潘子怡,毛丙永,唐鑫,張秋香,趙建新,崔樹茂

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

青春雙歧桿菌廣泛分布于動(dòng)物和人類腸道中[1],可以調(diào)節(jié)過氧化氫酶活性和宿主代謝,維持宿主健康[2-3],目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到保健食品、日化用品及化妝品領(lǐng)域。

迄今為止,細(xì)胞周期培養(yǎng)[4]、透析培養(yǎng)[5]、細(xì)胞固定化培養(yǎng)[6]已被開發(fā)用于解決與雙歧桿菌傳統(tǒng)培養(yǎng)相關(guān)的問題。因此,恒pH分批培養(yǎng)法仍然是主流,但雙歧桿菌的培養(yǎng)密度小于1.0×109CFU/mL;初始底物濃度過高時(shí),高濃度的代謝產(chǎn)物和副產(chǎn)物的積累可能導(dǎo)致發(fā)酵體系滲透壓增加引起的細(xì)胞停止生長(zhǎng),從而影響工業(yè)生產(chǎn)。此外,在真空冷凍干燥過程中,隨著降溫速度的變化,未冷凍部分溶液的電解質(zhì)濃度增加也會(huì)產(chǎn)生滲透脅迫抑制雙歧桿菌增殖。我們前期研究發(fā)現(xiàn),菌株發(fā)酵可達(dá)到的最高活菌濃度與其耐滲透壓的能力呈正相關(guān)[7]。但是目前青春雙歧桿菌的發(fā)酵濃度均不高,可能與其滲透壓耐受能力低有關(guān)[8],因此,篩選出能在高滲透壓環(huán)境下生存的青春雙歧桿菌對(duì)其生產(chǎn)和應(yīng)用都具有重要意義。

本研究旨在篩選出能夠耐受高滲透壓的青春雙歧桿菌,同時(shí)還要保證其耐滲透壓能力的遺傳穩(wěn)定性,在發(fā)酵生產(chǎn)中長(zhǎng)期使用。結(jié)合培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)工藝優(yōu)化,進(jìn)一步提高耐高滲青春雙歧桿菌在發(fā)酵液中的活菌數(shù),解決青春雙歧桿菌商業(yè)應(yīng)用中發(fā)酵密度低的難題,同時(shí)在實(shí)際生產(chǎn)中,也有更廣泛的發(fā)展前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青春雙歧桿菌菌株(共94株)均由江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心保藏。

MRS-L培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,牛肉浸膏10,酵母浸粉5,葡萄糖20,CH3COONa 5,吐溫80 1 mL,K2HPO42.0,檸檬酸二銨2.0,MgSO4·7H2O 0.1,MnSO4·H2O 0.05,半胱氨酸磷酸鹽1,pH 6.2～6.4,115 ℃滅菌20 min。原料均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

半胱氨酸磷酸鹽緩沖液(CYS緩沖液,g/L):L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5,Na2HPO46.0,KH2PO44.5,NaCl 4.0,吐溫80 0.6,pH 6.8～7.0,115 ℃滅菌20 min。原料均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

氮源利用偏好性分析培養(yǎng)基(g/L):氮源1,葡萄糖6,K2HPO410,Na2HPO410,MgSO4·7H2O 0.25、MnSO4·H2O 0.05,吐溫80 1 mL,pH 6.0,115 ℃滅菌20 min,其中氮源有:酵母浸粉FM528、安琪大豆蛋白胨FP410、胰蛋白胨、魚骨蛋白胨FP351、牛骨蛋白胨FP326、牛肉浸粉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán),胰酪蛋白胨,上海創(chuàng)賽科技有限公司。

MRS-N培養(yǎng)基:在MRS-L液體培養(yǎng)基中添加NaCl調(diào)節(jié)其滲透壓,1 L MRS-L液體培養(yǎng)基中添加3 g NaCl滲透壓平均增長(zhǎng)100 mOsm/kg。

1.2 儀器與設(shè)備

GRP-9080恒溫培養(yǎng)箱,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;FE20 pH計(jì)、EL3002電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-2450紫外分光光度計(jì),日本島津公司;MS-3-basic渦旋振蕩器,德國(guó)IKA公司;MLS-3750高溫高壓滅菌鍋,日本SANYO公司;ZHJH-C1115B超凈工作臺(tái),上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司;l?ser-om806 m冰點(diǎn)滲透壓測(cè)定儀,德國(guó)l?ser公司;LYOBETA-5PS真空冷凍干燥機(jī),西班牙Telstar公司;RC-BIOS10落地式離心機(jī),賽默飛世爾公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株活化與培養(yǎng)

