金璨 王璇 宮樹(shù)森 孫正海 吳田

關(guān)鍵詞：海巴戟；水培；鹽脅迫；生理指標(biāo)；保護(hù)酶活性

海巴戟（MorindacitrifoliaL.）是一種常綠多年生闊葉小喬木、灌木，茜草科巴戟天屬植物，原產(chǎn)于美國(guó)東南部[1]，現(xiàn)廣泛分布于南太平洋地區(qū)，菲律賓，以及中國(guó)海南島、臺(tái)灣島、云南西雙版納、元江等地[2]。海巴戟果實(shí)可食用，作為天然藥物已有上千年應(yīng)用歷史[3]，屬于珍貴資源。海巴戟含有160多種有效成分，其中包括植物堿和多糖類活性成分[4]，如黃酮[5]、皂甙[6-7]、熊果酸[8]等，可用于預(yù)防或改善各種慢性疾病，包括活性氧（ROS）損傷、糖尿病、高血壓和瘧疾[9]，此外還含有人體必需的大量礦物質(zhì)和維生素[10]，具有重要開(kāi)發(fā)潛力和利用價(jià)值。

我國(guó)鹽堿地分布廣，面積大，全國(guó)覆蓋有3461萬(wàn)hm2鹽堿地，其中鹽堿化的農(nóng)業(yè)用地面積達(dá)760萬(wàn)hm2，占比20%[11]。土壤鹽堿化已成為當(dāng)今農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要阻礙因素之一，有研究預(yù)測(cè)，到2050年，全球鹽堿耕地比例將至50%。鹽堿土地是今后重要的潛力后備土地資源，合理開(kāi)發(fā)利用鹽堿土地對(duì)于我國(guó)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)與發(fā)展作用不可小覷[12]。目前，許多研究利用生物改良法，將耐鹽性作物種植于鹽堿地吸收土壤中多鹽分降低耕作層的鹽分，并增加土壤中的有機(jī)質(zhì)，從而使鹽堿土地得到改善。濱海鹽漬土壤地區(qū)種植過(guò)紫花苜蓿的地塊比空白地塊的土壤可溶性鹽含量明顯降低，并且土壤的有機(jī)質(zhì)、肥力和氮含量都有一定程度的增加[13]。海巴戟是一種典型的熱帶植物，然而目前由于環(huán)境條件的制約，當(dāng)下產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)用的海巴戟只在熱帶沿?；蛴炅值貐^(qū)栽培，海巴戟的自然分布與種植范圍均較小且分散。從海巴戟廣泛分布于太平洋南部諸島嶼這一特點(diǎn)上看[14]，它能適應(yīng)于NaCl含量濃度較高的海灘區(qū)生存，理論上耐鹽性較強(qiáng)。因此，明確海巴戟對(duì)鹽的耐受程度及了解海巴戟的耐鹽機(jī)理是發(fā)展海巴戟產(chǎn)業(yè)同時(shí)利用與改善鹽漬化土壤的有效途徑之一。

本研究在前期建立的海巴戟水培體系的基礎(chǔ)上，以水培180d的海巴戟苗為試驗(yàn)材料，分別選取5個(gè)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl溶液進(jìn)行鹽脅迫處理，檢測(cè)海巴戟幼苗根、莖、葉的生物量與葉片相對(duì)含水量（relativewatercontent，RWC）。測(cè)定可溶性蛋白（solubleprotein，SP）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）幾個(gè)生理指標(biāo)，過(guò)氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）2個(gè)抗氧化酶。以了解在鹽脅迫下的各個(gè)指標(biāo)的變化，明確海巴戟幼苗對(duì)NaCl的耐受范圍，為擴(kuò)大海巴戟種植范圍提供理論依據(jù)并為探究海巴戟的耐鹽機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

海巴戟苗取自西南林業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院組培室，為無(wú)菌苗，每90d擴(kuò)繁繼代1次。預(yù)處理時(shí)留取海巴戟莖尖3cm左右，剪去其余部分。配制MS液體培養(yǎng)基，稀釋成1/8MS，并添加生長(zhǎng)素0.2mg/LNAA，然后將上述海巴戟莖尖插于漂浮板上放入溶液中進(jìn)行培養(yǎng)，每5d更換1次溶液，培養(yǎng)180d。組培室的溫度設(shè)定在（26±2）℃，光照強(qiáng)度為3000lx，光照時(shí)間為12h/d。試驗(yàn)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0（CK）、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的NaCl溶液對(duì)水培180d的海巴戟苗進(jìn)行處理，NaCl溶于水培的溶液中，每5d更換1次，每個(gè)處理25棵海巴戟苗，各處理重復(fù)3次。

