李子奇,王靚,陳旭升,張宏建,張建華*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)2(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214122)

燃料乙醇是一種清潔能源,可以作為化石燃料的替代品,進(jìn)而降低人們對(duì)化石能源的依賴。隨著國(guó)內(nèi)石油需求的增加,以燃料乙醇等替代能源為代表的能源供應(yīng)多元化戰(zhàn)略已成為中國(guó)能源政策的一個(gè)方向[1]。我國(guó)生物質(zhì)燃料乙醇主要以玉米、陳化糧和木薯等作為生產(chǎn)原料,以木薯為原料發(fā)酵法生產(chǎn)燃料乙醇時(shí),每生產(chǎn)1 t乙醇就會(huì)產(chǎn)生8～12 t的廢水,傳統(tǒng)的處理方法將蒸餾廢液經(jīng)固液分離、厭氧消化后仍難以達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn),目前企業(yè)多采用序批式活性污泥法(sequencing batch reactor activated sludge process, SBR)進(jìn)一步處理廢水,使SBR出水的水質(zhì)達(dá)標(biāo)后排入污水管網(wǎng)。如何實(shí)現(xiàn)廢水綜合利用是燃料乙醇產(chǎn)業(yè)面臨的突出問(wèn)題,而開(kāi)發(fā)燃料乙醇廢水資源化回用技術(shù),實(shí)現(xiàn)廢水零排放,不僅能消除廢水的污染問(wèn)題,還可以降低生產(chǎn)成本[2-3]。對(duì)此,研究者們開(kāi)展了大量工作,ZHANG等[4]利用兩級(jí)厭氧處理木薯乙醇生產(chǎn)廢水,使廢水可全部回用到乙醇發(fā)酵并在13次回收中穩(wěn)定運(yùn)行;YANG等[5]采用離子交換樹(shù)脂處理經(jīng)厭氧-好氧消化后的乙醇廢水,開(kāi)發(fā)了乙醇廢水的新型全回收工藝。但迄今為止,關(guān)于SBR出水再利用的研究成果很少。為了實(shí)現(xiàn)SBR出水的資源化回用,助力乙醇行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,有必要探索SBR出水經(jīng)濟(jì)高效的資源化回用方法。

O3是一種強(qiáng)氧化劑且制備成本低廉,可以高效氧化降解污水中的各種有害組分[6-7]。由于O3自身穩(wěn)定性差容易自行分解[8],因此在使用O3處理污水時(shí)不會(huì)產(chǎn)生殘留問(wèn)題,被視為一種高性價(jià)比的水處理手段。本文采用O3氧化的方式處理SBR出水,并開(kāi)展乙醇發(fā)酵試驗(yàn),以期為SBR出水資源化回用于乙醇發(fā)酵、實(shí)現(xiàn)燃料乙醇清潔生產(chǎn)探索一種新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

市售安琪耐高溫活性釀酒酵母。

1.1.2 SBR出水

由太倉(cāng)新太酒精有限公司提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,酵母膏8.5,NH4Cl 1.3,MgSO4·7H2O 0.1,CaCl20.06。葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖150,蛋白胨5,酵母膏5,尿素0.5,KH2PO41.5,MgSO4·7H2O 0.65。

1.1.4 儀器與設(shè)備

BF-CS-310臭氧發(fā)生器,廣州百豐環(huán)保科技有限公司;SBA-40D生物傳感器,山東省科學(xué)院生物研究所;ICAP TQ電感耦合等離子體質(zhì)譜儀,賽默飛世爾科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 SBR出水的O3氧化處理

取250 mL SBR出水于錐形瓶中,以10 g/h通入O3,反應(yīng)溫度為25 ℃,原始pH。

1.2.2 種子培養(yǎng)

將生長(zhǎng)狀況良好的斜面酵母轉(zhuǎn)接至含有200 mL種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中,30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。