將-80 ℃冰箱中凍藏的青春雙歧桿菌菌株在MRS固體板上用接種環(huán)劃線接種,在溫度為37 ℃的厭氧工作站生長(zhǎng)36～48 h,挑取單菌落轉(zhuǎn)移至5 mL液體培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧生長(zhǎng)24 h,再以4%接種量傳代至新的液體培養(yǎng)基中,在37 ℃條件下厭氧生長(zhǎng)24 h,連續(xù)活化3～5次作為種子培養(yǎng)液。

1.3.2 耐滲菌株篩選

將菌種連續(xù)活化兩代后的種子培養(yǎng)液,按4%接種量在MRS-L培養(yǎng)基37 ℃厭氧培養(yǎng)18～20 h;將上述步驟得到的培養(yǎng)液按5%的接種量接種到滲透壓為300、500、700、900、1 200、1 400 mOsm/kg的MRS-N液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃厭氧工作站培養(yǎng),測(cè)定菌株穩(wěn)定期時(shí)OD600值。

1.3.3 耐滲透壓能力測(cè)定

將篩選得到的青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066按照4%的接種量分別在滲透壓為300～1 500 mOsm/kg的MRS-N培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)24～36 h,每隔2 h取樣測(cè)定OD600值,根據(jù)生長(zhǎng)曲線計(jì)算對(duì)數(shù)期代時(shí)。

代時(shí)是指菌株在生長(zhǎng)過程中平均每分裂1次所需要的時(shí)間,能夠直接反映生長(zhǎng)的快慢,代時(shí)越短表明生長(zhǎng)的越快。代時(shí)計(jì)算方法為:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的數(shù)據(jù),以菌株生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),以log(OD600值,2)為縱坐標(biāo),繪制曲線,計(jì)算代時(shí),線性斜率倒數(shù)即為代時(shí)。

1.3.4 耐滲透壓能力遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

為進(jìn)一步證實(shí)篩選得到的菌株性狀是否穩(wěn)定遺傳,將青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066首先在較低滲透壓下(500 mOsm/kg)傳代3次,再分別置于對(duì)應(yīng)的耐受滲透壓下進(jìn)行6次連續(xù)傳代培養(yǎng),繪制曲線,測(cè)定穩(wěn)定期的OD600值。將凍存的菌株在-20 ℃保存3個(gè)月,取出后活化2～3代,置于對(duì)應(yīng)的滲透壓培養(yǎng)基下培養(yǎng),測(cè)定穩(wěn)定期OD600值。

1.3.5 氮源利用的偏好性分析

使用氮源利用偏好性分析培養(yǎng)基[9],其中氮源分別為:微生物類氮源、乳基類氮源、植物類氮源和動(dòng)物類氮源,對(duì)照組采用混合氮源(0.2 g/L酵母提取物、0.4 g/L牛肉膏、0.4 g/L胰蛋白胨)。培養(yǎng)基滅菌后按5%比例接種,37 ℃厭氧培養(yǎng),測(cè)定不同氮源下的穩(wěn)定期OD600值及對(duì)數(shù)期代時(shí)。

1.3.6 碳氮消耗比的測(cè)定

使用氮源偏好性培養(yǎng)基,氮源為最佳氮源。以5%接種量接種到各5 mL液體培養(yǎng)基中,在菌株發(fā)酵過程中每隔2 h測(cè)定OD600值和發(fā)酵液中葡萄糖剩余量,計(jì)算生長(zhǎng)速率開始被抑制和完全抑制時(shí)的碳氮消耗比。

1.3.7 生長(zhǎng)限制性微量元素(Mg、Mn)分析

參考氮源利用偏好性培養(yǎng)基配制4組不同微量元素的培養(yǎng)基,其中氮源為最佳氮源。A組:不添加;B組:MgSO4·7H2O 0.25 g/L;C組:MnSO4·H2O 0.05 g/L;D組:MgSO4·7H2O 0.25 g/L,MnSO4·H2O 0.05 g/L。其余成分:最佳氮源1 g/L、葡萄糖6 g/L、K2HPO47 g/L、Na2HPO47 g/L、半胱氨酸1 g/L。調(diào)節(jié)pH 6.4,115 ℃滅菌20 min。按照5%的接種量接入4組培養(yǎng)基中,在厭氧工作站中37 ℃培養(yǎng)至穩(wěn)定期,測(cè)定OD600值。

