趙雅平,解新安,李雁,李璐

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,廣東 廣州,510642)

姜黃素類脂溶性生物活性物質(zhì)有很強(qiáng)的生理活性,但由于它們自身結(jié)構(gòu)的疏水性,基本不溶于水且穩(wěn)定性很差,導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制[1-2]。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(nanostructure lipid carriers,NLC)是在固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanopaticals,SLN)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一種具有特殊結(jié)構(gòu)的納米脂質(zhì)載體[3]。它在制備中使用液體脂質(zhì)和固體脂質(zhì)組成混合脂質(zhì)作為油相,易形成不完美晶形,從而有負(fù)載率高、穩(wěn)定性好及能夠控制活性物質(zhì)釋放等突出優(yōu)點(diǎn)[4]?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn),目前NLC作為一種負(fù)載生物活性物質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)的脂質(zhì)載體在食品、醫(yī)藥、化妝品等方面都有廣泛的應(yīng)用[5]。在NLC制備中,生物活性物質(zhì)與載體原料及載體原料之間的相容性是影響體系穩(wěn)定性和負(fù)載率的關(guān)鍵因素?；诖?近年來有很多的研究致力于NLC的工藝優(yōu)化,通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)等篩選優(yōu)化實(shí)驗(yàn)材料,使用差示掃描量熱(differential scanning calorimetry,DSC)、傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)等方法對其相容性進(jìn)行研究[6]。熊文慧[7]探究了番茄紅素的配方組成,得到了番茄紅素-單硬脂酸甘油酯-牡丹籽油-酪蛋白酸鈉的納米脂質(zhì)體系,包封率高達(dá)(99.76±0.14)%,且穩(wěn)定性較好,通過DSC和FTIR也表明番茄紅素可以很好地包埋在這個(gè)體系中。ARAUJO等[8]探究了固體脂質(zhì)與液體脂質(zhì)的比例對NLC結(jié)構(gòu)的影響,使用2種不同的液體脂質(zhì)探究與固體脂質(zhì)的相容性,從而篩選出較優(yōu)的液體脂質(zhì),并且證明在體系中加入表面活性劑吐溫-80利于形成更小的結(jié)構(gòu)。但是這種實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方法既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力,對實(shí)驗(yàn)結(jié)果也很難預(yù)測。因此,找到可以快速篩選材料種類以及配方配比的方法尤為重要。

分子模擬技術(shù)不僅能夠觀察到實(shí)驗(yàn)可能產(chǎn)生的現(xiàn)象,而且可以探究實(shí)驗(yàn)過程中分子間的相互作用機(jī)理,還能夠直觀地觀察到各個(gè)結(jié)構(gòu)之間的連接狀態(tài)[9],因而在很多領(lǐng)域中得到廣泛關(guān)注和應(yīng)用。耗散粒子動(dòng)力學(xué)(dissipative particle dynamics,DPD)是分子模擬技術(shù)中的一種介觀模擬方法,用于模擬乳液、微乳液等復(fù)雜流體的行為,研究聚合物之間的聚集狀態(tài)和連接方式[10]。近年來,有研究者將其用于探究藥物分子與載體之間的相互作用,篩選適合特定藥物的載體物質(zhì),但在食品載體體系中運(yùn)用DPD探究機(jī)理的研究很少。

據(jù)此,本研究選用符合國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)的固液脂質(zhì)原料和表面活性劑等,以姜黃素為負(fù)載營養(yǎng)物,利用DPD模擬來計(jì)算負(fù)載物與固液脂質(zhì)以及表面活性劑之間的溶解度參數(shù)和相互作用力,預(yù)測它們的相容性來篩選適合的原料,再通過正交試驗(yàn)驗(yàn)證,并對制備的姜黃素NLC進(jìn)行粒徑和微觀形態(tài)表征。研究結(jié)果可為NLC載運(yùn)體系制備提供理論基礎(chǔ)及數(shù)據(jù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 模擬方法

