吳子鎣,李榮旭,白少鈺,胡浩軒,黃佳俊,盧宇靖

1(佛山市匯騰生物技術(shù)有限公司,廣東 佛山,528225)2(廣東工業(yè)大學(xué) 生物醫(yī)藥學(xué)院,廣東 廣州,510006)

亞胺還原酶(imine reductase,IRED)是一種立體選擇性極高、底物選擇性廣泛、轉(zhuǎn)化效率極高、反應(yīng)條件溫和的氧化還原酶[1-2]。在輔酶NADPH參與下,可將前手性的亞胺不對稱合成為相應(yīng)的手性胺,可用于手性伯胺、仲胺和叔胺產(chǎn)物的合成[3-4]。亞胺還原酶通過實(shí)現(xiàn)碳氮雙鍵間的不對稱加成反應(yīng),滿足許多藥物分子和農(nóng)藥的關(guān)鍵中間體的生物合成[5-7]。通過分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)等現(xiàn)代生物技術(shù),異源表達(dá)獲得的亞胺還原酶,可催化多種環(huán)亞胺反應(yīng)合成S型或R型的手性胺。

高密度發(fā)酵(high cell density cultivation,HCDC)指在一定培養(yǎng)條件下,應(yīng)用一定的培養(yǎng)技術(shù)和設(shè)備,盡可能地提高菌體的生物量,獲得較高的外源蛋白產(chǎn)量。高密度發(fā)酵可以提高單位體積發(fā)酵液中菌體的生物量,提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率以相應(yīng)的減少發(fā)酵罐的體積,縮短生產(chǎn)周期,降低生產(chǎn)成本,提高生產(chǎn)效率[8-13]。大腸桿菌的培養(yǎng)環(huán)境簡單、生長周期短、成本低,具有清晰的遺傳背景,是目前合成生物學(xué)領(lǐng)域中研究最成熟的表達(dá)系統(tǒng)之一[14-17],因此選用大腸桿菌作為重組亞胺還原酶的宿主有利于其工業(yè)化生產(chǎn)制備。

亞胺還原酶用于亞胺還原反應(yīng),該步驟離不開還原型輔酶的參與,而輔酶價(jià)格昂貴,導(dǎo)致工業(yè)化生產(chǎn)成本激增。實(shí)際上,工業(yè)化進(jìn)行生物法亞胺還原反應(yīng)往往會利用合成生物學(xué)手段構(gòu)建能實(shí)現(xiàn)體內(nèi)或者體外的輔酶再生系統(tǒng)以提供輔酶,而在構(gòu)建體內(nèi)輔酶再生系統(tǒng)時(shí),除了要考慮亞胺還原酶本身的酶活力和產(chǎn)量外,還需要考慮再生系統(tǒng)的活力,因此,本研究綜合考慮酶活力和酶產(chǎn)量對高密度發(fā)酵進(jìn)行“快速”探究,通過2 L發(fā)酵體系對自建菌株BL21(DE3)/pET-28a-IRED進(jìn)行發(fā)酵種子液接種量和誘導(dǎo)條件優(yōu)化,確定了不同的接種量、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)溫度對亞胺還原酶酶活力的影響,并在50 L發(fā)酵罐上進(jìn)行20 L發(fā)酵體系放大,為酶促反應(yīng)制備手性胺的工業(yè)化提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株BL21(DE3)/pET-28a-IRED由本公司構(gòu)建和保藏。

酵母提取物,Oxoid;胰蛋白胨,生工生物工程(上海)股份有限公司;瓊脂,BioFroxx;硫酸銨、七水合硫酸鎂、一水合硫酸錳,西隴科學(xué)股份有限公司;NaCl、葡萄糖、KH2PO4,廣東光華科技股份有限公司;玉米漿干粉,北京鴻潤寶順科技有限公司;FeSO4·7H2O、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactoside,IPTG)和硫酸卡那霉素,上海麥克林生化科技股份有限公司。