1.3.8 最適生長(zhǎng)pH的測(cè)定

根據(jù)生長(zhǎng)速率初始被抑制碳氮消耗比和菌株的耐滲透壓能力確定發(fā)酵培養(yǎng)基的初始碳氮源的最適添加量,115 ℃滅菌20 min后,調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為100 r/min,溫度為37 ℃,分別設(shè)置pH值為5.0、5.5、6.0、6.5,以5%的接種量將種子液接種到5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)(培養(yǎng)基為3.5 L),滅菌后N2保壓0.12 MPa,在穩(wěn)定期取樣測(cè)定發(fā)酵液中的活菌數(shù)。

1.3.9 生長(zhǎng)限制性微量元素的最適添加量

使用最佳氮源的氮源利用偏好性分析培養(yǎng)基,其中微量元素質(zhì)量濃度設(shè)置為0.05、0.25、0.75、1.25 g/L,以5%接種量接入菌株至發(fā)酵罐,滅菌后通入N2并保壓0.1 MPa,于最適生長(zhǎng)pH、37 ℃發(fā)酵。每隔2 h取樣測(cè)定OD600值,在穩(wěn)定期測(cè)定發(fā)酵液中的活菌數(shù)。

1.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)了3次,結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用SPSS 22.0軟件(SPSS Inc.,Chicago,Illinois,USA)分析數(shù)據(jù)。并進(jìn)行了單因素方差分析(ANOVA)和DUNCAN多重比較完成了差異顯著性分析,P<0.05值的差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐滲菌株篩選及耐滲透壓能力遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

2.1.1 耐滲菌株的篩選

通過測(cè)定94株青春雙歧桿菌在不同滲透壓條件下的MRS培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),大部分青春雙歧桿菌在滲透壓為900 mOsm/kg時(shí),表現(xiàn)出較差的活力(OD600<0.3),而青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066在1 500 mOsm/kg時(shí),生長(zhǎng)才被完全抑制,因此選取此2株青春雙歧桿菌進(jìn)行下一步研究(圖1)。

2.1.2 耐滲青春雙歧桿菌在不同耐滲透壓條件下的生長(zhǎng)曲線

已有研究表明在中性條件下,雙歧桿菌代謝產(chǎn)生的醋酸和乳酸對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒害作用,滲透壓升高是抑制其生長(zhǎng)的限制性因素[10],所以青春雙歧桿菌培養(yǎng)困難與其滲透壓耐受性差有密切關(guān)系,因此通過測(cè)定耐滲青春雙歧桿菌在不同滲透壓下的生長(zhǎng)情況,明確其耐滲透壓能力。如圖2所示,青春雙歧桿菌CCFM1302在滲透壓低于1 000 mOsm/kg時(shí)生長(zhǎng)速率不受影響,且滲透壓繼續(xù)增高的情況下雖然生長(zhǎng)受到一定程度抑制但沒有被完全抑制,菌株依然可以得到生長(zhǎng);在1 500 mOsm/kg時(shí),生長(zhǎng)曲線斜率趨于0,青春雙歧桿菌CCFM1302生長(zhǎng)完全被抑制。在發(fā)酵過程中,菌株消耗葡萄糖積累酸根,即滲透壓增加,但發(fā)酵前期生物量較少,底物消耗和滲透壓增加亦比較慢,所以培養(yǎng)基濃度控制在不影響菌株生長(zhǎng)的濃度,發(fā)酵前期對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響不大;待菌達(dá)到一定數(shù)量且進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期,糖的消耗和滲透壓的積累是個(gè)較快的增加過程,此時(shí)發(fā)酵體系的滲透壓有可能影響菌的生長(zhǎng),但如果尚未達(dá)到完全抑制滲透壓,對(duì)最高生物量的影響較小。根據(jù)前期研究成果[11-12],該菌要達(dá)到高生物量,需使其發(fā)酵終點(diǎn)滲透壓達(dá)到或略低于1 500 mOsm/kg(生長(zhǎng)速率被抑制時(shí)的滲透壓)。對(duì)于青春雙歧桿菌CCFM1066,在滲透壓低于900 mOsm/kg時(shí),生長(zhǎng)速率不受影響。而在1 500 mOsm/kg時(shí),生長(zhǎng)曲線斜率趨于0,青春雙歧桿菌CCFM1066生長(zhǎng)完全被抑制,因此,為達(dá)到最高生物量,將其培養(yǎng)基的滲透壓提高至使發(fā)酵終點(diǎn)滲透壓達(dá)到或略低于1 500 mOsm/kg。