1.1.1 體系分子粗?；?/p>

在DPD模擬中首先要將體系中的分子進(jìn)行粗?；?根據(jù)分子內(nèi)官能團(tuán)性質(zhì)、體積等,將分子中的基團(tuán)分成若干個(gè)珠子,并保持分子特性不變[11]。本實(shí)驗(yàn)選用的固體脂質(zhì)為單硬脂酸甘油酯,液體脂質(zhì)為中鏈甘油三酯(medium chain triglycerides,MCT)油、葵花籽油、甜橙油,表面活性劑為卵磷脂、泊洛沙姆188、吐溫-80。將單硬脂酸甘油酯劃分為長鏈烴基(A)、極性基團(tuán)(C)以及連接部分(B);表面活性劑具有兩親性,將卵磷脂劃分為親水基團(tuán)(B、N、PS)和親油基團(tuán)(A),泊洛沙姆分為(EO、PO)兩個(gè)珠子,吐溫-80分為親水基團(tuán)(H、F、J)和親油基團(tuán)(D);姜黃素是一個(gè)對稱結(jié)構(gòu),分成(Q、M)兩個(gè)珠子;分別用一個(gè)珠子代替MCT油(O1)、葵花籽油(O2)、甜橙油(O3)以及水(W)。各分子的粗?；鐖D1所示。

a-單硬脂酸甘油酯;b-中鏈甘油三酯;c-葵花籽油;d-甜橙油;e-大豆卵磷脂;f-泊洛沙姆;g-姜黃素;h-吐溫-80;i-水圖1 材料的分子結(jié)構(gòu)及其粗?；疐ig.1 Molecular structure and coarse-granulation of materials

1.1.2 相互作用參數(shù)

對各組分粗粒化完成后,用Materials Studio 6.0軟件中的Amorphous Cell模塊計(jì)算各珠子在298 K的溶解度參數(shù)以及各珠子的摩爾體積,進(jìn)而計(jì)算珠子間的相互作用參數(shù)。

同種珠子之間的相互作用參數(shù)aiiρ=75kBT,當(dāng)珠子密度ρ=3時(shí),可得aii=25。珠子間的相互作用力aij與Flory-Huggins參數(shù)xij之間存在線性關(guān)系[12],如公式(1)所示:

aij=aii+3.27xij

(1)

式中:xij,Flory-Huggins參數(shù)。

主要用分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算溶解度參數(shù)的方法來求Flory-Huggins參數(shù),其計(jì)算方式如公式(2)所示:

式中:δi和δj,各個(gè)珠子的溶解度參數(shù);V,珠子的摩爾體積;R,理想氣體常數(shù);T,熱力學(xué)溫度。

對于NLC中各珠子的溶解度參數(shù)和摩爾體積如表1所示:

表1 DPD模擬中各珠子的溶解度參數(shù)及摩爾體積Table 1 Solubility parameters and molar volume of beads in DPD simulation

根據(jù)表1中各個(gè)珠子的溶解度參數(shù)和摩爾體積,用公式(2)計(jì)算出Flory-Huggins參數(shù),然后再進(jìn)一步利用公式(1)計(jì)算出相互作用參數(shù)aij,結(jié)果如表2所示。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料與試劑

單硬脂酸甘油酯(純度≥95%)、卵磷脂(純度≥90%),廣州市齊湘生物技術(shù)有限公司;中鏈甘油三酯,廣州耶商貿(mào)易公司;姜黃素(純度≥90%),上海源葉生物科技有限責(zé)任公司;無水乙醇,廣東光華科技股份有限公司。

1.2.2 儀器與設(shè)備

AH-BASIC高壓均質(zhì)機(jī),江蘇ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司;FJ200高速分散均質(zhì)攪拌機(jī),上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司;UV-2500紫外可見分光光度計(jì),德國斯派克分析儀器公司;納米粒度及Zeta電位分析儀,英國Malvern公司;高速離心機(jī),美國Beckman Coulter公司;MP41+MDX4光學(xué)顯微鏡,廣州市明美光電技術(shù)有限公司。