1.2方法

1.2.1水培鹽脅迫海巴戟生物量測(cè)定脅迫20d后，隨機(jī)選取3株，先將每株根莖葉的水分用濾紙吸干后，再分別稱量各株根莖葉的鮮重，放入烘箱中105℃烘干30min，然后80℃烘干至恒重，并稱量干重。

1.2.2水培鹽脅迫海巴戟葉片RWC測(cè)定海巴戟葉片RWC采用烘干稱重法測(cè)定[15]，取NaCl脅迫20d后的新鮮葉片測(cè)量鮮重（W0），洗凈葉片表面污物再將葉片沒(méi)進(jìn)蒸餾水中浸泡，從葉片開(kāi)始浸泡至浸泡結(jié)束，期間每15min進(jìn)行1次重量測(cè)量，測(cè)量至葉片重量無(wú)變化時(shí)停止浸泡，此時(shí)葉片重量為葉片的飽和鮮重（W1），然后在105℃烘箱中殺青30min，70℃下烘干至恒重，稱量葉片干重（W2）。

1.2.3水培鹽脅迫海巴戟葉片各指標(biāo)測(cè)定每5d取樣1次，每次取樣選取相同部位的葉片，保存于–80℃的超低溫冰箱中，用于SP、MDA、SOD、POD生理指標(biāo)的測(cè)定及CAT、APX抗氧化酶的測(cè)定，重復(fù)3次。參照李合生[16]的方法，SP含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定，SOD活性采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定，CAT活性采用紫外吸收法測(cè)定，APX活性測(cè)定采用ASA氧化法，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用MicrosoftExcel2007軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)據(jù)處理，使用Dunnett-t檢驗(yàn)方法通過(guò)SPSS22軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1水培條件下鹽脅迫對(duì)海巴戟幼苗生長(zhǎng)的影響

2.1.1水培條件下鹽脅迫海巴戟的生長(zhǎng)狀況20d脅迫結(jié)束后，0.2%NaCl脅迫下的海巴戟幼苗的生長(zhǎng)情況與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（圖1）。隨著NaCl脅迫濃度的增加，海巴戟幼苗株高、莖粗和葉片數(shù)降低，受鹽害癥狀最快顯著表現(xiàn)于葉片。因此，本試驗(yàn)對(duì)海巴戟幼苗生理指標(biāo)的測(cè)定檢測(cè)部位選擇在葉片，越高濃度的NaCl脅迫下其葉片相比對(duì)照組越瘦小。NaCl脅迫濃度為0.8%的海巴戟幼苗主根細(xì)短，側(cè)根減少，殘存葉片萎蔫，過(guò)半植株出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，0.8%為海巴戟幼苗在NaCl脅迫下的半致死濃度，NaCl脅迫濃度為1.0%的海巴戟幼苗全部脫水死亡，因此，在相關(guān)生理指標(biāo)檢測(cè)中只測(cè)定了1.0%及以下濃度的NaCl處理幼苗。

2.1.2水培條件下鹽脅迫對(duì)海巴戟幼苗RWC的影響經(jīng)過(guò)不同NaCl濃度脅迫處理20d以后，海巴戟葉片的RWC呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，NaCl濃度越高下降越明顯（表1）。0.2%NaCl脅迫下，葉片的RWC與CK組分別為74.56%、74.30%，但無(wú)顯著差異。0.4%NaCl脅迫下，葉片的RWC開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，RWC為CK組的92.33%，且差異顯著。隨著NaCl濃度的增加，葉片的RWC均呈下降趨勢(shì)，且均與CK組形成顯著性差異，1.0%NaCl脅迫下，葉片的RWC僅有CK組的61.37%。

2.1.3水培條件下鹽脅迫對(duì)海巴戟幼苗生物量的影響0.2%NaCl脅迫下，海巴戟苗生物量的根莖葉部分分別比CK組高0.12%、0.54%、0.11%，無(wú)顯著差異（P>0.05）（表1），說(shuō)明低濃度的NaCl脅迫對(duì)海巴戟苗生長(zhǎng)未造成脅迫傷害。隨著NaCl濃度的增加，海巴戟根在0.8%與1.0%NaCl脅迫下的生物量均顯著低于其他濃度。CK組下海巴戟葉片生物量占總生物量的63.42%，各鹽濃度下葉片生物量分別占總生物量的63.38%、63.83%、64.05%、63.96%、65.05%，可見(jiàn)，葉片生物量所占比例會(huì)隨著NaCl脅迫濃度的增加而增大，說(shuō)明鹽脅迫下海巴戟苗生物量的積累優(yōu)先表現(xiàn)于葉片。

