30-31]。其他閾值較大且相對(duì)含量在腌制中呈上升趨勢(shì)的揮發(fā)性物質(zhì)作為香氣前體物質(zhì)或助香物質(zhì),與主要的風(fēng)味物質(zhì)協(xié)調(diào)而形成咸蛋黃的風(fēng)味特征。對(duì)二甲苯、乙苯、甲基肼、正十七烷、3-丁烯基異硫氰酸酯、磺酰基二甲烷、(Z)-2-庚烯醛和丙酸丁酯等物質(zhì)在鮮蛋黃中相對(duì)含量較高,而在腌制過程中相對(duì)含量較低,由此推測(cè)是蛋黃呈腥味的重要物質(zhì)。

圖5 不同腌制階段咸蛋黃的差異風(fēng)味物質(zhì)聚類分析熱圖Fig.5 Heat map of cluster analysis of differential flavor substances of salted egg yolk at different curing stages

3 結(jié)論

GC-MS檢測(cè)結(jié)果表明在兩段式腌制過程中,三穗鴨蛋蛋黃的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量會(huì)發(fā)生顯著變化。經(jīng)過腌制,蛋黃的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類顯著增多,由鮮蛋黃的31種到腌制結(jié)束后的42種,其中對(duì)咸蛋黃風(fēng)味影響較大的有醛、醇、酮、酯、芳香族、烷烯烴等6類揮發(fā)性物質(zhì)。在腌制液中添加香辛料能夠使蛋黃內(nèi)茴香烯等揮發(fā)性物質(zhì)的含量顯著提高,并賦予咸蛋黃特殊的香味。OPLS-DA和聚類分析的結(jié)果說明NaCl能顯著改變鴨蛋黃的揮發(fā)性成分的組成,并且隨著蛋黃內(nèi)鹽濃度的提高,各腌制時(shí)期的蛋黃揮發(fā)性組分的差異越顯著。蛋黃中3-辛烯-2-醇、3-苯基-2-丙烯醛、苯乙醇、3-辛酮、對(duì)甲氧基苯醛、1,3-二氯苯、2,5-二甲基吡嗪等物質(zhì)的VIP值相對(duì)較大,是影響咸蛋黃特征風(fēng)味差異的重要揮發(fā)性物質(zhì)。此外,對(duì)二甲苯、乙苯、甲基肼、正十七烷、3-丁烯基異硫氰酸酯、磺?；淄?、(Z)-2-庚烯醛和丙酸丁酯等8種VIP值>1的物質(zhì),在未腌制的鴨蛋黃中相對(duì)含量較高,在腌制過程中相對(duì)含量較低,推測(cè)是貢獻(xiàn)蛋黃腥味的潛在物質(zhì)。