1.2.3 NLC制備

量取蒸餾水置于燒杯中,在水中加入表面活性劑卵磷脂,混勻即得到水相,備用。稱取姜黃素、單硬脂酸甘油酯和MCT油混合后,將混合物加熱到85 ℃(比固體脂質(zhì)熔點(diǎn)高5 ℃)制得姜黃素懸液。將加熱后的油相立即與加熱到相同溫度的水相按比例混合,將混合液在14 000 r/min下剪切處理3 min后,利用高壓均質(zhì)機(jī)在一定壓力下均質(zhì)后迅速冷卻即得到NLC。

1.2.4 包封率的測定

姜黃素對照品:準(zhǔn)確稱取姜黃素10.2 mg,置于100 mL棕色容量瓶中,無水乙醇溶解并定容至刻度,混勻,即得0.102 mg/mL的姜黃素溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:精密量取上述姜黃素溶液100、200、300、400、500、600、700 μL于100 mL棕色量瓶中,加無水乙醇稀釋,定容、搖勻,即得1.02、2.04、3.06、4.08、5.10、6.12、7.14 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以無水乙醇作空白,在432 nm處測定吸光度,以吸光度(A)對濃度(C)進(jìn)行線性回歸。

包封率測定:將姜黃素脂質(zhì)體溶液1 mL離心30 min,分離下層沉淀,加無水乙醇溶解定容至100 mL,測得姜黃素含量(A1);另外,將相同姜黃素脂質(zhì)體溶液1 mL直接加無水乙醇溶解定容至100 mL,測得姜黃素含量(A2),包封率的計(jì)算如公式(3)所示:

包封率/%=A1/A2×100

(3)

1.2.5 NLC粒徑的測定

利用納米粒度及Zeta-電位分析儀測定姜黃素NLC的粒徑。樣品在測試前先使用去離子水對原乳液稀釋100倍,潤洗后吸取適量(約為比色皿的1/3)的待測液加入石英比色皿中,測試的參數(shù)為:水的折射率1.33,測試溫度25 ℃,每個(gè)樣品平行測定3次,取平均值。

1.2.6 NLC電位的測定

利用納米粒度及Zeta電位分析儀測定NLC的電位。樣品在測試前先使用去離子水對原樣稀釋100倍,潤洗后吸取適量(約恰好將比色皿裝滿)的待測液加入專用的比色皿中,測試參數(shù)為:水的折射率1.33,測試溫度25 ℃,每個(gè)樣品平行測定3次,取平均值。

1.2.7 NLC的微觀結(jié)構(gòu)

將姜黃素NLC用去離子水稀釋10倍后,取15 μL的稀釋液滴到顯微鏡載玻片的中間位置并蓋上蓋玻片,靜置10 s,使用光學(xué)顯微鏡在10倍的放大倍數(shù)下觀察姜黃素NLC的微觀狀態(tài),并用數(shù)字圖像分析軟件MS Shot軟件拍照保存圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

本文涉及到的實(shí)驗(yàn)和模擬如無特殊說明均進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)或3次模擬,使用Origin 2019 Pro軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差并作圖,使用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 液體脂質(zhì)種類對NLC形成的影響

圖2是以單硬脂酸甘油酯為固體脂質(zhì),分別以MCT油、葵花籽油、甜橙油為液體脂質(zhì)所得3種姜黃素NLC體系的聚集狀態(tài)以及截面圖。為了更好地觀察載體結(jié)構(gòu),隱藏了水分子。模擬中設(shè)置脂質(zhì)總量占體系的9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同),單硬脂酸甘油酯與液體脂質(zhì)比例設(shè)置為1∶3(質(zhì)量比,下同),液體脂質(zhì)占總脂質(zhì)含量的25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同),姜黃素含量占脂質(zhì)含量的1%。

a-MCT油NLC的聚集圖;b-葵花籽油NLC的聚集圖;c-甜橙油NLC的聚集圖;d-MCT油NLC的截面圖; e-葵花籽油NLC的截面圖;f-甜橙油NLC的截面圖圖2 不同液體脂質(zhì)形成NLC的聚集圖與截面圖Fig.2 Aggregation and cross section of NLC formed by different liquid lipids