2.2水培條件下鹽脅迫對(duì)海巴戟幼苗生理指標(biāo)的影響

2.2.1水培條件下鹽脅迫對(duì)海巴戟幼苗SP含量的影響從整體上看，隨NaCl處理濃度與時(shí)間的增加，海巴戟葉片SP含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)（圖2A），NaCl脅迫濃度越高，SP含量上升的幅度也相對(duì)較大。10d時(shí)，1%NaCl脅迫下SP含量達(dá)到最高，與CK組相比，其含量提高了1.18mg/g，呈顯著差異（P<0.05），后隨著脅迫時(shí)間的增加，SP含量呈下降趨勢(shì)。NaCl脅迫下，海巴戟幼苗SP含量最高時(shí)，為其耐NaCl脅迫能力的范圍極限，這表明在超出一定的耐鹽能力時(shí)，海巴戟幼苗的生長(zhǎng)受到傷害。1.0%NaCl脅迫下，SP含量在脅迫處理的各時(shí)間段與CK組相比分別提高98.63%、176.1%、132.35%、84.00%。

2.2.2水培條件下鹽脅迫對(duì)海巴戟幼苗MDA的影響隨著NaCl濃度的增加及脅迫時(shí)間的推移，海巴戟葉片的MDA含量呈先上升后下降的趨勢(shì)（圖2B），各鹽濃度脅迫下0～10d時(shí)的上升幅度明顯低于10～15d，從15～20d呈下降趨勢(shì)。NaCl脅迫處理10d時(shí)，各NaCl濃度分別與CK組相比差異顯著（P<0.05）。NaCl脅迫處理15d時(shí)，MDA含量出現(xiàn)最大值，0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%與CK組相比分別上升了39.67%、46.81%、53.49%、85.03%、100.00%，MDA含量增加較大的NaCl濃度分別為0.8%、1.0%。隨后MDA含量開(kāi)始下降，其中1.0%NaCl脅迫下降幅度最大，20d時(shí)，各NaCl濃度脅迫下的MDA含量與CK組相比均呈顯著差異。表明隨著NaCl濃度增加和脅迫時(shí)間的推移，海巴戟葉片細(xì)胞膜的受損程度也在增加，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化程度加大。

2.2.3水培條件下鹽脅迫對(duì)海巴戟幼苗SOD活性的影響1.0%NaCl脅迫一段時(shí)間后，海巴戟葉片的SOD活性隨著時(shí)間的推移呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)（圖2C），各時(shí)間段下SOD活性均顯著高于CK組（P<0.05）。0.8%NaCl脅迫10d時(shí)SOD活性達(dá)到最大值，其余NaCl濃度脅迫下，SOD活性均在15d時(shí)達(dá)到最大值。15d時(shí)與CK相比，SOD活性在0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%NaCl濃度脅迫下分別增加了29.29%、30.00%、35.48%、50.12%、83.33%，這表明一定程度的鹽脅迫可使海巴戟葉片的SOD活性上升。隨著脅迫時(shí)間的推移，SOD的活性則呈下降趨勢(shì)。在脅迫進(jìn)行至20d時(shí)，各NaCl濃度下的SOD活性分別比CK組提高20.46%、17.47%、13.79%，27.59%、40.00%，均差異顯著。

2.2.4水培條件下鹽脅迫對(duì)海巴戟幼苗CAT的影響在1.0%NaCl脅迫下，海巴戟葉片的過(guò)氧化氫酶活性隨著脅迫時(shí)間的推移呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)（圖2D），均顯著高于CK處理（P<0.05），15d時(shí)達(dá)到最大值，隨著脅迫時(shí)間的推移，CAT活性呈下降趨勢(shì)。各NaCl濃度在脅迫10d時(shí)，0.2%、0.4%NaCl脅迫下的CAT活性無(wú)顯著差異，其余濃度下差異顯著。脅迫20d時(shí)，0.2%與0.4%NaCl脅迫下的CAT活性差異不顯著。0.2%和0.4%NaCl的整個(gè)脅迫時(shí)間段，葉片中CAT活性變化幅度不大。綜上所述，海巴戟葉片在受到較高NaCl濃度脅迫時(shí)，CAT活性上升的幅度相對(duì)較大，但隨著脅迫時(shí)間的推移，超出植物一定的耐受限度，CAT活性則下降。這說(shuō)明海巴戟葉片可以在短期的鹽脅迫下通過(guò)積累更多的CAT含量來(lái)增強(qiáng)自身的抗鹽能力，但隨著脅迫時(shí)間的推移，持續(xù)的鹽脅迫則會(huì)對(duì)植物本身造成一定的傷害。

