王香，張?jiān)?，陳炫宜，楊怡然，洪肖?/p>

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 610075)

2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM)是由于胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能缺陷導(dǎo)致血糖升高的一種慢性疾病。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟[1]發(fā)布的《全球糖尿病地圖(第10版)》數(shù)據(jù)顯示，2021年全球成年糖尿病患者人數(shù)達(dá)到5.37億，且此病引發(fā)的大血管病變、微血管病變等并發(fā)癥的致殘率和致死率逐年上升，已成為人類健康的第三大“殺手”[2- 3]。胰島素抵抗(IR)作為2型糖尿病的核心病理機(jī)制，改善IR是目前治療 T2DM 糖代謝紊亂的重要切入點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗的發(fā)生主要與各種促炎或氧化應(yīng)激介質(zhì)誘導(dǎo)的特異性炎癥反應(yīng)有關(guān)，尤其是促炎細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素1β(IL- 1β)、白細(xì)胞介素6(IL- 6)、腫瘤壞死因子α(TNF- α)、大量趨化因子(MCP- 1)等[4]，認(rèn)為T2DM是一種炎性疾病的狀態(tài)[5]。慢性炎癥會(huì)導(dǎo)致糖脂代謝紊亂、加劇胰島素抵抗而加速T2DM進(jìn)程[6- 7]。

針灸治療T2DM療效確切，能有效控制血糖。薈萃分析[8- 9]表明針灸有較好的降糖效果，可降低患者血糖、血脂水平，改善糖化血紅蛋白水平。同時(shí)針灸操作簡(jiǎn)單、方便，費(fèi)用低廉、療效顯著、無副作用的特點(diǎn)在 T2DM 慢病管理中具有顯著優(yōu)勢(shì)[10]。2003年世界衛(wèi)生組織便認(rèn)可針灸是治療T2DM可行的有效手段之一，但目前針灸降糖機(jī)制尚不完全明確。大量研究顯示，針灸改善胰島素抵抗療效顯著[11- 12]，但針刺是否通過改善慢性炎癥從而緩解胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)、降低血糖尚未可知。因此本研究選用SD雄性大鼠為研究對(duì)象，以電針刺激“足三里”“三陰交”“胃脘下俞”等穴位為干預(yù)手段，通過觀察電針對(duì) T2DM大鼠血糖、胰島素抵抗以及MCP- 1、TNF- α、IL- 6、IL- 1β、TGF- β1、IL- 10等炎癥因子水平的影響，探討電針改善T2DM糖脂代謝紊亂的潛在機(jī)制，為針灸治療T2DM提供更多的科學(xué)研究證據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，鼠齡2月，由北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為【SCXK(京)2019- 0008】。全部大鼠飼養(yǎng)于恒溫(23±1)℃，相對(duì)濕度50%- 60%，12 h光照與12 h黑暗交替循環(huán)，所有動(dòng)物均自由攝食飲水。該實(shí)驗(yàn)方案已得到成都森威動(dòng)物中心動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器及試劑

儀器：華佗牌一次性無菌0.20 mm× 25 mm針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，華佗 SDZ- II 型電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，冷凍高速離心機(jī)(Minispin plus/Eppendorf)，孵育箱(賽默飛世爾科技)，酶標(biāo)儀(RT- 6100/Rayto)，石蠟切片機(jī)(RM2245/ Leica)，Image J 圖像分析軟件(美國(guó) NIH)，血糖試條及血糖儀(GA- 3/三諾官方旗艦店)。

試劑：STZ(Sigma 公司，美國(guó)，貨號(hào)：102559123)、ELISA試劑盒HbAc、TG、FINS、TNF- α、IL- 6、IL- 1β、MCP- 1、TGF- β1、IL- 10(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，中國(guó)，貨號(hào)分別為：MM- 21055R1、MM- 0610R1、MM- 0690R1、MM- 0180R1、MM- 0190R1、MM- 0047R1、MM- 0099R1、MM- 0181R1、MM- 0195R1)，4%多聚甲醛溶液(武漢塞維爾生物科技有限公司，中國(guó)，貨號(hào)：BL539A)、蘇木精- 伊紅染色液(北京索萊寶科技有限公司中國(guó)，貨號(hào)：G1140)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 T2DM大鼠模型的建立及分組