從圖2中可以看出,3個(gè)體系都能很好的聚集成球,但單硬脂酸甘油酯-葵花籽油NLC和單硬脂酸甘油酯-甜橙油NLC兩種體系所負(fù)載的姜黃素大部分分布在脂質(zhì)載體的表面,而單硬脂酸甘油酯-MCT油NLC負(fù)載的姜黃素大部分被包埋在脂質(zhì)載體中間,僅有少量在載體表面。從截面圖中也可以看出單硬脂酸甘油酯-MCT油體系形成的NLC更為緊密,這可能是由于MCT油作為一種通過化學(xué)合成方法獲得的油脂,溶解性、黏度、表面張力與天然的植物油有所區(qū)別,而且MCT油脂肪酸鏈長比較短,親水性也比較高,能夠更好地與單硬脂酸甘油酯結(jié)合[13]。

2.2 液體脂質(zhì)含量對NLC形成的影響

液體脂質(zhì)含量對NLC形成有很大的影響,液體脂質(zhì)對營養(yǎng)物的溶解度比固體脂質(zhì)要高,所以在脂質(zhì)體系中液體脂質(zhì)的含量越高,營養(yǎng)物的負(fù)載率就越高,但是液體脂質(zhì)的添加量也不可以無限增加[14]。有研究表明,過高的液體脂質(zhì)含量可能會(huì)造成營養(yǎng)物質(zhì)的突釋,使?fàn)I養(yǎng)物暴露在載體體系的表面,達(dá)不到最佳的效果[15]。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇MCT油作為液體脂質(zhì),設(shè)置3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3(質(zhì)量比,下同)的固液脂質(zhì)比例,采用DPD模擬的方法,探究不同液體脂質(zhì)含量對NLC形成的影響,以篩選單硬脂酸甘油酯-MCT油NLC中適合的固液脂質(zhì)比例。

從圖3中可以看出,不同比例的固液脂質(zhì)影響脂質(zhì)載體的粒徑。固體脂質(zhì)含量較高時(shí),形成的脂質(zhì)載體的粒徑較大,隨著液體脂質(zhì)含量的增加,引起脂質(zhì)載體表面張力的改變,粒徑變小。APOSTOLOU等[14]研究中表明固體脂質(zhì)含量高時(shí),顆粒大小有增加的趨勢。圖3所示,當(dāng)固液脂質(zhì)比例在1∶1時(shí),形成的粒徑最小,但是所形成的球狀結(jié)構(gòu)不規(guī)則。從截面圖中可以看出,固液脂質(zhì)比例為3∶1和2∶1時(shí),單硬脂酸甘油酯不只是分布在NLC的表面,在球狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)部也存在。固液脂質(zhì)比例在1∶2和1∶3時(shí)形成的球狀結(jié)構(gòu)較好,但當(dāng)比例為1∶2時(shí),有少量的姜黃素分布在NLC的表面。熊文慧[7]的研究也表明,NLC載體體系中液體脂質(zhì)含量越高時(shí)體系的平均粒徑越小,穩(wěn)定性越好。麥琬婷等[16]的研究結(jié)果也表明液體脂質(zhì)比固體脂質(zhì)含量高時(shí)粒徑小、包封率和載藥量高。綜上所述,選擇1∶3作為合適的固液脂質(zhì)比例。

a-3∶1比例形成的NLC聚集圖;b-2∶1比例形成的NLC聚集圖;c-1∶1比例形成的NLC聚集圖;d-1∶2比例形成的NLC聚集圖; e-1∶3比例形成的NLC聚集圖;f-3∶1比例形成的NLC截面圖;g-2∶1比例形成的NLC截面圖; h-1∶1比例形成的NLC截面圖;i-1∶2比例形成的NLC截面圖;j-1∶3比例形成的NLC截面圖圖3 不同固液脂質(zhì)比例形成的NLC聚集形態(tài)圖及截面圖Fig.3 NLC aggregation morphology and section of different solid-liquid lipid ratios

