羅世杏 覃昱茗 黃國(guó)弟 唐玉娟 張宇 李日旺

關(guān)鍵詞：芒果屬；花粉形態(tài)；電鏡掃描；聚類(lèi)分析

漆樹(shù)科（Anacardiaceae）芒果屬（Mangifera），約有69個(gè)種[1]。芒果在我國(guó)栽培歷史悠久，傳統(tǒng)栽培生產(chǎn)過(guò)程中存在許多天然雜交種，形成了野生、半野生和野生近源種等獨(dú)具特色的地方資源。目前在芒果遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建等方面仍以SSR[2]、SRAP[3-4]及ISSR[4]等分子標(biāo)記的手段分析為主，而分子標(biāo)記本身受環(huán)境條件、標(biāo)記類(lèi)型等差異而導(dǎo)致分析結(jié)果不穩(wěn)定。許文天等[1]和施宗明等[5]簡(jiǎn)要描述過(guò)花粉量及花粉形態(tài)特征，但未深入描述花粉超微形態(tài)特征，花粉形態(tài)指標(biāo)且品種數(shù)量涉及范圍也較小。芒果花粉超微結(jié)構(gòu)在植物系統(tǒng)分類(lèi)的研究報(bào)道較少。植物隨著漫長(zhǎng)的歷史演變而不斷與環(huán)境協(xié)調(diào)發(fā)展，其花粉在保持遺傳保守性和穩(wěn)定性下形成了獨(dú)特的形態(tài)特征，國(guó)內(nèi)外許多專(zhuān)家對(duì)柚[6]、棗[7]、菊芋[8]、懸鉤子[9]、梨[10]等樹(shù)種的花粉形態(tài)進(jìn)行觀察，對(duì)其品種的分類(lèi)鑒定、起源演化等方面進(jìn)行了研究。對(duì)芒果屬植物進(jìn)行聚類(lèi)分析前，先把花粉形態(tài)學(xué)特征的觀測(cè)數(shù)據(jù)采用數(shù)量化分析的手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)化處理，該方式可成為人們對(duì)芒果屬植物進(jìn)行科學(xué)研究的一個(gè)新手段[11]。本研究對(duì)芒果屬2個(gè)種32份種質(zhì)資源花粉進(jìn)行調(diào)查研究，可在孢粉學(xué)領(lǐng)域?yàn)槊⒐南到y(tǒng)分類(lèi)、優(yōu)特品種選育提供研究依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

32份供試芒果花粉均于2021年采自廣西亞熱帶作物研究所芒果種質(zhì)資源圃（表1）。于盛花期隨機(jī)采集樹(shù)冠外圍不同方向中上部雄蕊成熟的正常花朵，用滅菌鑷子將成熟破裂的灰白色花藥放入電鏡固定液中，搖勻固定后，于4℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

花電鏡觀察方法參照方仁等[12]的方法，選擇紫紅色的花朵，將成熟的灰白色花粉進(jìn)行脫水處理并干燥，用離子濺射儀對(duì)導(dǎo)電膠上緊貼的干燥花粉進(jìn)行真空噴金鍍膜、移入發(fā)射掃描電鏡觀察并拍照。每份芒果供試材料均選取具有代表性的視野觀察記錄8個(gè)花粉形態(tài)特征數(shù)據(jù)，每個(gè)特征3次重復(fù)。300倍觀察花粉粒的群體形態(tài)，3000倍觀察花粉的極面和赤道面，15000倍觀察花粉的外壁紋飾特征，并測(cè)量極軸長(zhǎng)（P）、赤道軸長(zhǎng)（E）、萌發(fā)脊寬度（W）及網(wǎng)孔直徑（D）大小?；ǚ哿５男螤钣脴O軸長(zhǎng)和赤道軸長(zhǎng)的比值來(lái)表示（P/E），1.14＜P/E≤2為長(zhǎng)球形，0.88

1.3數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差；選取極軸長(zhǎng)、赤道軸長(zhǎng)、萌發(fā)脊寬度、網(wǎng)孔直徑、網(wǎng)孔密度值共5個(gè)定量特征用IBMSPSS19.0軟件的組間聯(lián)接法進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析。