圖1 青春雙歧桿菌在不同滲透壓下穩(wěn)定期的最大生物量Fig.1 Maximum biomass in stable period of Bifidobacterium adolensentis with different osmolarity

a-CCFM1302生長(zhǎng)曲線;b-CCFM1302生長(zhǎng)代時(shí);c-CCFM1066生長(zhǎng)曲線;d-CCFM1066生長(zhǎng)代時(shí)圖2 青春雙歧桿菌滲透壓生長(zhǎng)曲線和不同滲透壓下生長(zhǎng)代時(shí)Fig.2 The osmotic stress curve and the generation time of B. adolensentis under different osmotic stress conditions 注:不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.1.3 耐滲菌株耐滲透壓能力遺傳穩(wěn)定性

遺傳穩(wěn)定性的間接證據(jù)是不同世代菌株生長(zhǎng)行為的重復(fù)性。在本實(shí)驗(yàn)中,青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066的遺傳穩(wěn)定性均較好,在6次傳代之后,仍表現(xiàn)出相似的生長(zhǎng)行為(圖3-a),表明在馴化之后的菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。從圖3-b可以看出,在-20 ℃凍存3個(gè)月,活化后在高滲濃度下的生長(zhǎng)OD600值依然能達(dá)到2.0以上。綜上得出結(jié)論:青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066的耐滲透壓能力可以穩(wěn)定遺傳。

a-菌株在初始抑制滲透壓下連續(xù)傳代培養(yǎng)生長(zhǎng)情況; b-凍存菌株在初始抑制滲透壓下生長(zhǎng)情況圖3 菌株耐滲透壓能力遺傳穩(wěn)定性Fig.3 Stability of strain for osmolarity tolerance

2.1.4 氮源偏好性分析

傳統(tǒng)培養(yǎng)基中的氮源通常過剩,當(dāng)菌株因培養(yǎng)基中的碳源不足或者滲透壓抑制停止生長(zhǎng)時(shí),就會(huì)導(dǎo)致氮源無(wú)法得到充分利用[11]。因此,不能準(zhǔn)確判定可以有效利用的最佳氮源。因此本實(shí)驗(yàn)采用氮源利用偏好性分析培養(yǎng)基[12],通過提高培養(yǎng)基的碳氮比,同時(shí)確保菌株停止生長(zhǎng)時(shí),培養(yǎng)基中仍有充足的碳源和適宜的pH不會(huì)抑制菌株正常的生長(zhǎng)水平,分析哪種氮源可以被高效利用。

本實(shí)驗(yàn)選取了4大類氮源,使用氮源利用偏好性分析培養(yǎng)基比較青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066對(duì)不同氮源的利用率,結(jié)果如表1所示,除胰酪蛋白胨外,各單一氮源對(duì)青春雙歧桿菌的增殖作用均弱于對(duì)照組,其原因可能是進(jìn)口的胰酪蛋白胨以酪蛋白為基礎(chǔ)進(jìn)行消化,具有較國(guó)內(nèi)其他乳基氮源更好的成分和更優(yōu)的工藝。

表1 不同氮源培養(yǎng)基對(duì)青春雙歧桿菌增殖的影響Table 1 Effects of different nitrogen sources on the proliferation of B.adolensentis

酵母粉中含雙歧桿菌所需的維生素、氨基酸和多肽[13],而胰蛋白胨、牛肉膏只含較多的氨基酸,因此考慮將酵母提取物和胰酪蛋白胨以質(zhì)量比1∶1復(fù)配,比較兩者疊加是否大于單一氮源。如圖4所示,酵母浸粉FM528的添加提高了胰酪蛋白胨的利用效率,雖然在代時(shí)上的差異不顯著,但是菌株生長(zhǎng)至穩(wěn)定期時(shí)OD600值變化明顯;此外,胰酪蛋白胨與酵母提取物復(fù)配氮源與胰酪蛋白胨作為單一氮源相比更具成本效益,因此本實(shí)驗(yàn)使用胰酪蛋白胨與酵母浸粉FM528復(fù)合物作為青春雙歧桿菌的最佳氮源。

a-菌株CCFM1066在復(fù)合氮源中生長(zhǎng)曲線;b-菌株CCFM1066在復(fù)合氮源中生長(zhǎng)代時(shí); c-菌株CCFM1302在復(fù)合氮源中生長(zhǎng)曲線;d-菌株CCFM1302在復(fù)合氮源中生長(zhǎng)代時(shí)圖4 菌株在不同類別氮源下的生長(zhǎng)曲線及對(duì)數(shù)期代時(shí)Fig.4 Growth curve and logarithmic generation time of strain with different types of nitrogen sources

