車海彥 林雅婷 羅大全 龍海波

關(guān)鍵詞：南方番茄病毒；小RNA深度測(cè)序；RT-PCR檢測(cè)；基因組

1984年，美國(guó)加利福尼亞因皮里爾河谷的番茄上出現(xiàn)葉片黃化、生長(zhǎng)衰退和坐果少等癥狀[1]。2005年，墨西哥西南部和美國(guó)密西西比州東北部的番茄上也出現(xiàn)相似的癥狀，上述3地的病株體內(nèi)均分離到一種基因組為3.5kb的dsRNA病毒，SABANADZOVIC等[2]將其命名為南方番茄病毒（Southerntomatovirus，STV）。目前，STV在亞洲（中國(guó)、孟加拉國(guó)、韓國(guó)、越南、日本、土耳其、泰國(guó)、巴基斯坦和以色列）[3-8]、歐洲（法國(guó)、意大利、西班牙、英國(guó)、瑞士、德國(guó)和塞爾維亞）[8，9-19]、非洲（留尼汪島）[9]、北美洲（美國(guó)、墨西哥和加拿大）[1-2，8]、中美洲（多米尼加和巴拿馬）[9]和南美洲（哥倫比亞和巴西）[8，20]的很多國(guó)家均有報(bào)道發(fā)生。2011年，我國(guó)首次在新疆加工番茄上發(fā)現(xiàn)STV感染的植株[3]，隨后在山東[21-22]、浙江[23]、江西[23]、四川[24]、重慶[25]、北京[26]、廣東[27]、江蘇[28]、寧夏[29]和貴州[8]等地的番茄上也相繼檢測(cè)到STV。但目前我國(guó)僅公布2條STV基因組全長(zhǎng)序列[4，30]，對(duì)STV的深入研究報(bào)道較少。

STV隸屬于混合病毒科（Amalgaviridae）混合病毒屬（Amalgavirus），尚未發(fā)現(xiàn)病毒粒子，其基因組由1條線性dsRNA組成，長(zhǎng)約3.5kb，在正義鏈上有2個(gè)部分重疊的開(kāi)放閱讀框（openreadingframe，ORF），結(jié)構(gòu)上與Totiviridae成員相似。ORF1長(zhǎng)1134bp，編碼由377個(gè)氨基酸組成的p42蛋白，推測(cè)為外殼蛋白（coatprotein，CP），分子量約為42.4kDa。ORF2長(zhǎng)2289nt，編碼由762個(gè)氨基酸組成的RNA依賴的RNA聚合酶（RNAdependentRNApolymerase，RdRp），RdRp可能通過(guò)程序性+1核糖體移碼（programmed+1ribosomalframeshifting，+1PRF）表達(dá)為與ORF1的融合蛋白（類似于逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol融合蛋白），分子量約為121.5kDa[2，31]。盡管STV在基因組結(jié)構(gòu)上與Totiviridae成員相似，但基于RdRp氨基酸的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，STV與分體病毒科（Partitiviridae）成員的親緣關(guān)系更近[2，31]。目前，尚未觀察到STV的病毒粒子。STV除通過(guò)種子和花粉傳播外，尚未發(fā)現(xiàn)其他傳播途徑[2，30-31]。僅在番茄（Solanumlycopersicum）、辣椒（Capsicumannuum）、龍葵（Solanumnigrum）和燈籠果（Physalisperuviana）4種茄科植物上檢測(cè)到STV[8，10，20，32]。

番茄是海南冬季重要的北運(yùn)瓜菜品種之一，主要種植于陵水、昌江、定安等地，至2019年，海南省種植面積達(dá)7822hm2，產(chǎn)量為28.15萬(wàn)t[33]。隨著種植面積的增加和種植年限的延長(zhǎng)，生產(chǎn)中病蟲(chóng)害發(fā)生為害日趨嚴(yán)重，其中病毒病是為害最嚴(yán)重的病害，部分田塊病株率高達(dá)100%。筆者在利用小RNA深度測(cè)序技術(shù)鑒定海南番茄病毒病病原時(shí)發(fā)現(xiàn)，STV在海南多個(gè)市（縣）的樣品中均存在，而且發(fā)現(xiàn)1株STV單獨(dú)侵染的樣品。為進(jìn)一步了解STV在海南的發(fā)生分布情況，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了2015—2021年采集自海南的番茄樣品，同時(shí)結(jié)合RACE和RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了海南番茄樣品上的STV全基因組序列，本研究結(jié)果有助于了解STV在海南的分布、發(fā)生趨勢(shì)及遺傳多樣性，為病害防控提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