LB培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5、胰蛋白胨10、NaCl 5,固體培養(yǎng)基加入20 g/L瓊脂,121 ℃滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40、(NH4)2SO42、KH2PO42、MgSO4·7H2O 1、酵母提取物20、玉米漿干粉2、FeSO4·7H2O 0.08、MnSO4·H2O 0.08,115 ℃滅菌20 min,滅菌后冷卻加入終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的硫酸卡那霉素。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40、(NH4)2SO41.8、KH2PO43、MgSO4·7H2O 2、酵母提取物1、玉米漿干粉2、FeSO4·7H2O 0.08、MnSO4·H2O 0.08,115 ℃滅菌20 min,滅菌后冷卻加入終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的硫酸卡那霉素。

1.2 儀器與設(shè)備

DGLS-35B立式蒸汽滅菌器,江蘇登冠醫(yī)療器械有限公司;5 L發(fā)酵罐、三聯(lián)5 L發(fā)酵罐、50 L發(fā)酵罐,上海保興生物設(shè)備工程有限公司;UV755B紫外可見光光度計(jì),上海佑科儀器儀表有限公司;HP/Agilent 1100高效液相色譜儀,美國Agilent公司。其余儀器設(shè)備如超凈工作臺、培養(yǎng)箱、搖床等為常規(guī)微生物實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 種子液培養(yǎng)

取20 ℃保藏的BL21(DE3)/pET28aIRED甘油菌在LB固體培養(yǎng)基上劃線,37 ℃倒置培養(yǎng)16 h;挑取單菌落于2 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)6 h,得到一級種子液。一級種子液按1%接種量接種至200 mL種子培養(yǎng)基中,37 ℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,獲得二級種子液。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)

將二級種子液按10%接種量接種至5 L發(fā)酵罐(發(fā)酵體系為2 L),初始轉(zhuǎn)速為200 r/min,溫度為37 ℃,通氣量為4 L/min,罐壓為0.05 MPa,pH值為7,開啟pH自動(dòng)調(diào)節(jié)、消泡劑自動(dòng)感應(yīng)、轉(zhuǎn)速自動(dòng)控制和溫度自動(dòng)控制,用14%(體積分?jǐn)?shù))氨水調(diào)節(jié)pH值。當(dāng)溶氧下降到30%以下時(shí),設(shè)置溶氧串級轉(zhuǎn)速,使溶氧值保持在30%～35%。當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到800 r/min,溶氧回升時(shí),開始向發(fā)酵體系中恒速流加800 g/L葡萄糖溶液,流加速度為10 mL/h。當(dāng)OD600值達(dá)到12時(shí),降溫至20 ℃,并加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。當(dāng)OD600值下降10個(gè)單位時(shí),結(jié)束發(fā)酵。

1.3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

優(yōu)化種子液接種量:種子液分別以4%、6%、8%、10%和12%的接種量接種到發(fā)酵體系中,其他條件保持不變,測定發(fā)酵結(jié)束時(shí)OD600值和酶活力。

優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)機(jī):發(fā)酵過程中,分別在OD600達(dá)到12、30、50時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo),其他條件保持不變,測定發(fā)酵結(jié)束時(shí)OD600值和酶活力。

優(yōu)化誘導(dǎo)劑使用量:誘導(dǎo)階段,IPTG終濃度分別為0.1、0.4、0.8 mmol/L,其他條件保持不變,測定發(fā)酵結(jié)束時(shí)OD600值和酶活力。

優(yōu)化誘導(dǎo)溫度:誘導(dǎo)階段,設(shè)置誘導(dǎo)溫度分別為16、20、25、30、37 ℃,其他條件保持不變,測定發(fā)酵結(jié)束時(shí)OD600值和酶活力。

所有試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行,所得數(shù)據(jù)為3個(gè)平行試驗(yàn)的均值。所得數(shù)據(jù)利用Origin 9.0繪制。

1.3.4 檢測方法

菌體濃度測定:吸取適量菌液,稀釋后控制吸光度在0.2～0.8,用分光光度計(jì)測定該菌液在波長600 nm處的吸光值(OD600值)。

酶活力測定:亞胺還原酶活力單位定義為:在30 ℃、pH值為7.5條件下,每分鐘消耗1 μmol麥斯明所需的粗酶量為1個(gè)活力單位(U/g)。

亞胺還原酶活力反應(yīng)體系(mg/mL):麥斯明0.5,葡萄糖0.925,亞胺還原酶全細(xì)胞25,GDH(商業(yè)用酶)0.005,NAD 0.022 5,0.1 mol/L磷酸鹽溶液作緩沖液,30 ℃,200 r/min,反應(yīng)0.5 h。