1.2.3 乙醇發(fā)酵

將體積分?jǐn)?shù)為10%的酵母種子液接種到裝有葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,發(fā)酵栓封口,并在發(fā)酵栓中加入4%(體積分?jǐn)?shù))的稀H2SO4,放入恒溫培養(yǎng)箱,30 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.4 釀酒酵母細(xì)胞形態(tài)觀察

將體積分?jǐn)?shù)為10%的酵母種子液接種到含有100 mg/L NO2-(NaNO2)的葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h后離心收集細(xì)胞,預(yù)處理方法參照文獻(xiàn)[9],掃描電子顯微鏡觀察酵母細(xì)胞形態(tài)。

1.3 分析方法

1.3.1 乙醇含量測(cè)定

采用蒸酒法[10]測(cè)定乙醇含量。

1.3.2 殘葡萄糖測(cè)定

將發(fā)酵液離心后取上清液,使用去離子水稀釋100倍,SBA生物傳感器測(cè)定葡萄糖含量。

1.3.3 酵母的計(jì)數(shù)與死亡率測(cè)定

美蘭染色后采用血球計(jì)數(shù)法測(cè)定酵母數(shù)與死亡率[11]。

1.3.4 無(wú)機(jī)離子測(cè)定

采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測(cè)序

將體積分?jǐn)?shù)為10%的酵母種子液接種到含有100 mg/L NO2-(NaNO2)的葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h后,離心收集酵母細(xì)胞(6 000 r/min,4 ℃,5 min),棄上清液后用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌菌體沉淀2次,于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測(cè)與分析由武漢華大基因科技股份有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 SBR出水直接回用對(duì)乙醇發(fā)酵的影響

分別以自來(lái)水和SBR出水作為拌料水進(jìn)行乙醇發(fā)酵,以自來(lái)水為對(duì)照組,發(fā)酵時(shí)間為48 h。每8 h取樣測(cè)定乙醇產(chǎn)量、殘?zhí)桥c酵母細(xì)胞數(shù),評(píng)估不同發(fā)酵系統(tǒng)的差異。如表1所示,在整個(gè)發(fā)酵周期中,以SBR出水作為拌料水進(jìn)行乙醇發(fā)酵時(shí),發(fā)酵液中乙醇濃度明顯低于對(duì)照組,且在16～32 h時(shí)差異最明顯。通過(guò)對(duì)酵母數(shù)的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),SBR出水會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵24 h的酵母細(xì)胞數(shù)減少46.2%。而通過(guò)對(duì)殘?zhí)呛康姆治霭l(fā)現(xiàn),發(fā)酵24 h時(shí)殘?zhí)堑馁|(zhì)量濃度比對(duì)照組高52.7%,乙醇產(chǎn)量相比對(duì)照組減少了54.8%。表明SBR出水直接回用會(huì)降低酵母活力并阻礙生長(zhǎng),抑制乙醇發(fā)酵。

表1 SBR出水直接回用對(duì)乙醇發(fā)酵的影響Table 1 Effect of direct reuse of SBR effluent on ethanol fermentation

2.2 SBR出水O3氧化后回用對(duì)乙醇發(fā)酵的影響

將O3氧化不同時(shí)間(5、10、15、20 min)的SBR出水回用于乙醇發(fā)酵,探究O3氧化是否可以解除SBR出水的抑制性。發(fā)酵系統(tǒng)的失重源自乙醇發(fā)酵途徑CO2的散失,單位時(shí)間內(nèi)發(fā)酵系統(tǒng)的失重可以反映酵母的發(fā)酵速率[2]。如圖1所示,隨著O3氧化時(shí)間的增加,SBR出水的毒性不斷減弱,氧化20 min時(shí),SBR出水回用乙醇發(fā)酵,其發(fā)酵速率與乙醇產(chǎn)量和對(duì)照組無(wú)明顯差異,說(shuō)明O3氧化可在短時(shí)間內(nèi)去除其發(fā)酵毒性,實(shí)現(xiàn)SBR出水的全回用。

a-失重;b-乙醇產(chǎn)量圖1 SBR出水氧化不同時(shí)間后回用對(duì)乙醇發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of reuse of SBR effluent treated by oxidation for different time on ethanol fermentation