小RNA深度測(cè)序的番茄葉片樣品（編號(hào)為T(mén)-DZ-2）于2019年采自海南儋州寶島新村，田間癥狀表現(xiàn)為葉脈壞死、葉脈間不均勻褪綠，長(zhǎng)勢(shì)衰弱。STV檢測(cè)的樣品共987份，于2015—2021年采自海南陵水、定安、昌江、?？凇偤?、三亞、儋州、文昌、臨高、樂(lè)東共10個(gè)市（縣）。

植物總RNA提取試劑盒和普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，TRIzolReagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，2×RapidTaqMasterMix和2×PhantaFlashMasterMix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，pMD18-TVectorCloningKit、E.coliCompetentCellDH5α、Poly（A）Polymerase和SMARTerRACE5′/3′Kit均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2方法

1.2.1小RNA深度測(cè)序和分析使用TRIzolReagent提取番茄葉片樣品（編號(hào)為T(mén)-DZ-2）的總RNA。委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司構(gòu)建小RNA文庫(kù)，使用Hiseq2000平臺(tái)進(jìn)行SE50測(cè)序，原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)控分析后，獲得cleansmallRNA序列，使用Velvet1.2.10軟件[34]對(duì)其進(jìn)行拼接組裝。將拼接結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blastn和Blastx比對(duì)，將得到的病毒序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并注釋。

1.2.2RT-PCR驗(yàn)證以1.2.1提取的總RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用STV特異性檢測(cè)引物STV-F/STV-R[23]對(duì)小RNA深度測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系（25μL）：12.5μL2×RapidTaqMasterMix、10μmol/L的上游引物和下游引物各1μL，1μLcDNA，9.5μL無(wú)菌ddH2O。PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，52℃退火5s，72℃延伸5s，循環(huán)35次；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收特異片段，回收產(chǎn)物直接測(cè)序。本研究所有的引物合成和測(cè)序均委托北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.2.3田間番茄樣品的STV檢測(cè)使用植物總RNA提取試劑盒提取田間采集的987份樣品總RNA，cDNA合成和PCR檢測(cè)反應(yīng)參見(jiàn)1.2.2。

1.2.4STV全基因組序列擴(kuò)增根據(jù)田間樣品的檢測(cè)結(jié)果，選取海南儋州（T-DZ-2）、陵水（T-LS-52）、定安（T-DA-23）和昌江（T-CJ-15）共4個(gè)樣品進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。STV全基因組擴(kuò)增策略如圖1所示。根據(jù)小RNA深度測(cè)序結(jié)果和GenBank已有序列，利用在線引物設(shè)計(jì)工具Primer3（https：//bioinfo.ut.ee/primer3/）設(shè)計(jì)基因組擴(kuò)增引物對(duì)STV-F1/STV-R1（表1），按照1.2.2方法對(duì)STV的基因組編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。5′和3′末端非編碼區(qū)擴(kuò)增：利用Poly（A）Polymerase將4個(gè)樣品的RNA3′端加上poly（A）尾，使用SMARTerRACE5′/3′Kit進(jìn)行cDNA合成。根據(jù)基因組編碼區(qū)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)特異性引物STV-GSP5和STV-GSP3（表1），分別對(duì)STV基因組的5′和3′末端序列進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的特異性片段產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，與pMD18-Tvector連接，轉(zhuǎn)化到E.coliCompetentCellDH5α中，利用PCR反應(yīng)篩選陽(yáng)性克隆。