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，采用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為空白組8只和造模組16只。空白組予普通飼料并灌胃0.9%氯化鈉溶液 3 mL/d，造模組予高脂高糖飼料并灌胃高脂高糖乳劑3 mL/d，連續(xù)喂養(yǎng) 4周后，進(jìn)行腹腔注射2%鏈脲佐菌素30 mg/kg(溶于 0.1 mol/L 的檸檬酸- 檸檬酸鈉配制成 1%的溶液，pH值為4.2- 4.5)，同時(shí)空白組大鼠注射同樣體積的緩沖液。注射STZ 72 h 后，進(jìn)行OGTT及隨機(jī)血糖檢測(cè)，兩次隨機(jī)血糖值均大于 16.7 mmol/L 且 OGTT 實(shí)驗(yàn) 2 h的血糖值大于11.1 mmol/L 表示 T2DM 造模成功。16只造模成功的大鼠隨機(jī)分為T2DM 模型組(模型組)8只、T2DM 模型電針組(電針組)8 只。

2.2 干預(yù)方式

本研究針刺干預(yù)選用足三里、三陰交、胃脘下俞三個(gè)腧穴，穴位參照國(guó)家經(jīng)穴部頒標(biāo)準(zhǔn)(GB12346- 90)及《中國(guó)獸醫(yī)針灸學(xué)》定位取穴，選用0.20 mm× 25 mm一次性毫針，毫針刺入3- 5 mm后針柄接電極，電針治療采用連續(xù)波，頻率為 10 Hz，強(qiáng)度 1.5- 2 mA(以引起大鼠肌肉輕微抖動(dòng)為宜)，留針30 min，1次/d，連續(xù)治療6 d為1個(gè)療程，休息1 d，共治療4個(gè)療程?？瞻捉M、模型組同一時(shí)間進(jìn)行抓取固定，不進(jìn)行干預(yù)。

2.3 標(biāo)本采集及指標(biāo)監(jiān)測(cè)

2.3.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)期間對(duì)各組大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、毛發(fā)色澤、飲水量、飲食量、尿量等進(jìn)行觀察。

2.3.2 體質(zhì)量、空腹血糖及糖耐量檢測(cè)

使用電子天平每周測(cè)量一次大鼠空腹體重(前一晚 22∶00- 次日早 8∶00禁食)，使用一次性血糖試紙測(cè)空腹血糖(次日早8∶00)并記錄；腹腔注射STZ 72 h后及干預(yù)完成后，各組大鼠禁食12 h，進(jìn)行糖耐量檢測(cè)(OGTT)。

2.3.3 觀察各組大鼠胰腺組織HE染色病理切片

干預(yù)結(jié)束后處死各組大鼠，解剖后迅速采樣胰腺組織置于4%多聚甲醛中固定，24小時(shí)后通過常規(guī)脫水、浸漬、石蠟包埋制作切片，并進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察胰腺組織結(jié)構(gòu)變化，觀察胰島細(xì)胞的病理性改變。

2.3.4 ELISA法檢測(cè)各組大鼠糖化血紅蛋白、甘油三酯、空腹胰島素及血清炎癥因子表達(dá)水平

稱重后用2%戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)腹腔注射麻醉。大鼠完全麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，收集大鼠血漿，肝素鈉抗凝，靜置30 min，3000 r·min-1，離心半徑14 cm，4℃離心 15 min，取上層血清用于ELISA檢測(cè)。使用ELISA試劑盒，嚴(yán)格按照說明書檢測(cè)大鼠糖化血紅蛋白(HbAc)、甘油三酯(TG)及空腹胰島素(FINS)、TNF- α、IL- 6、IL- 1β、MCP- 1、IL- 10、TGF- β1等炎癥因子含量。計(jì)算各組大鼠胰島素抵抗指數(shù)HOMA- IR=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠一般情況及行為學(xué)觀察

4個(gè)療程干預(yù)后，空白組大鼠精神狀態(tài)佳，動(dòng)作敏捷，毛發(fā)光亮，飲食、二便正常。模型組大鼠精神倦怠，反應(yīng)遲鈍，毛色晦暗而粗糙、易脫落，同時(shí)日飲食量、日飲水量、尿量增多及體重逐漸消瘦，表現(xiàn)典型的T2DM 大鼠的多飲、多食、消瘦的癥狀。電針組大鼠精神狀態(tài)、反應(yīng)靈敏度明顯改善，大鼠日飲水量、日飲食量、尿量有所改善，體重減輕不明顯。見圖1。

注：A為空白組、B為模型組、C為電針組

3.2 各組大鼠實(shí)驗(yàn)干預(yù)前后的體重、血糖及OGTT變化

造模后，與空白組相比，模型組和電針組體重較重(P<0.05)，模型組與電針組之間體重?zé)o統(tǒng)計(jì)意義；干預(yù)4周后，與空白組相比，模型組體重明顯降低(P<0.01)，電針組體重有所減輕(P<0.05)；與模型組相比，電針組體重較高(P<0.05)；各組治療前后均有差異。見圖2。