2.3 SBR出水中抑制組分探究

SBR出水進(jìn)行水質(zhì)分析結(jié)果如表2所示,SBR出水呈堿性,水中化學(xué)需氧量(chemical oxygen demand, COD)值僅為794.8 mg/L、電導(dǎo)率達(dá)到6.36 ms/cm,表明水中有機(jī)物濃度較低,但含有濃度較高的無(wú)機(jī)組分。

表2 SBR出水的水質(zhì)分析Table 2 Water quality analysis of SBR effluent

對(duì)O3氧化20 min后SBR出水中的無(wú)機(jī)離子進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如表3所示,O3氧化后SBR出水中大部分無(wú)機(jī)離子變化不顯著,只有NO3-濃度顯著升高,而NO2-在短時(shí)間內(nèi)被去除,表明水溶液中NO2-被O3高效地氧化為NO3-,這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和NAUMOV等[12]的研究結(jié)論基本一致。為檢驗(yàn)NO2-與NO3-對(duì)乙醇發(fā)酵的影響,根據(jù)SBR出水中NO2-、NO3-的濃度,在去離子水中分別進(jìn)行外源添加并開(kāi)展乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖2所示,NO3-在檢測(cè)質(zhì)量濃度(54.13 mg/L)下對(duì)乙醇發(fā)酵無(wú)顯著影響,即使NO3-質(zhì)量濃度達(dá)到300 mg/L時(shí)仍未對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用,表明NO3-不是SBR出水中的乙醇發(fā)酵抑制物。但在檢測(cè)質(zhì)量濃度(104.83 mg/L)下的NO2-使發(fā)酵速率顯著降低,乙醇產(chǎn)量也相應(yīng)受到抑制,發(fā)酵48 h的乙醇產(chǎn)量降低了23%。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,NO2-是SBR出水中抑制乙醇發(fā)酵的主要物質(zhì)。

表3 O3氧化前后SBR出水中無(wú)機(jī)離子Table 3 Inorganic ions concentrations in SBR effluent before and after ozone oxidation

a-失重;b-乙醇產(chǎn)量圖2 NO2-離子與NO3-離子對(duì)釀酒酵母乙醇發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of NO2- and NO3- on ethanol fermentation by Saccharomyces cerevisiae

SBR通過(guò)在反應(yīng)器中曝氣、沉降、排放等階段進(jìn)行周期性的操作,使有機(jī)物在反應(yīng)器內(nèi)獲得充分的生物降解,能夠有效去除廢水中的COD、生化需氧量(biochemical oxygen demand, BOD),達(dá)到水質(zhì)處理的目的[13]。其中,硝化和反硝化是SBR中最重要的過(guò)程之一,受環(huán)境變量調(diào)控。在有氧環(huán)境下,氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌可將污水中的氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮,而在無(wú)氧或缺氧條件下,反硝化細(xì)菌則將亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮還原為氮氧化物或N2。但在實(shí)際應(yīng)用中,受廢水進(jìn)水量與水質(zhì)的影響,系統(tǒng)水力負(fù)荷會(huì)改變硝化與反硝化之間菌群的平衡,在高pH、高水溫、低溶解氧等條件下,使亞硝酸鹽氧化菌受抑制,導(dǎo)致NO2-積累[14-15]。