2.3 姜黃素用量對NLC形成的影響

在制備納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體時(shí),因營養(yǎng)物的加入會(huì)影響脂質(zhì)載體的成型,營養(yǎng)物的添加量也是影響脂質(zhì)載體結(jié)構(gòu)及其性能的一個(gè)重要因素,用量過大或過少都可能會(huì)造成營養(yǎng)物的突釋,導(dǎo)致營養(yǎng)物分布不均甚至不能包埋在載體中[17]。設(shè)置姜黃素含量分別占脂質(zhì)含量的1%、3%、5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)作為模擬條件,用DPD模擬探究不同含量的姜黃素對NLC形成的影響,結(jié)果見圖4。

a-姜黃素1%NLC的聚集圖;b-姜黃素3%NLC的聚集圖;c-姜黃素5%NLC的聚集圖;d-姜黃素1%NLC的截面圖; e-姜黃素3%NLC的截面圖;f-姜黃素5%NLC的截面圖圖4 不同姜黃素含量形成的NLC的聚集圖與截面圖Fig.4 Aggregation and cross section of NLC with different curcumin contents

從圖4中可以看出,在相同的盒子大小下,姜黃素添加量不同所形成的NLC的粒徑也有很大差別,姜黃素含量在3%時(shí)粒徑相對較小。在體系中加入的營養(yǎng)物會(huì)與其他組分相互作用,可能導(dǎo)致形成的脂質(zhì)載體的形態(tài)各不相同,同時(shí)營養(yǎng)物添加量不同也可能導(dǎo)致其在脂質(zhì)載體中的分布位置發(fā)生改變。根據(jù)已有文獻(xiàn)可知,營養(yǎng)物的添加量對載體體系的負(fù)載率影響較為明顯,李達(dá)鴻[18]探究了不同番茄紅素添加量對番茄紅素納米乳液包封率的影響,結(jié)果表明營養(yǎng)物添加量過低或過高都會(huì)導(dǎo)致負(fù)載率較低。在單硬脂酸甘油酯-MCT油體系中,姜黃素含量占脂質(zhì)含量1%和3%時(shí),姜黃素都基本上被包埋在NLC中。姜黃素含量過多就會(huì)使過剩的部分被排除到脂質(zhì)載體的表面。營養(yǎng)物本身也是參與形成NLC的一個(gè)部分,所以適當(dāng)?shù)奶砑恿坎粌H能夠形成良好的球狀結(jié)構(gòu),而且不會(huì)造成營養(yǎng)物浪費(fèi)。

2.4 表面活性劑種類及用量對NLC形成的影響

為了使脂質(zhì)載體更加穩(wěn)定,在制備脂質(zhì)載體的過程中通常會(huì)加入表面活性劑,以降低溶液的表面張力[19]。表面活性劑的種類包括離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑以及兩親性表面活性劑。本實(shí)驗(yàn)選擇卵磷脂、泊洛沙姆188、吐溫-80三種表面活性劑,探究其種類和用量對基于單硬脂酸甘油酯-MCT油的NLC體系形成的影響。