液相檢測方法:采用高效液相色譜法測定麥斯明含量,色譜條件如下:流動(dòng)相A為pH值9.5的0.15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))乙酸氨,流動(dòng)相B為100%乙腈,色譜柱為Xtimate C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),檢測波長:254 nm,流速1 mL/min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量5 μL,梯度洗脫,梯度情況見表1。

表1 高效液相色譜法檢測麥斯明含量梯度洗脫流動(dòng)相情況Table 1 Gradient elution conditions for the detection of myosmine content by high-performance liquid chromatography

1.3.5 擴(kuò)大發(fā)酵體系至20 L

根據(jù)1.3.3節(jié)優(yōu)化的發(fā)酵條件,其他條件不變,將發(fā)酵體系擴(kuò)大至20 L,比較2 L發(fā)酵體系和20 L發(fā)酵體系的發(fā)酵情況,測定發(fā)酵結(jié)束時(shí)OD600值和酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 接種量優(yōu)化

發(fā)酵體系中接種量對BL21(DE3)/pET-28a-IRED菌體生物量和酶活力的影響,結(jié)果見圖1。菌體生物量隨著接種量增高而增高。有文獻(xiàn)表明,接種量較低時(shí),菌體生長緩慢,在相同時(shí)間內(nèi)菌體生物量的積累較低,導(dǎo)致酶產(chǎn)量降低,酶活力較低;接種量較高時(shí),菌體對新環(huán)境的適應(yīng)能力增強(qiáng),菌體快速繁殖,產(chǎn)量高,酶活力較高[8],與本研究結(jié)果一致。雖然12%接種量的菌體生物量最高,但與10%接種量的酶活力差異不明顯,且考慮到繁殖速度過快,菌體會提早進(jìn)入衰老,發(fā)生自溶而影響發(fā)酵效果[18],確定10%為最佳接種量。

圖1 接種量對IRED菌體生物量和酶活力的影響Fig.1 Effects of inoculation amount on the biomass and enzyme activity of IRED strains

2.1.2 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對IRED表達(dá)量的影響

誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對BL21(DE3)/pET-28a-IRED菌體生物量和酶活力的影響,結(jié)果見表2。分別在OD600值達(dá)到12、30和50時(shí)加入0.4 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),誘導(dǎo)溫度為20 ℃,誘導(dǎo)16 h后測定酶活力。結(jié)果表明,誘導(dǎo)時(shí)機(jī)較晚時(shí),雖然獲得的菌體量大,但菌體過老,代謝緩慢,導(dǎo)致蛋白表達(dá)量下降,酶活力降低;而誘導(dǎo)時(shí)機(jī)較早時(shí),雖然低溫誘導(dǎo)導(dǎo)致菌體生長遲緩,獲得的菌體量較低,但單位酶活性好,發(fā)酵時(shí)間短。綜合時(shí)間、用電等成本,以及達(dá)到快速高密度發(fā)酵的目的,最終確定最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為OD600值達(dá)到12 h。

表2 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對IRED菌體濃度和酶活力的影響Table 2 Effects of induction timing on the cell density and enzyme activity of IRED strains

2.1.3 誘導(dǎo)劑使用量對IRED表達(dá)量的影響

誘導(dǎo)劑IPTG的使用量對BL21(DE3)/pET28a-IRED菌體生物量和酶活力的影響,結(jié)果見表3。IPTG的終濃度與菌體生物量相關(guān),IPTG使用量過低,誘導(dǎo)效果較差,蛋白表達(dá)不足,導(dǎo)致酶活力下降;而IPTG使用量過高時(shí),對菌體有毒害作用,并且會增加異源蛋白錯(cuò)誤折疊的概率,導(dǎo)致非可溶性蛋白增加,增加菌體生長負(fù)擔(dān),進(jìn)而使菌體生長緩慢,最終得到較低的生物量[19-21],因此確定最佳的誘導(dǎo)劑IPTG使用量為0.4 mmol/L。

表3 IPTG終濃度對IRED菌體生物量和酶活力的影響Table 3 Effects of final IPTG concentration on the biomass and enzyme activity of IRED strains