2.2.5水培條件下鹽脅迫對(duì)海巴戟幼苗APX活性的影響海巴戟葉片在不同的NaCl濃度脅迫下，APX的活性隨著NaCl濃度的增加及脅迫時(shí)間的推移呈先增加后降低的趨勢(shì)（圖2E），且與CK組相比均差異顯著（P<0.05）。0.4%NaCl脅迫10d時(shí)，葉片的APX活性達(dá)到最高，隨著脅迫時(shí)間的推移活性降低。0.2%NaCl脅迫下，5d與20d時(shí)的葉片APX活性無(wú)顯著差異。各NaCl濃度脅迫20d時(shí)，與CK組相比，APX的活性分別提高17.89%、18.16%、19.41%、13.23%、12.56%；0.2%、0.4%、0.8%、1.0%NaCl脅迫下的APX活性無(wú)顯著差異。

2.2.6水培條件下鹽脅迫對(duì)海巴戟幼苗POD活性的影響在0.2%、0.4%NaCl脅迫下，海巴戟葉片POD活性呈先增高后下降的趨勢(shì)（圖2F），其中0.2%NaCl脅迫下，POD活性在15d時(shí)達(dá)到最大值，而后開(kāi)始下降，0.4%NaCl脅迫10d時(shí)，POD活性達(dá)到最大值，說(shuō)明在0.4%NaCl脅迫下POD在10d發(fā)揮著重要的抗氧化作用。0.4%NaCl濃度與CK組相比，不同時(shí)間段下POD均顯著提高（P<0.05）。2個(gè)低濃度NaCl脅迫下POD活性達(dá)到最大值的時(shí)間不同，說(shuō)明0.2%NaCl脅迫下，海巴戟前期受到的脅迫并未對(duì)細(xì)胞膜造成一定的傷害。各NaCl濃度脅迫20d后，0.8%、1.0%NaCl脅迫下POD活性與CK組無(wú)顯著差異，其余濃度與CK均差異顯著。

2.2.7指標(biāo)相關(guān)性分析指標(biāo)相關(guān)性分析（表2）表明，可溶性蛋白與SOD、APX及MDA呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與CAT呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與RWC呈極顯著負(fù)相關(guān)；SOD與CAT、MDA呈極顯著正相關(guān)，與RWC呈極顯著負(fù)相關(guān)；CAT與RWC呈極顯著負(fù)相關(guān)；POD與APX呈極顯著正相關(guān)；MDA與RWC呈極顯著負(fù)相關(guān)。指標(biāo)相關(guān)性分析說(shuō)明，當(dāng)海巴戟幼苗受鹽脅迫RWC減少時(shí)，植株對(duì)非生物脅迫反應(yīng)的相關(guān)生理指標(biāo)與保護(hù)酶含量隨之變化，各生理指標(biāo)與保護(hù)酶之間為抵抗鹽脅迫傷害相互影響，協(xié)同作用。證明海巴戟幼苗在可承受NaCl濃度及時(shí)間脅迫處理范圍內(nèi)，NaCl濃度越高，植株RWC越低，水分減少；MDA含量隨NaCl脅迫濃度升高而增加導(dǎo)致細(xì)胞膜脂過(guò)氧化，細(xì)胞酶活性降低，細(xì)胞膜受損進(jìn)而影響植株生長(zhǎng)發(fā)育。同時(shí)，海巴戟幼苗植株又通過(guò)植株內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)以及SOD、CAT、APX、POD酶活性增加的協(xié)同作用保護(hù)質(zhì)膜系統(tǒng)、減輕活性氧傷害來(lái)增強(qiáng)抗鹽性，提高生存能力。