2.4.1 卵磷脂作為表面活性劑對NLC形成的影響

卵磷脂是一種兩親性表面活性劑,也是比較溫和的表面活性劑,它在分子的一端同時(shí)存在酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)[20]。卵磷脂的碳?xì)滏溈梢澡偳度雴斡仓岣视王ブ?形成外殼包裹固體脂質(zhì)和液體脂質(zhì),其親水基團(tuán)帶有負(fù)電荷,與單硬脂酸甘油酯的羥基作用,產(chǎn)生靜電斥力來穩(wěn)定體系[11]。從圖5中可以看出,卵磷脂在脂質(zhì)載體表面分布比較均勻,在含量為4%時(shí)就能很好地將脂質(zhì)載體覆蓋住,說明其是較適宜制備NLC的表面活性劑。卵磷脂含量也會(huì)影響脂質(zhì)載體的聚集形態(tài)以及粒徑,當(dāng)卵磷脂的含量升高至8%時(shí),粒徑明顯增大,而且形成的球形結(jié)構(gòu)沒有含量為4%和6%時(shí)好。

a-4%卵磷脂NLC的聚集圖;b-6%卵磷脂NLC的聚集圖;c-8%卵磷脂NLC的聚集圖;d-4%卵磷脂NLC的截面圖; e-6%卵磷脂NLC的截面圖;f-8%卵磷脂NLC的截面圖圖5 不同卵磷脂含量對NLC形成的影響Fig.5 Effects of different lecithin contents on NLC formation

2.4.2 泊洛沙姆作為表面活性劑對NLC形成的影響

親水親油平衡值(hydrophilic-Lipophilic Balance,HLB)表示表面活性劑分子中親水基和親油基之間的大小和力量平衡程度的量。泊洛沙姆188是一類HLB值為16的高分子非離子表面活性劑,有較強(qiáng)的表面活性,它的聚氧乙烯鏈具有相對親水性,聚氧丙烯鏈具有相對親油性[21]。從圖6中可以看出,3個(gè)不同濃度的泊洛沙姆188均與單硬脂酸甘油酯和MCT油混溶在一起,并沒有作為表面活性劑覆蓋在球形結(jié)構(gòu)的表面,反而是姜黃素大都分布在表面。從表1的溶解度參數(shù)中可以看出泊洛沙姆188兩個(gè)珠子的溶解度分別為18.26、17.50(J/cm3)1/2,與單硬脂酸甘油酯和MCT油珠子的溶解度參數(shù)非常相近,這可能是導(dǎo)致這幾種物質(zhì)混溶在一起,沒有形成球殼結(jié)構(gòu)的原因。從模擬結(jié)果初步判斷泊洛沙姆188可能不適合作為單硬脂酸甘油酯-MCT油這一體系的表面活性劑。

a-4%泊洛沙姆NLC的聚集圖;b-6%泊洛沙姆NLC的聚集圖;c-8%泊洛沙姆NLC的聚集圖;d-4%泊洛沙姆NLC的截面圖; e-6%泊洛沙姆NLC的截面圖;f-8%泊洛沙姆NLC的截面圖圖6 不同泊洛沙姆188含量對NLC形成的影響Fig.6 Influence of different poloxamer 188 contents on NLC formation

2.4.3 吐溫-80作為表面活性劑對NLC形成的影響

吐溫-80是一種非離子型小分子表面活性劑,因其極易在油水界面展開,降低表面張力能力強(qiáng),形成的脂質(zhì)載體的粒徑也較小,且對pH和離子強(qiáng)度不敏感,因此在有關(guān)載體的制備研究中被廣泛使用[22]。本實(shí)驗(yàn)在模擬時(shí)設(shè)置吐溫-80用量分別為4%、6%、8%,結(jié)果發(fā)現(xiàn)吐溫-80加入到脂質(zhì)載體中后,與泊洛沙姆類似,也出現(xiàn)了與單硬脂酸甘油酯和MCT油的混溶現(xiàn)象。從表1溶解度參數(shù)中也可以看出,將吐溫-80根據(jù)性質(zhì)劃分的4個(gè)珠子的溶解度參數(shù)與單硬脂酸甘油酯以及MCT油的溶解度參數(shù)數(shù)值相差不大,各個(gè)珠子之間的相互作用力也較小,所以極易混到一起,產(chǎn)生了圖7中所出現(xiàn)的混溶現(xiàn)象。ROHMAH等[23]以棕櫚硬脂和棕櫚油為固液脂質(zhì),以吐溫-80為液體脂質(zhì)制備負(fù)載β-胡蘿卜素的納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體通過響應(yīng)面法就可以得到粒徑為166 nm的良好載體體系,可能是由于棕櫚硬脂、棕櫚油與吐溫-80之間有較強(qiáng)的相互作用,能夠形成較好的球殼結(jié)構(gòu)將β-胡蘿卜素包封在脂質(zhì)載體中。