2.1.4 誘導(dǎo)溫度對IRED表達(dá)量的影響

誘導(dǎo)溫度對BL21(DE3)/pET28a-IRED菌體生物量和酶活力的影響,結(jié)果見表4。誘導(dǎo)溫度為20 ℃時(shí)IRED酶活力最高,16 ℃誘導(dǎo)酶活力次之。37 ℃誘導(dǎo)雖獲得最大的生物量,但酶活力較低,推測是溫度過高,雖有利于菌體生長,但菌體生長過快不利于蛋白表達(dá),導(dǎo)致重組蛋白錯(cuò)誤折疊,從而形成包涵體,酶活力下降,而且溫度過高也會導(dǎo)致菌體提早衰老[22-23]。而過低溫度誘導(dǎo)時(shí)菌體生物量降低,菌體生長緩慢,發(fā)酵結(jié)束時(shí)酶活力不高,這可能是因?yàn)榈蜏卣T導(dǎo)延緩菌體生長,延長蛋白的表達(dá)時(shí)間,有利于增加外源蛋白的表達(dá),同時(shí)低溫表達(dá)可以降低多肽的合成速度,提供充裕的時(shí)間用于肽鏈正確空間折疊,在一定程度上減少無生物活性的包涵體的形成[24-25]。因此,確定誘導(dǎo)溫度20 ℃為最佳誘導(dǎo)溫度。

表4 誘導(dǎo)溫度對IRED菌體濃度和酶活力的影響Table 4 Effects of induction temperature on the cell density and enzyme activity of IRED strains

2.2 擴(kuò)大發(fā)酵體系至20 L

根據(jù)2 L發(fā)酵罐優(yōu)化得到的發(fā)酵條件,進(jìn)行20 L放大發(fā)酵培養(yǎng),并比較2 L和20 L發(fā)酵體系的發(fā)酵結(jié)果。如圖2所示,20 L發(fā)酵體系在發(fā)酵12 h時(shí)(誘導(dǎo)3 h),酶活力隨著時(shí)間逐漸上升,并在發(fā)酵21 h時(shí)(誘導(dǎo)12 h)酶活力達(dá)到最高,為4.56 U/g;隨后在發(fā)酵22 h(誘導(dǎo)13 h)后酶活力開始下降,在發(fā)酵24 h(誘導(dǎo)15 h)時(shí)酶活力趨于穩(wěn)定至發(fā)酵結(jié)束。20 L發(fā)酵體系發(fā)酵結(jié)果與2 L發(fā)酵體系基本一致,說明發(fā)酵體系放大成功,為進(jìn)一步放大發(fā)酵體系以實(shí)現(xiàn)亞胺還原酶快速高產(chǎn)量制備的工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

圖2 2 L/20 L發(fā)酵體系生長曲線和酶活力變化情況Fig.2 Growth curve and enzyme activity changes in 2 L/20 L fermentation system

3 結(jié)論與討論

亞胺還原酶可用于合成手性胺,手性胺廣泛存在于天然產(chǎn)物、農(nóng)業(yè)化學(xué)品、臨床藥物和表面活性劑中,在醫(yī)藥領(lǐng)域,超過70%藥物是手性胺及其衍生物,在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域,存在手性胺結(jié)構(gòu)單元的農(nóng)用化學(xué)品約20%[26-27]。目前,未見有通過高密度發(fā)酵培養(yǎng)重組菌制備亞胺還原酶的報(bào)道。本研究先對2 L發(fā)酵體系制備亞胺還原酶進(jìn)行接種量、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)溫度對重組菌的生物量和亞胺還原酶的酶活力進(jìn)行研究,確定本研究自行構(gòu)建的BL21(DE3)/pET-28a-IRED重組菌發(fā)酵最佳接種量為10%,最佳誘導(dǎo)條件為當(dāng)OD600值達(dá)到12時(shí),在20 ℃下加入終濃度為0.4 mmol/L IPTG,以此條件放大至20 L發(fā)酵體系進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),發(fā)酵結(jié)束時(shí)(發(fā)酵21 h,誘導(dǎo)12 h)菌體生物量OD600值為74,酶活力為4.56 U/g。發(fā)酵條件的優(yōu)化以及20 L擴(kuò)發(fā)發(fā)酵的順利進(jìn)行,為進(jìn)一步放大發(fā)酵體系以實(shí)現(xiàn)亞胺還原酶快速高產(chǎn)量制備的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。