1.2.5STV基因組結(jié)構(gòu)分析使用VectorNTIAdvance11軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校正、拼接。采用NCBI中BLAST程序進(jìn)行相似性查找[35]。使用在線工具ORFFinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)。分別使用在線軟件MAFFT（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/）和ClustalOmega（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列一致性比對(duì)。

1.2.6STV基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育分析利用MEGAX軟件[36]的ClustalW法進(jìn)行多序列比對(duì)，基于STV的全長(zhǎng)基因組核苷酸序列，采用最大似然法（maximumlikelihood，ML）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，bootstrap值設(shè)置為1000。

1.2.7STV群體基因組序列相似性分析為進(jìn)一步明確系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分組中STV分離物在基因組水平上的差異，從組Ⅰ和組Ⅱ中選取29個(gè)代表性分離物，連同本研究獲得的4個(gè)海南分離物，利用SDTv1.2軟件[37]和Simplot3.5軟件[38]進(jìn)行相似性比對(duì)分析。

1.2.8重組分析使用RDP5軟件[39]提供的7種重組檢測(cè)算法（RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan和3Seq）對(duì)STV分離物的全基因組序列進(jìn)行潛在重組事件分析，參數(shù)為軟件默認(rèn)。為了保證分析結(jié)果的可靠性，每個(gè)重組事件至少需要被上述7種算法中的5種所支持。

2結(jié)果與分析

2.1小RNA深度測(cè)序結(jié)果及RT-PCR驗(yàn)證

番茄樣品經(jīng)小RNA深度測(cè)序后獲得22875457條rawreads，質(zhì)控后得到9971315條cleanreads，將質(zhì)控后獲得的序列進(jìn)行拼接組裝，得到1509條contigs，將拼接結(jié)果與NCBI病毒庫(kù)比對(duì)，獲得3條源于病毒的contigs，均匹配到STV基因組，說(shuō)明T-DZ-2樣品中可能含有STV。

為了驗(yàn)證小RNA深度測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，利用STV特異性檢測(cè)引物STV-F和STV-R對(duì)樣品T-DZ-2進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)（圖2），擴(kuò)增到582bp的目標(biāo)條帶，將PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。Blastn比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)條帶序列與已公布的STV基因組序列相似一致性為98.45%～99.83%，說(shuō)明樣品T-DZ-2中存在STV。

2.2STV在海南的發(fā)生與分布

利用STV特異性引物STV-F和STV-R對(duì)2015—2021年采集的987份番茄葉片樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明：在9個(gè)市（縣）的142份樣品中檢測(cè)到STV（圖3、表2）。2015年，僅在陵水和昌江樣品中檢測(cè)到STV。此后STV在海南的發(fā)生分布范圍逐漸擴(kuò)大，檢出率逐年增加，到2021年，在陵水、文昌、昌江、三亞、臨高、定安、樂(lè)東、儋州、瓊海共9個(gè)市（縣）檢測(cè)到STV，檢出率由2015年的8.82%上升到2021年的22.45%。上述結(jié)果說(shuō)明，至少?gòu)?015年開(kāi)始，海南番茄就已經(jīng)被STV感染，而且STV在田間的發(fā)病率總體呈逐年上升趨勢(shì)。

2.3STV全基因組序列分析

使用引物對(duì)STV-F1/STV-R1、STV-GSP5/UPM、STV-GSP3/UPM分別對(duì)海南儋州（T-DZ-2）、陵水（T-LS-52）、定安（T-DA-23）和昌江（T-CJ-15）的4個(gè)STV分離物基因組編碼區(qū)、5′末端和3′末端非編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增（圖4），將測(cè)序獲得的STV基因組編碼區(qū)序列與5′和3′末端序列拼接，4個(gè)分離物的全基因組序列長(zhǎng)度均為3446nt，不含3′-端poly（A）尾，GenBank登錄號(hào)分別為OP484998、OP484999、OP485000、OP485001。STV基因組包含2個(gè)部分重疊的ORFs，ORF1位于基因組147～1280nt，編碼377aa。ORF2位于基因組1048～3336nt，編碼762aa。編碼區(qū)A+T的含量為50.72%～50.75%。在993～999nt之間存在可能有助于核糖體移碼的滑動(dòng)序列GGGAAGA；5′UTR的長(zhǎng)度為146nt，比已公布的STV分離物至少長(zhǎng)8nt，A+T的含量為57.59%～58.12%。3′UTR的長(zhǎng)度為110nt，A+T的含量為68.18%～69.09%。基因組非編碼區(qū)比編碼區(qū)富含更多的A+T。