綜上所述,對于姜黃素-單硬脂酸甘油酯-MCT油體系來說,在這3種表面活性劑中,效果較好的是兩親性表面活性劑卵磷脂,能夠穩(wěn)定在NLC的表面,從而形成很好的球殼結(jié)構(gòu)。另外,從模擬結(jié)果可以看出,表面活性劑的含量并不是越高越好,較高的表面活性劑含量也會(huì)造成體系的不穩(wěn)定。就卵磷脂而言,在姜黃素-單硬脂酸甘油酯-MCT油體系中含量到達(dá)8%時(shí),體系粒徑增大,而且在表面分布不均勻,形成的球形也不規(guī)則,所以在選擇一種較好的表面活性劑的同時(shí)也要注意其用量。

2.5 負(fù)載姜黃素NLC的制備

根據(jù)DPD模擬得到的結(jié)果進(jìn)行正交試驗(yàn)。在制備NLC時(shí)采用高壓均質(zhì)的方法,壓力的過大和過小都會(huì)對原料的物理、化學(xué)及結(jié)構(gòu)性質(zhì)產(chǎn)生不同的影響進(jìn)而影響負(fù)載量,所以在正交試驗(yàn)時(shí)將均質(zhì)壓力也作為一個(gè)實(shí)驗(yàn)因素。本實(shí)驗(yàn)選用L9(34)正交試驗(yàn)表,考察固液脂質(zhì)比例、姜黃素含量、卵磷脂含量、高壓均質(zhì)壓力4個(gè)因素對姜黃素負(fù)載率的影響,結(jié)果及分析如表4、表5所示。

表3 正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 Level table of orthogonal experimental factors

a-4%吐溫-80 NLC的聚集圖;b-6%吐溫-80 NLC的聚集圖;c-8%吐溫-80 NLC的聚集圖;d-4%吐溫-80 NLC的截面圖; e-6%吐溫-80 NLC的截面圖;f-8%吐溫-80 NLC的截面圖圖7 不同吐溫-80含量對NLC形成的影響Fig.7 Influence of different Tween-80 content on NLC formation

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal experimental results

表5 正交試驗(yàn)方差分析表Table 5 Analysis of variance of orthogonal experiment

從表4中可以得到RA>RB>RC>RD,表明這4個(gè)因素中,對姜黃素負(fù)載率影響大小順序是:固液脂質(zhì)比例>姜黃素含量>卵磷脂含量>均質(zhì)壓力,其中固液脂質(zhì)比例對姜黃素負(fù)載率的影響較為明顯。從方差分析表5中可以看出固液脂質(zhì)比例的sig.<0.05,說明固液脂質(zhì)比例對姜黃素負(fù)載率的影響顯著,而其他因素的sig.>0.1,說明其他3個(gè)因素對姜黃素負(fù)載率影響較小。DPD模擬結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果均表明固液脂質(zhì)比例為1∶3,姜黃素占總脂質(zhì)含量3%時(shí)形成的NLC效果最好。另外,在DPD模擬中發(fā)現(xiàn),隨著卵磷脂含量的增大,形成的NLC的粒徑也隨著增大,最適宜的含量為4%,但在正交試驗(yàn)中得到的最佳卵磷脂含量為5%。由于模擬中沒有設(shè)置卵磷脂含量為5%這一條件,所以根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果,選擇卵磷脂含量為5%,再次進(jìn)行模擬,結(jié)果如圖8所示。從圖中可以看出以5%卵磷脂為乳化劑形成的姜黃素NLC結(jié)構(gòu)更規(guī)則,姜黃素分布較集中,基本被包裹在脂質(zhì)中心。ZHU等[24]也在研究中使用卵磷脂作為乳化劑代替蛋白,結(jié)果表明卵磷脂含量為5%和7%時(shí)提高了乳液的物理穩(wěn)定性,降低了平均粒徑,提高了ζ電位值,特別是含量為5%的卵磷脂顯示出更高的脂肪消化率和程度。綜上,選定A2B2C2D1即固液脂質(zhì)比例為1∶3,姜黃素含量3%,卵磷脂含量5%,均質(zhì)壓力60 MPa作為制備姜黃素納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的優(yōu)化工藝條件。