2結(jié)果與分析

2.1芒果屬花粉形態(tài)特征比較

由圖1A～圖1C可知，供試芒果花粉粒形狀規(guī)則，大小勻稱(chēng)，均為3條花粉萌發(fā)孔溝，大部分花粉粒萌發(fā)溝孔開(kāi)裂度幾乎到達(dá)花粉粒的兩極，萌發(fā)溝以等間距環(huán)狀分布，萌發(fā)點(diǎn)凸起。對(duì)照NPC分類(lèi)系統(tǒng)可知芒果花粉屬于N3P4C5型。其赤道觀大多數(shù)為橢圓形，萌發(fā)孔呈裂開(kāi)狀；其極面觀為3裂三角形；條紋狀或網(wǎng)狀紋飾和紋孔布滿(mǎn)花粉粒表面。芒果花粉的形狀大小、萌發(fā)脊寬窄、網(wǎng)孔直徑和密度存在不同程度的差異。32個(gè)芒果材料花粉除白花本地芒、百東扁桃–芒19-24花粉粒的溝孔在極面有輕微的匯合外，其他花粉粒溝孔在極面均不匯合。根據(jù)花粉性狀P/E分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，云南土芒P/E值為1.56，屬長(zhǎng)球形花粉；扁桃1號(hào)、扁桃2號(hào)、東水一號(hào)、桂熱芒23號(hào)、扁桃3號(hào)、土芒、扁桃4號(hào)、四季蜜芒和紫薇芒等9份材料花粉P/E值范圍0.76～0.87，屬扁球形花粉，其余的22份芒果材料屬于近球形花粉。從赤道軸長(zhǎng)看，云南土芒的最小，為15.05μm，顯著小于其他芒果資源。從萌發(fā)脊寬來(lái)看，象牙芒26號(hào)最小，為13.77μm，與恒寧扁桃–芒19-3、百東扁桃–芒19-27、桂熱芒82號(hào)、云南土芒、龍眼香芒、布魯斯和秋實(shí)1號(hào)無(wú)差異，但顯著小于其余24份芒果資源。從網(wǎng)孔密度來(lái)看，馬切蘇、暹羅芒網(wǎng)孔密度均為37μm2，與百東扁桃–芒19-26、恒寧扁桃–芒19-3、百東扁桃–芒19-13、百東扁桃–芒19-12、百東扁桃–芒19-27、東水一號(hào)、象牙芒26號(hào)、龍眼香芒、帕拉英達(dá)、土芒、秋實(shí)1號(hào)、桂熱芒289號(hào)、四季蜜芒、仁和呂宋和紅花本地芒無(wú)差異，但顯著大于其余15份芒果資源。

2.2芒果屬花粉的外壁紋飾

從圖1D可見(jiàn)，從花粉外壁紋飾來(lái)看，大多數(shù)芒果花粉屬于網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)孔形狀多樣，主要是圓形和長(zhǎng)條形，紋脊粗糙，網(wǎng)孔分布密度在不同材料間存在差異。32個(gè)供試芒果種質(zhì)材料花粉壁的表面紋飾都非常明顯，但網(wǎng)紋特征存在一定的差異，且萌發(fā)脊寬窄不一。大致可將這32個(gè)芒果花粉壁的紋飾分為以下4類(lèi)：（1）花粉粒極軸部呈網(wǎng)狀紋飾，赤道面紋飾縱向成條紋狀，與網(wǎng)紋結(jié)合。網(wǎng)孔呈圓形或者超長(zhǎng)圓形，大小，形狀差異大，網(wǎng)孔深。如白花本地芒（圖1D-1）、扁桃1號(hào)（圖1D-2）、扁桃2號(hào)（圖1D-6）、云南土芒（圖1D-19）、帕拉英達(dá)（圖1D-21）、布魯斯（圖1D-22）、土芒（圖1D-4）、秋實(shí)1號(hào)（圖1D-25）、桂熱芒289號(hào)（圖1D-26）、扁桃3號(hào)（圖1D-23）、扁桃4號(hào)（圖1D-27）。（2）網(wǎng)紋呈腦紋狀，紋路大而凸起，網(wǎng)孔較小，網(wǎng)孔密度稀疏，花粉粒表面粗糙，如金煌芒（圖1D-5）、百東扁桃–芒19-24（圖1D-8）、百東扁桃–芒19-16（圖1D-9）、恒寧扁桃–芒19-3（圖1D-10）、馬切蘇（圖1D-16）、象牙芒26號(hào)（圖1D-18）、紫薇芒（圖1D-32）、仁和呂宋（圖1D-30）、暹羅芒（圖1D-28）。（3）花粉粒極面和赤道面均為網(wǎng)紋狀，網(wǎng)孔呈近圓形，大小相對(duì)均勻，如臺(tái)農(nóng)1號(hào)（圖1D-3）、南逗邁4號(hào)（圖1D-4）、龍眼香芒（圖1D-20）、四季蜜芒（圖1D-29）、桂熱芒23號(hào)（圖1D-17）、紅花本地芒（圖1D-31）；條紋狀紋飾呈交叉彎曲，紋脊粗大且連片，偶見(jiàn)紋孔。如百東扁桃–芒19-26（圖1D-7）、百東扁桃–芒19-13（圖1D-11）、百東扁桃–芒19-12（圖1D-12）、百東扁桃–芒19-27（圖1D-13）、桂熱芒82號(hào)（圖1D-14）、東水一號(hào)（圖1D-15）。