2.4 NO2-抑制乙醇發(fā)酵機(jī)理的探究

2.4.1 NO2-對(duì)乙醇發(fā)酵的影響

為探究NO2-抑制乙醇發(fā)酵的機(jī)理,以去離子水為對(duì)照組,通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基中外源添加不同濃度的NO2-,測(cè)定24 h酵母細(xì)胞死亡率與細(xì)胞數(shù),并在發(fā)酵48 h時(shí)測(cè)定乙醇產(chǎn)量與殘?zhí)呛?。結(jié)果如圖3所示,NO2-質(zhì)量濃度為5 mg/L時(shí)便對(duì)乙醇發(fā)酵產(chǎn)生了抑制作用,使發(fā)酵24 h時(shí)的酵母數(shù)降低了31.6%,最終發(fā)酵乙醇產(chǎn)量降低了1.7%。隨著NO2-濃度的升高,抑制作用顯著增強(qiáng),添加15、50、100、300 mg/L NO2-,分別使24 h的酵母數(shù)降低了39.2%、46.3%、53.1%與71.1%,最終乙醇產(chǎn)量分別降低了2.9%、11.8%、21.4%與64.8%,大量葡萄糖在發(fā)酵液中無(wú)法被利用。酵母死亡率也隨NO2-濃度的增加而不斷上升。添加100 mg/L NO2-,此時(shí)接近SBR出水中NO2-濃度,酵母死亡率達(dá)到17.2%,遠(yuǎn)高于對(duì)照組中3.5%。說(shuō)明酵母細(xì)胞受到NO2-的脅迫無(wú)法正常生長(zhǎng)繁殖,導(dǎo)致酵母數(shù)顯著減少,死亡率上升,細(xì)胞活性被抑制,因此對(duì)葡萄糖利用率降低,酵母乙醇發(fā)酵受到抑制。

a-死亡率、細(xì)胞數(shù);b-乙醇、殘?zhí)琴|(zhì)量濃度圖3 NO2-對(duì)釀酒酵母乙醇發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of nitrite on ethanol fermentation by S. cerevisiae

2.4.2 NO2-對(duì)酵母細(xì)胞形態(tài)的影響

利用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(field emission scanning electron microscopy, FESEM)觀察自來(lái)水、SBR出水、O3氧化20 min后SBR出水與外源添加100 mg/L NO2-去離子水回用乙醇發(fā)酵時(shí)酵母的細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果如圖4所示,以自來(lái)水拌料進(jìn)行乙醇發(fā)酵時(shí)酵母細(xì)胞表面光滑、平整、飽滿(圖4-a);SBR出水直接回用的酵母細(xì)胞出現(xiàn)些許空洞、胞間粘連、部分細(xì)胞內(nèi)容物外泄的情況(圖4-b),和NO2-質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)細(xì)胞形態(tài)相似(圖4-d);SBR出水經(jīng)過(guò)O3氧化20 min后回用的酵母細(xì)胞(圖4-c)與自來(lái)水拌料酵母形態(tài)一致(圖4-a)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NO2-能夠改變釀酒酵母正常細(xì)胞形態(tài),導(dǎo)致細(xì)胞死亡和發(fā)酵過(guò)程受阻,是SBR出水中的主要抑制物,而O3氧化的方法可去除NO2-,避免其對(duì)發(fā)酵的抑制毒性。

a-自來(lái)水;b-SBR出水;c-O3氧化20 min后SBR出水; d-100 mg/L NO2-去離子水圖4 不同處理組中釀酒酵母的FESEM圖Fig.4 FESEM photographs of S. cerevisiae in different groups

2.4.3 NO2-對(duì)酵母影響的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

酵母細(xì)胞的生理代謝與其基因的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)。在NO2-脅迫下,酵母細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境發(fā)生了改變。利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析了NO2-脅迫組與對(duì)照組的代謝差異,并篩選|log2FC|≥1且Q<0.05的基因作為差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)。結(jié)果顯示共檢測(cè)出了299個(gè)DEGs,包括251個(gè)上調(diào)DEGs和48個(gè)下調(diào)DEGs(圖5)。