本研究中的4個(gè)STV海南分離物間基因組核苷酸一致性為99.86%～100.00%，CP、RdRp的核苷酸一致性分別為99.82%～100.00%和99.91%～100.00%，氨基酸一致性分別為99.73%～100.00%和99.87%～100.00%；與我國(guó)已報(bào)道的2個(gè)STV分離物（KY228384，KT438549）的基因組核苷酸一致性分別為99.53%～99.65%和99.07%～99.19%，CP、RdRp的核苷酸一致性分別為99.47%～99.65%和99.26%～99.74%，氨基酸一致性分別為98.67%～99.73%和99.34%～99.61%；與GenBank中所有已公布的76個(gè)STV分離物（截至2022年9月28日）基因組核苷酸一致性為98.45%～99.94%，CP、RdRp的核苷酸序列一致性分別為98.68%～100.00%和98.38%～100.00%，氨基酸序列一致性分別為98.41%～100.00%和98.95%～100.00%。與所有已知的STV分離物全基因組核苷酸序列一致性為98.28%～100.00%，CP、RdRp的核苷酸一致性分別為98.41%～100.00%和97.99%～100.00%，氨基酸一致性分別為97.61%～100.00%和98.29%～100.00%。

2.4STV的系統(tǒng)發(fā)育和重組分析

基于80個(gè)STV分離物的全基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，STV分離物明顯分為2個(gè)組，組Ⅰ包括亞洲、美洲、歐洲和非洲分離物；組Ⅱ中除1個(gè)亞洲分離物外，其他均為歐洲分離物；歐洲的斯洛文尼亞分離物在組Ⅰ和組Ⅱ均有分布。我國(guó)的6個(gè)STV分離物中，4個(gè)海南分離物在同一個(gè)小的進(jìn)化分支上，與新疆分離物（KY228384）一起分在組Ⅰ，山東分離物（KT438549）分在組Ⅱ；泰國(guó)辣椒分離物（LC487710）和法國(guó)龍葵分離物（MN216388）分在組Ⅰ，與其他番茄分離物在小的進(jìn)化支上，未單獨(dú)分支（圖5）。

全基因組重組分析結(jié)果表明，80個(gè)STV分離物基因組間未發(fā)現(xiàn)重組事件。

2.5STV群體基因組序列相似性分析

為明確系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分組中STV分離物在基因組水平上的差異，從組Ⅰ和組Ⅱ中選取29個(gè)代表性分離物，與本研究獲得的4個(gè)海南分離物，進(jìn)一步利用SDT軟件（圖6）和Simplot軟件（圖7）進(jìn)行相似性分析，發(fā)現(xiàn)4個(gè)STV海南分離物的核苷酸序列與組Ⅰ中用于分析的其他STV分離物間的相似性為99.65%～100.00%，基因組序列變異度比較高的區(qū)域位于881～1061nt和1521～1721nt；4個(gè)STV海南分離物的核苷酸序列與組Ⅱ中的分離物相似性為98.72%～99.07%，基因組序列變異度比較高的區(qū)域位于2041～2241nt和2761～2921nt。