注：與空白組比較，*P<0.05；與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；與治療前相比，△P<0.05；與治療前相比，△△P<0.01

造模72 h后，模型組及電針組大鼠血糖及OGTT AUC明顯高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，血糖值>16.7 mmol/L 且 OGTT 實(shí)驗(yàn)2 h血糖>11.1 mmol/L，說明模型建立成功，模型組與電針組之間無顯著差異(P>0.05)；干預(yù)4周后，與空白組相比，模型組血糖及OGTT AUC明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，電針組大鼠血糖及OGTT AUC有所降低(P<0.05)；且電針組血糖及OGTT AUC較治療前有所降低(P<0.05)。見圖2。

3.3 各組大鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)的變化觀察

正常組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)完整，胰島呈規(guī)則的橢圓形，邊界清晰，胰島內(nèi)β細(xì)胞豐富均勻、形態(tài)飽滿、排列緊密，未見明顯病理變化；模型組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)不完整，胰島形態(tài)不規(guī)則，邊緣模糊，胰島面積縮小，胰島內(nèi)β細(xì)胞減少、排列紊亂，分布不均，部分變形；電針組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)較完整，胰島邊界清晰，胰島面積及β細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)，且β細(xì)胞數(shù)目較模型組增多。見圖3。

注：A為空白組100×，B為模型組100×，C為電針組100×，D為空白組400×，E為模型組400×，F(xiàn)為電針組400×；黑色箭頭示胰島β細(xì)胞

3.4 各組大鼠HbAc、TG、FINS及HOMA- IR 的比較

干預(yù)后，與空白組相比，模型組HbAc及TG含量升高(P<0.05)；與模型組相比，電針組HbAc、TG含量有所降低(P<0.05)，與空白組比較無顯著性差異(P>0.05)。見圖4。

注：與空白組比較，*P<0.05；與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；與模型組比較，## P<0.01

電針4周后，與空白組相比，模型組FINS含量顯著升高(P<0.01)，電針組FINS含量有所升高(P<0.05)，與模型組相比，電針組FINS含量降低(P<0.05)；進(jìn)一步分析計(jì)算各組大鼠HOMA- IR 值，結(jié)果顯示：與空白組相比，模型組及電針組的HOMA- IR 值顯著升高(P<0.01)，與模型組相比，電針組 HOMA- IR 值顯著降低(P<0.01)。見圖4。

3.5 各組大鼠血清MCP- 1、TNF- α、IL- 6、IL- 1β、TGF- β1、IL- 10炎癥因子表達(dá)水平的比較

促炎因子結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組MCP- 1、TNF- α、IL- 1β含量明顯升高(P<0.01)，模型組IL- 6及電針組MCP- 1、TNF- α、IL- 6較于空白組有所升高(P<0.05)；與模型組相比，電針組的MCP- 1、TNF- α、IL- 6、IL- 1β有所降低(P<0.05)?？寡滓蜃咏Y(jié)果顯示，與模型組相比電針組的TGF- β1含量(P<0.01)、IL- 10含量(P<0.05)升高，見圖5。

注：與空白組比較，*P<0.05；與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05；與模型組比較，##P<0.01

4 討論

糖尿病屬中醫(yī)學(xué)“消渴”的范疇，古籍關(guān)于其記載頗豐，最早出現(xiàn)在《黃帝內(nèi)經(jīng)》的《素問·奇病論篇》中：“有病口甘者，病名為何？何以得之？岐伯曰：此五氣之溢也，名曰脾癉?！盵13]針灸治療本病歷史悠久，在《針灸甲乙經(jīng)》中已有治療糖尿病的取穴記載，如：“陰氣不足，熱中消谷善饑，腹熱身煩狂言，三里主之；嗜臥，四肢不欲動(dòng)搖，身體黃，灸五里，左取右，右取左?！盵14]說明本病與脾胃關(guān)系密切。本研究選穴基于古籍記載及相關(guān)數(shù)據(jù)挖掘[15- 16]，發(fā)現(xiàn)足三里、三陰交、胃脘下俞治療2型糖尿病臨床使用頻率較高且療效確切。足三里為足陽明胃經(jīng)的合穴和下合穴，是胃經(jīng)經(jīng)氣匯聚之處，對(duì)于脾胃的推動(dòng)和氣血運(yùn)行具有較好的作用；三陰交為肝脾腎三經(jīng)交會(huì)穴，可調(diào)補(bǔ)肝腎、調(diào)理氣血、疏經(jīng)通絡(luò)；胃脘下俞為背俞穴，中醫(yī)認(rèn)為背俞穴與相應(yīng)的器官之間存在體表- 神經(jīng)階段- 內(nèi)臟聯(lián)系，本穴處于第八胸椎棘突下后正中線旁開1.5寸，該穴所處位置有支配胰腺的神經(jīng)傳入，且該穴是治療糖尿病的經(jīng)驗(yàn)穴。結(jié)合團(tuán)隊(duì)前期研究基礎(chǔ)[17]，發(fā)現(xiàn)電針雙側(cè)足三里、三陰交和胃脘下俞穴可改善 T2DM 大鼠糖代謝紊亂和胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。