3討論

水培海巴戟除了可以方便快捷地提高組培苗的移栽成活率和為脅迫試驗(yàn)方面提供基礎(chǔ)外，對(duì)海巴戟產(chǎn)業(yè)化發(fā)展還具有一定的促進(jìn)作用。水培海巴戟對(duì)于鹽脅迫的生理響應(yīng)機(jī)制包括多個(gè)方面，本研究中，海巴戟幼苗在沒(méi)有鹽脅迫的水培條件下生長(zhǎng)健壯，0.2%NaCl脅迫下受鹽害影響極小，植株長(zhǎng)勢(shì)與CK幾乎無(wú)差異。而在0.2%NaCl以上濃度脅迫下，海巴戟幼苗長(zhǎng)勢(shì)隨NaCl濃度的增加而減緩，且鹽害最先表現(xiàn)在葉片，這與杜運(yùn)領(lǐng)等[17]的研究結(jié)果一致。鹽脅迫過(guò)程中，海巴戟幼苗RWC隨NaCl脅迫濃度增加而減少，這與張春詩(shī)等[18]對(duì)黑果腺肋花楸幼苗進(jìn)行NaCl脅迫試驗(yàn)的結(jié)果一致。在鹽脅迫下海巴戟幼苗葉片中可溶性蛋白質(zhì)、MDA含量以及SOD、CAT、APX、POD活性隨NaCl濃度的增加呈先上升再下降的趨勢(shì)，這與劉吉等[19]對(duì)菠菜在NaCl脅迫下的研究中，3種菠菜的SOD、POD、CAT活性隨著NaCl濃度的增加，呈先增加后下降的結(jié)論相同。在洪森榮等[20]對(duì)懷玉山三葉青與胡愛(ài)雙等[21]對(duì)不同耐鹽性八棱海棠株系進(jìn)行鹽脅迫試驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，與本試驗(yàn)不同的是，以上2項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均是隨NaCl脅迫濃度的增加，植株內(nèi)MDA含量均呈上升趨勢(shì)，而本研究中海巴戟幼苗葉片MDA含量呈先上升再下降趨勢(shì)，該項(xiàng)差異的原因是由于本試驗(yàn)中海巴戟幼苗在0.8%與1.0%NaCl濃度脅迫下，脅迫時(shí)間超過(guò)海巴戟幼苗耐鹽范圍后植株死亡有關(guān)。隨著脅迫時(shí)間的推移，海巴戟葉片的可溶性蛋白、抗氧化物酶活性會(huì)發(fā)生顯著性的變化，證明了海巴戟幼苗在鹽脅迫下通過(guò)積極調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)和抗氧化物酶來(lái)減輕傷害，促進(jìn)生長(zhǎng)。這說(shuō)明海巴戟與其他植物一樣在不同NaCl濃度脅迫下的適應(yīng)主要與滲透物質(zhì)的積累和活性氧清除能力的提高有關(guān)，證明了海巴戟幼苗對(duì)于鹽脅迫具有一定的抵抗能力。

在土壤鹽分超過(guò)0.2%～0.5%時(shí)，一般植物會(huì)出現(xiàn)吸水困難現(xiàn)象，當(dāng)鹽分高于0.4%時(shí)，植物體內(nèi)水分易外滲[22]。如徐千瑞等[23]研究中表明，日本莢蒾僅能正常存活在NaCl濃度0.15%及以下含鹽量土壤環(huán)境中，無(wú)法長(zhǎng)期存活在NaCl濃度0.3%及以上含量土壤環(huán)境；崔卓越等[24]的研究結(jié)果表明，紫丹參在鹽脅迫環(huán)境中，當(dāng)NaCl溶液濃度超過(guò)0.7%時(shí)，紫丹參根部生長(zhǎng)狀況極差，植株出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。而本研究中，海巴戟幼苗在0.8%NaCl濃度脅迫時(shí)才處于半致死狀態(tài)，在NaCl脅迫濃度高達(dá)1%時(shí)致死，這說(shuō)明海巴戟相比其他植物耐鹽性強(qiáng)，具有一定抗鹽能力，在鹽脅迫環(huán)境下存在著逆境響應(yīng)機(jī)制。當(dāng)植物遭受非生物脅迫時(shí)，會(huì)啟動(dòng)一系列基因表達(dá)調(diào)控進(jìn)程，誘導(dǎo)相關(guān)的基因及其轉(zhuǎn)錄因子的激活表達(dá)[25]，而目前關(guān)于海巴戟與鹽脅迫相關(guān)基因的信息尚未了解，本研究可為后續(xù)找到海巴戟存在與逆境脅迫相關(guān)控制其生理指標(biāo)變化的基因試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。研究海巴戟耐鹽機(jī)理與選育耐鹽品種是優(yōu)化與擴(kuò)大海巴戟種植的重要手段。

4結(jié)論

重度鹽化土的土壤含鹽量達(dá)0.4%～0.6%，天然形成的鹽堿地濱海地區(qū)的含鹽主要以NaCl為主。本研究通過(guò)不同濃度NaCl溶液對(duì)水培海巴戟幼苗進(jìn)行鹽脅迫研究發(fā)現(xiàn)，海巴戟耐鹽性較強(qiáng)，在0.8%NaCl溶液濃度下能通過(guò)保護(hù)酶系統(tǒng)積極調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)和抗氧化物酶來(lái)減輕傷害，保證其存活生長(zhǎng)。因此，可以嘗試于熱帶濱海地區(qū)的鹽漬地試種海巴戟，提高鹽漬地區(qū)利用率。