2.3芒果花粉形態(tài)特征數(shù)量性狀的聚類(lèi)分析

根據(jù)表2中的極軸長(zhǎng)/赤道軸長(zhǎng)（P/E）、萌發(fā)脊寬、網(wǎng)孔密度等6個(gè)花粉形態(tài)特征數(shù)量性狀，對(duì)32份芒果材料進(jìn)行聚類(lèi)分析。在相似距離為15時(shí)，32份芒果材料分為三大類(lèi)群（圖2）。

第一類(lèi)包括馬切蘇、暹羅芒、仁和呂宋3份材料，這3份材料都是來(lái)自東南亞的品種，從聚類(lèi)圖來(lái)看，其親緣關(guān)系較接近。腦紋，其網(wǎng)孔直徑較小，網(wǎng)孔密度較大。第二類(lèi)是云南土芒、布魯斯和象牙芒26號(hào)，其萌發(fā)脊寬度較窄。其余的26份芒果資源歸為第三類(lèi)，其中扁桃1號(hào)、扁桃2號(hào)、扁桃3號(hào)和白花本地芒單獨(dú)成組，該組是最原始的野生芒果，其花粉紋飾是網(wǎng)紋和條紋的結(jié)合；四季蜜芒、南逗邁4號(hào)和桂熱芒23號(hào)聚為一組，其花粉粒紋飾為網(wǎng)紋紋飾，網(wǎng)孔近圓形，大小相對(duì)均勻。

3討論

攜帶大量遺傳信息的花粉使植物在進(jìn)化過(guò)程中保持較強(qiáng)的保守性和穩(wěn)定性，為利用孢粉學(xué)進(jìn)行遺傳關(guān)系的分析提供了理論依據(jù)[14]。近年來(lái)屬間及種間的分類(lèi)研究工作已經(jīng)在部分作物中展開(kāi)，并已見(jiàn)利用孢粉學(xué)手段開(kāi)展親緣關(guān)系研究的報(bào)道。張梅等[15]對(duì)繡球?qū)偌敖墝倩ǚ坌螒B(tài)的研究表明繡球?qū)俚慕壏N屬花粉形態(tài)的變異范圍被繡球?qū)僦参锘ǚ坌螒B(tài)的變異幅度覆蓋了，且繡球?qū)倩ǚ厶卣餍誀钤诜N內(nèi)變異相對(duì)穩(wěn)定，而種間差別明顯。

本研究中參試的32份芒果種質(zhì)資源分屬2個(gè)種，其花粉在微觀形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)出一定的共性，其赤道觀為圓形或橢圓形，呈裂開(kāi)狀；其極面觀為3裂三角形；表面具腦紋狀、條紋狀或網(wǎng)狀紋飾，屬于N3P4C5型。但各芒果資源在花粉粒大小、萌發(fā)脊寬等指標(biāo)存在著一定的差異，大小、深淺、疏密不等的穿孔分布在花粉粒表面?；ǚ哿４笮∨c品種演化存在一定的關(guān)系，陳薇薇等[16]對(duì)當(dāng)歸屬植物的研究顯示花粉演化趨勢(shì)經(jīng)歷了原始、中等進(jìn)化和進(jìn)化3種類(lèi)型，花粉粒的極軸變長(zhǎng)，形狀由球形向超長(zhǎng)球形演變。本研究通過(guò)電鏡掃描觀察發(fā)現(xiàn)，芒果屬花粉粒主要為近球形或扁球形，只有云南土芒的花粉形狀為長(zhǎng)球形，這一現(xiàn)象與其研究不一致，可能是因?yàn)槟壳暗拿⒐耘喾N遺傳關(guān)系復(fù)雜，是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)年的自然雜交和人工雜交育種而得。