胰島素抵抗是引發(fā) T2DM 的始動(dòng)因素，發(fā)生胰島素抵抗后，機(jī)體對(duì)葡萄糖的攝取利用降低，血糖持續(xù)升高，機(jī)體代償性的分泌過多胰島素從而導(dǎo)致高胰島素血癥，并進(jìn)一步導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生發(fā)展[18]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，約24.4%的糖尿病患者是由胰島素抵抗所致[19]。因此，研究胰島素抵抗的病理機(jī)制及改善胰島素抵抗尤為重要。已有研究表明電針能夠調(diào)控線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白，增加T2DM大鼠葡萄糖代謝能力以減輕胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)[20]；針刺通過胰腺內(nèi)在神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)調(diào)節(jié)，增加膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶和神經(jīng)肽Y表達(dá)，促進(jìn)胰高血糖素樣肽- 1的分泌，實(shí)現(xiàn)降糖作用，提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗[21]。本次研究也證實(shí)電針干預(yù)足三里、三陰交、胃脘下俞可降低 T2DM 大鼠 FBG、HOMA- IR。

研究表明T2DM是一種炎性疾病[22- 23]，IL- 1β、IL- 6水平升高可預(yù)測(cè)T2DM的發(fā)生[24]。在2型糖尿病患者與健康人的研究中發(fā)現(xiàn)，前者IL- 6、TNF- α和 C 反應(yīng)蛋白 (C- reactive protein，CRP)水平顯著升高，會(huì)對(duì)胰島細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，加速糖尿病的發(fā)生[25]。慢性炎癥與胰島素抵抗的發(fā)生關(guān)系密切，是誘導(dǎo)胰島素抵抗的重要機(jī)制[26- 27]，如TNF- α?xí)p害胰島素信號(hào)通路從而誘導(dǎo)胰島素抵抗[28]。部分學(xué)者認(rèn)為，在2型糖尿病患者中，全身的炎癥因子含量增加會(huì)導(dǎo)致IR的發(fā)生[29]。而已有相關(guān)研究證明，電針耳甲可降低T2DM模型大鼠促炎因子TNF- α，升高抗炎細(xì)胞因子IL- 10[30]；“標(biāo)本配穴”針刺干預(yù)結(jié)合其他療法可降低T2DM患者IL- 6、1L- 1β及TNF- α等炎性細(xì)胞因子[31]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[32]及臨床試驗(yàn)[33]也證實(shí)溫針灸可有效改善糖尿病糖脂代謝及胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。因此，改善慢性炎癥狀態(tài)從而改善胰島素抵抗可能是針刺治療T2DM的重要途徑。基于此，發(fā)現(xiàn)電針干預(yù)4周后，2型糖尿病大鼠FBG、HbAc、FINS、HOMA- IR指數(shù)水平均下降且抗炎因子(TGF- β1 、IL- 10)含量明顯升高，促炎因子(TNF- α、IL- 6、IL- 1β、MCP- 1)明顯降低，說明電針可以緩解T2DM大鼠慢性炎癥狀態(tài)、改善胰島素抵抗發(fā)揮降低血糖的作用。

綜上所述，電針可以調(diào)控T2DM大鼠炎癥因子表達(dá)水平，抑制低度炎性狀態(tài)，有效改善2型糖尿病大鼠的糖脂代謝水平、胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)及胰島β細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。但電針調(diào)節(jié)T2DM炎癥因子水平的作用機(jī)制還需進(jìn)一步探討研究，因此，后續(xù)還需從相關(guān)炎癥信號(hào)通路著手，探究電針是否通過調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路抑制低度炎癥從而起到改善2型糖尿病相關(guān)癥狀的作用。