2.1.5 生長(zhǎng)限制性微量元素分析

微量元素是雙歧桿菌中某些酶的重要成分或催化劑,其中大部分是金屬離子,對(duì)酶的活性有關(guān)鍵作用;此外還作為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子發(fā)揮作用[14-15]。已有研究表明Mn2+和Mg2+相較于Fe2+、Zn2+、Ca2+和Cu2+在菌株增殖方面更重要[16];此外,不同于乳桿菌,雙歧桿菌有自己獨(dú)特的雙歧代謝途徑[17]。雙歧桿菌通過果糖-6-磷酸鹽酮糖酶途徑代謝葡萄糖,產(chǎn)生乳酸和乙酸作為主要終產(chǎn)物。果糖-6-磷酸鹽酮糖酶是該途徑的特征酶,Mg2+、Ca2+或Mn2+等離子作為輔助因子促進(jìn)其活性發(fā)揮。此外,雙歧桿菌葡萄糖代謝途徑中的乙酸激酶、葡糖激酶、磷酸甘油酸激酶以及轉(zhuǎn)酮醇酶等關(guān)鍵酶發(fā)揮作用都需要Mg2+作為酶促因子[18],因此本研究挑選Mn2+和Mg2+研究其濃度對(duì)菌株增殖的影響。

由圖5可知,相對(duì)于空白對(duì)照組,只添加MgSO4對(duì)生物量有顯著提升,Mg元素是青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066的限制性微量元素,添加

a-菌株CCFM1302;b-菌株CCFM1066圖5 不同微量元素含量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.5 The effect of different trace element contents on the growth of strain

MgSO4與添加MgSO4+MnSO4菌體的生長(zhǎng)濃度相似,而單獨(dú)添加Mn2+生物量沒有顯著提升,幾乎沒有生長(zhǎng)。因此本實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066時(shí)只添加MgSO4作為微量元素。

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.2.1 碳氮消耗比

通過以上試驗(yàn),明確了菌株生長(zhǎng)所需的最佳碳源和氮源及微量元素。此外,還必須考慮碳氮比對(duì)增殖效率的影響。培養(yǎng)基中碳氮質(zhì)量比一直是高密度培養(yǎng)的重中之重,碳氮比不當(dāng)不僅會(huì)造成底物的浪費(fèi),甚至?xí)绊懢甑纳L(zhǎng)和代謝[19]。王玉林等[20]和高欣偉等[10]的研究已證實(shí),在雙歧桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)中,當(dāng)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源和氮源的比例為生長(zhǎng)速率被抑制時(shí)的碳氮消耗比時(shí)增殖效率最高。

結(jié)果顯示,使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基,青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066在生長(zhǎng)速率被抑制時(shí)的碳氮消耗比分別為(2.71±0.23)∶1和(2.53±0.11)∶1。

2.2.2 最適生長(zhǎng)pH

雙歧桿菌胞內(nèi)涉及碳水化合物和氨基酸代謝的酶在一定的pH范圍內(nèi)活性較高,但有機(jī)酸以未解離分子形式存在是雙歧桿菌分批培養(yǎng)的主要抑制因素[7]。因此調(diào)節(jié)pH,找到最適生長(zhǎng)的pH恒定培養(yǎng),從而最大程度滿足細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。

張瑩[21]和高欣偉等[10]的研究表明,菌株培養(yǎng)要達(dá)到最高增殖效率,以生長(zhǎng)速率被抑制時(shí)的碳氮消耗比及生長(zhǎng)速率被完全抑制時(shí)的滲透壓作為發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)的滲透壓倒推得到青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066培養(yǎng)基中碳氮源的最適添加量分別為:復(fù)合氮源17 g/L,葡萄糖49 g/L;復(fù)合氮源19 g/L,葡萄糖51 g/L,此外添加MgSO4·7H2O 0.25 g/L,半胱氨酸1 g/L、吐溫80 1 mL/L,然后在37 ℃條件下控制不同pH培養(yǎng),研究pH對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)的影響。