芒果屬芒果種在我國(guó)已有上千年的栽培種植史，在多年的馴化引種過(guò)程中，可能存在親緣關(guān)系背景雜合等現(xiàn)象，較近地區(qū)的大范圍引種種植使得這些芒果種（M.indicaL.）資源與本土的芒果屬扁桃種（M.persiciformisC.）資源可能產(chǎn)生了自然雜交，存在適應(yīng)性進(jìn)化，形成了扁桃-芒。扁桃-芒的外觀表型例如葉片呈現(xiàn)出扁桃種的表觀性狀，葉薄革質(zhì)，狹披針形或線(xiàn)狀披針形，長(zhǎng)11～20cm，寬2～2.8cm[17]。但其在孢粉學(xué)形態(tài)上與芒果種更為接近。本研究中觀察發(fā)現(xiàn)百東扁桃-芒19-13號(hào)與龍眼香芒聚在一起、桂熱芒82號(hào)在遺傳相似系數(shù)為3時(shí)與秋實(shí)一號(hào)聚在一起，同時(shí)與其聚為一類(lèi)的還有百東扁桃–芒19-27、百東扁桃–芒19-26、百東扁桃–芒19-12，而桂熱芒82號(hào)與秋實(shí)一號(hào)都是印度芒901的實(shí)生后代，這表明了扁桃種和芒果種之間可能不存在雜交障礙。

根據(jù)花粉粒大小、花粉形態(tài)、萌發(fā)脊寬、網(wǎng)孔大小和網(wǎng)孔密度等數(shù)量性狀對(duì)參試材料進(jìn)行聚類(lèi)分析，在相似距離為15時(shí)，32份芒果屬資源可分為三大類(lèi)群。32個(gè)芒果屬種質(zhì)資源花粉形態(tài)特征具有一定的共性，同時(shí)來(lái)源地較為接近的芒果屬種質(zhì)資源在進(jìn)化樹(shù)上被聚為一類(lèi)，例如馬切蘇、暹羅芒、仁和呂宋等東南亞來(lái)源地的芒果屬資源劃分特征較為一致，顯示出一定的地域特征，在譜系圖中聚為一類(lèi)，這與采用SRAP分子標(biāo)記手段進(jìn)行分類(lèi)的結(jié)果基本一致[3]。而白花本地芒、扁桃1號(hào)、扁桃2號(hào)、扁桃3號(hào)、扁桃4號(hào)的資源具有一定的相似性，該類(lèi)資源具有原始型、野生型的特點(diǎn)。

芒果屬資源的高度雜合背景使其花粉具有一定共性，為其分類(lèi)和利用帶來(lái)一定困難。因此，芒果種質(zhì)資源花粉的電鏡分析結(jié)果可以作為芒果鑒定分類(lèi)的依據(jù)之一。但對(duì)從分類(lèi)學(xué)的角度來(lái)看，單憑花粉形態(tài)對(duì)遺傳背景高度復(fù)雜的芒果屬資源進(jìn)行數(shù)量化分類(lèi)，還不能確定其分類(lèi)地位，因此必須還要結(jié)合其各自的生物學(xué)特性對(duì)芒果屬種質(zhì)資源的鑒定和分類(lèi)進(jìn)行確認(rèn)?？傮w而言，采用孢粉學(xué)手段，利用基因?qū)W、分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法，結(jié)合芒果生物學(xué)性狀進(jìn)行綜合分析揭示芒果屬種質(zhì)資源的親緣演化關(guān)系，對(duì)高度進(jìn)化的芒果屬資源分類(lèi)研究更有現(xiàn)實(shí)意義。