圖5 DEGs火山圖Fig.5 DEGs volcano map

通過(guò)KEGG功能富集分析發(fā)現(xiàn)(圖6),NO2-脅迫組上調(diào)的部分DEGs富集到了糖酵解途徑。經(jīng)過(guò)NO2-的誘導(dǎo),催化丙酮酸降解為乙醛和CO2的PDC5(編碼丙酮酸脫羧酶)上調(diào)3.65倍。研究表明,乙醛能夠增加酵母對(duì)NO2-的相對(duì)抗性,這意味著PDC5表達(dá)量的提高將促使酵母產(chǎn)生更多的乙醛用以細(xì)胞的解毒[16-17]。TDH2基因編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶,可以催化3-磷酸甘油醛轉(zhuǎn)化為1,3-二磷酸甘油酸[18]。NO2-脅迫組中TDH2基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)了2.06倍,這可能是由于NO2-使釀酒酵母中甘油醛-3-磷酸脫氫酶失活,抑制了糖酵解途徑并導(dǎo)致了ATP耗竭[19],釀酒酵母通過(guò)上調(diào)TDH2的轉(zhuǎn)錄水平維持了細(xì)胞生命活動(dòng)。

a-上調(diào)基因;b-下調(diào)基因圖6 DEGs KEGG富集分析Fig.6 KEGG pathway analysis of DEGs

此外,發(fā)現(xiàn)磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway, PPP)中部分DEGs發(fā)生下調(diào)。PPP是糖代謝的重要途徑,由TKL2編碼的轉(zhuǎn)酮酶可在PPP和糖酵解之間建立可逆聯(lián)系,促進(jìn)NADPH和5-磷酸核糖的合成用于細(xì)胞生長(zhǎng)[20]。脅迫組TKL2的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)了1.37倍,意味著NO2-離子的添加可能造成PPP通量減小,5-磷酸核糖與輔因子NADPH的合成減弱,進(jìn)而影響了細(xì)胞正常代謝。三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle, TCA循環(huán))是三大物質(zhì)轉(zhuǎn)化的樞紐,是生物體將糖類(lèi)等物質(zhì)氧化獲得能量的最有效的途徑[21-22]。其中,用于調(diào)節(jié)TCA循環(huán)速率的關(guān)鍵酶異檸檬酸脫氫酶基因(IDH2)與琥珀酸脫氫酶基因(SDH9)在脅迫組轉(zhuǎn)錄下調(diào),這表明加入NO2-后,TCA循環(huán)的通量減小,進(jìn)而影響了NADH與ATP的合成,抑制了酵母的生命活動(dòng)。以上結(jié)果表明,NO2-脅迫下,釀酒酵母的磷酸戊糖途徑與TCA循環(huán)途徑受到了抑制,進(jìn)而影響了菌體的生長(zhǎng)和乙醇的發(fā)酵。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)SBR出水進(jìn)行水質(zhì)分析,結(jié)合外源添加實(shí)驗(yàn),確定了NO2-是導(dǎo)致SBR出水無(wú)法回用的原因,并揭示了NO2-對(duì)酵母細(xì)胞的毒性機(jī)理,發(fā)現(xiàn) NO2-會(huì)破壞正常的酵母細(xì)胞形態(tài),使酵母的磷酸戊糖途徑與TCA循環(huán)通量減小,從而阻礙細(xì)胞生長(zhǎng),抑制乙醇發(fā)酵。為實(shí)現(xiàn)SBR出水的資源化回用,本文采用O3氧化的方式處理SBR出水,O3在廢水處理領(lǐng)域作為一種常見(jiàn)的處理手段,與離子交換、反滲透膜等廢水處理工藝相比具有成本低廉且綠色無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn),SBR出水中NO2-在氧化作用下被高效轉(zhuǎn)化為NO3-,而NO3-在300 mg/L時(shí)仍不會(huì)對(duì)酵母產(chǎn)生影響,從而避免了對(duì)乙醇發(fā)酵的毒性,確定了O3氧化作為一種經(jīng)濟(jì)高效的處理手段可以將SBR出水回用到乙醇生產(chǎn)中,對(duì)未來(lái)真正實(shí)現(xiàn)燃料乙醇產(chǎn)業(yè)的無(wú)廢清潔生產(chǎn)提供了理論基礎(chǔ)與發(fā)展方向。