圖6的結(jié)果顯示了青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066在pH 5.5的條件下,其發(fā)酵液活菌數(shù)最高,分別達(dá)到了(1.58±0.03)×1010CFU/mL和(1.35±0.05)×1010CFU/mL。另分析了培養(yǎng)過程中發(fā)酵體系滲透壓的變化,在發(fā)酵前期滲透壓未達(dá)到各自的生長(zhǎng)速率抑制滲透壓,菌株生長(zhǎng)不受影響;在發(fā)酵后期,發(fā)酵體系的滲透壓得到較高的增幅,菌株發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066的發(fā)酵體系滲透壓分別為(1 416±12) mOsm/kg和(1 413±17) mOsm/kg,雖對(duì)菌株生長(zhǎng)速率有影響,但未完全抑制其生長(zhǎng)。測(cè)定了發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)殘?zhí)堑暮?分別為(2.42±0.21) g/L和(1.53±0.53) g/L,說明培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分得到了高效利用。

a-菌株CCFM1302;b-菌株CCFM1066圖6 菌株CCFM1302和CCFM1066在不同 pH下發(fā)酵活菌數(shù)Fig.6 The number of viable strains at different pH for CCFM1302 and CCFM1066

2.2.3 最適微量元素添加量

Mg是青春雙歧桿菌的限制性微量元素,而高密度發(fā)酵中微生物濃度會(huì)不斷增加,所以有必要確定是否需要更高濃度的鎂來確保關(guān)鍵酶持續(xù)活性。本研究通過添加不同濃度的MgSO4·7H2O,探究其濃度與活菌數(shù)的關(guān)系。由于在氮源利用偏好性分析培養(yǎng)基中MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度為0.25 g/L,以此為參照,設(shè)置4個(gè)梯度,進(jìn)行分批發(fā)酵罐培養(yǎng),由圖7可知,隨著Mg2+濃度升高,其生長(zhǎng)趨勢(shì)逐漸增加。因此,Mg是青春雙歧桿菌培養(yǎng)環(huán)境中的關(guān)鍵微量元素,當(dāng)MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度為0.25 g/L時(shí),青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066發(fā)酵液活菌數(shù)最高,分別達(dá)到了(1.82±0.08)×1010CFU/mL和(1.70±0.03)×1010CFU/mL。因此,在青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066的培養(yǎng)基中添加0.25 g/L的MgSO4·7H2O較為合適。

a-菌株CCFM1302;b-菌株CCFM1066圖7 菌株CCFM1302和CCFM1066在不同微量元素 濃度下發(fā)酵活菌數(shù)Fig.7 The number of viable strains at different concentration of trace element for CCFM1302 and CCFM1066

3 結(jié)論

大部分青春雙歧桿菌在滲透壓為900 mOsm/kg時(shí),表現(xiàn)出較差的活力(OD600<0.3),而本文篩選得到的青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066最高可耐受1 400 mOsm/kg;其對(duì)不同氮源的利用程度不同,單一氮源中胰酪蛋白胨增殖效果最佳,若將胰酪蛋白胨與富含生長(zhǎng)因子的酵母浸粉FM528復(fù)配可以得到最高的利用效率;此外,菌株最大生物量與Mg2+濃度有關(guān);青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066的最佳生長(zhǎng)pH值均為5.5;青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066的生長(zhǎng)速率被抑制時(shí)的碳氮消耗比分別為(2.71±0.23)∶1、(2.53±0.11)∶1。

因此,通過菌株生長(zhǎng)速率被完全抑制時(shí)滲透壓及生長(zhǎng)速率被抑制時(shí)的碳氮消耗比倒推得到的青春雙歧桿菌CCFM1302和CCFM1066的最適底物濃度為分別為:復(fù)合氮源21.0 g/L,葡萄糖57.0 g/L;復(fù)合氮源22.4 g/L,葡萄糖56.5 g/L,此外添加MgSO4·7H2O 0.25 g/L,半胱氨酸1 g/L、吐溫80 1 mL/L。在該濃度下的底物發(fā)酵結(jié)束時(shí)代謝產(chǎn)生的酸根積累引起的滲透壓升高達(dá)到菌株完全抑制滲透壓(1 500 mOsm/kg)。若底物含量高于該濃度,菌株停止生長(zhǎng)時(shí)尚有底物未利用,不僅浪費(fèi)且初始濃度的底物也會(huì)引起滲透壓升高不利于菌株生長(zhǎng);若底物含量低于該濃度,菌株停止生長(zhǎng)時(shí)是因?yàn)榈孜锊粔?因此活菌濃度達(dá)不到最高。在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下,發(fā)酵液活菌數(shù)可達(dá)到(1.82±0.08)×1010CFU/mL和(1.70±0.03)×1010CFU/mL。