3討論

南方番茄病毒經(jīng)常與其他病毒復(fù)合侵染番茄，如在我國(guó)北京房山，STV與番茄黃化曲葉病毒（Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV）、番茄褪綠病毒（Tomatochlorosisvirus，ToCV）復(fù)合侵染番茄[26]；在意大利，STV與鳳果花葉病毒（Pepinomosaicvirus，PepMV）和馬鈴薯Y病毒（PotatovirusY，PVY）復(fù)合侵染番茄[11]，故STV單獨(dú)侵染引起的寄主癥狀尚不明確。但本研究通過(guò)小RNA深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)1株單獨(dú)侵染番茄的STV分離物，田間癥狀表現(xiàn)為葉脈壞死、葉脈間不均勻褪綠，這些癥狀與HARJU等[16]在英國(guó)南部發(fā)現(xiàn)的STV單獨(dú)侵染番茄的表現(xiàn)癥狀極為相似，與美國(guó)加利福尼亞的因皮里爾河谷[1]、密西西比州東北部和墨西哥西南部[2]發(fā)現(xiàn)的STV引起的番茄感病癥狀存在明顯不同。STV有時(shí)也會(huì)在健康植株上檢測(cè)到[17，40]，研究人員甚至發(fā)現(xiàn)感染STV的番茄植株不僅會(huì)結(jié)出更多的果實(shí)，而且結(jié)出的種子發(fā)芽率也高于無(wú)STV感染的植株[8]。根據(jù)上述研究結(jié)果推測(cè)：STV可能不僅存在致病性分化，而且同一毒株對(duì)同一寄主植物不同品種的致病性也有很大差異。

所有已知的STV分離物全基因組核苷酸序列一致性為98.28%～100.00%，說(shuō)明不同地理來(lái)源的STV基因組序列變異率低，具有高度保守性。全基因組重組分析也未發(fā)現(xiàn)重組現(xiàn)象，與ELVIRAGONZáLEZ等[14]的分析結(jié)果一致。

GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（截至2022年9月28日）中共有119條STV序列，其中76條為全基因組序列[9]。STV的自然寄主均為茄科植物，除3個(gè)分離物的寄主為辣椒（LC487710）、龍葵（MN216388）和燈籠果（MN417999）外，其他分離物的寄主均為番茄[8]?；谌蚪M序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，所有的STV分離物被明顯分為2個(gè)組。除中國(guó)分離物（5個(gè)被分在組Ⅰ，1個(gè)被分在組Ⅱ）、塞爾維亞（4個(gè)被分在組Ⅰ，1個(gè)被分在組Ⅱ）和斯洛文尼亞分離物（6個(gè)被分在組Ⅰ，16個(gè)被分在組Ⅱ）外，同一國(guó)家的分離物均在同一組內(nèi)，如5個(gè)法國(guó)分離物、15個(gè)土耳其分離物、2個(gè)英國(guó)分離物、3個(gè)美國(guó)分離物和4個(gè)越南分離物均被分在組Ⅰ，2個(gè)德國(guó)分離物和2個(gè)瑞士分離物均被分在組Ⅱ。泰國(guó)辣椒分離物（LC487710）和法國(guó)龍葵分離物（MN216388）被分在組Ⅰ（STV燈籠果分離物的序列片段不完整，未參與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建），與其他番茄分離物在小的進(jìn)化支上，未單獨(dú)分支。說(shuō)明STV分離物的分組與地域存在一定相關(guān)性，而與寄主植物之間不存在相關(guān)性。由于STV分離物主要來(lái)自番茄，而來(lái)自其他寄主植物的報(bào)道還較少，上述推論還需要更多的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。

2011年，我國(guó)首次在新疆番茄上發(fā)現(xiàn)STV，目前該病毒至少已在10個(gè)省（區(qū)）的番茄植株上檢測(cè)到[3，8，21-29]，XU等[41]研究認(rèn)為STV已經(jīng)成為我國(guó)番茄上第四大流行病毒。本研究結(jié)果表明，早在2015年，海南陵水和昌江的田間番茄上就已存在STV。到2021年，STV已在陵水、文昌、昌江、三亞、臨高、定安、樂(lè)東、儋州、瓊海共9個(gè)市（縣）檢測(cè)到，STV在海南的發(fā)生分布范圍逐漸擴(kuò)大，發(fā)病率逐年上升。因?yàn)镾TV是嚴(yán)格的種傳病毒，有必要開(kāi)展制種田中番茄的抽樣檢測(cè)工作，對(duì)番茄種子實(shí)行嚴(yán)格檢疫，同時(shí)加強(qiáng)STV的田間監(jiān)測(cè)，及時(shí)清理早期感病植株，對(duì)STV的綜合防控具有重要意義。