a-聚集圖;b-截面圖圖8 卵磷脂含量為5%形成的姜黃素NLCFig.8 Curcumin NLC formed by 5% lecithin

2.6 姜黃素NLC的粒徑、Zeta電位及微觀形態(tài)

根據(jù)DPD模擬與正交試驗(yàn)得到的最優(yōu)原料配比進(jìn)行NLC的制備。一般來說,粒徑<500 nm時(shí),體系就可以被認(rèn)定為納米結(jié)構(gòu)。從圖9-a中可以看出,姜黃素NLC的平均粒徑在(233.8±2.4) nm,體系PDI值為0.19±0.2,表明制備的姜黃素NLC體系粒徑較小且均勻。圖9-b可以看出,新鮮制備的姜黃素NLC液滴清晰可見,分散均勻,體系中沒有明顯的液滴聚集現(xiàn)象。

a-粒徑分布圖;b-光學(xué)顯微鏡圖(×10)圖9 姜黃素NLC的粒徑分布圖及光學(xué)顯微鏡圖Fig.9 Particle size distribution and optical microscopy of curcumin NLC

使用納米粒徑及Zeta電位分析儀測定新鮮制備的姜黃素NLC的電位。王佳麗等[25]研究認(rèn)為當(dāng)Zeta電位低于-30 mV或者高于30 mV時(shí),體系傾向于靜電穩(wěn)定;當(dāng)電位處于-30 mV～30 mV時(shí),體系更容易聚集或凝結(jié)。本實(shí)驗(yàn)制備的姜黃素NLC電位為(-38.2±0.6) mV,體系帶有比較高的表面負(fù)電荷,體系由靜電斥力以及空間位阻共同發(fā)揮作用對其進(jìn)行穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本研究利用DPD模擬與正交試驗(yàn)結(jié)合篩選適合制備NLC的固液脂質(zhì)和表面活性劑等原料種類以及用量,并對其進(jìn)行表征。結(jié)果表明:姜黃素在單硬脂酸甘油酯-MCT油脂質(zhì)載體中能較好地包封在液體脂質(zhì)中,不會(huì)明顯地暴露在表面;隨著液體脂質(zhì)含量的增加,引起脂質(zhì)載體表面張力的改變,粒徑也會(huì)隨之改變,固液脂質(zhì)含量比例為1∶3時(shí),形成NLC粒徑較小;姜黃素含量過多或過少都可能會(huì)造成NLC突釋,本實(shí)驗(yàn)中選擇3%含量較為合適;在單硬脂酸甘油酯-MCT油脂質(zhì)載體中,選擇4%的卵磷脂作為表面活性劑能很好地形成球殼結(jié)構(gòu)附著在脂質(zhì)載體表面;正交試驗(yàn)結(jié)果表明模擬結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符,因此選擇單硬脂酸甘油酯-MCT油-卵磷脂制備脂質(zhì)載體,當(dāng)固液脂質(zhì)比例為1∶3,姜黃素含量3%,卵磷脂含量5%,均質(zhì)壓力60 MPa時(shí),姜黃素包封率最高為85.06%。此時(shí)NLC粒徑為(233.8±2.4)nm,Zeta電位為(-38.2±0.6)mV,微觀結(jié)構(gòu)表明體系均勻分散,無聚集現(xiàn)象。