張洋，趙辰戈，程荔春，呂慧怡，3，吳迪

（1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧大連 116023；2.大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116044；3.大連科翔生物科技有限公司，遼寧大連 116085）

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，長期以來其死亡率位居?jì)D科腫瘤首位［1］?；瘜W(xué)療法是治療卵巢癌的首選手段，而化療耐藥是導(dǎo)致治療失敗的主要原因［2］。紫杉醇作為治療卵巢癌的一線藥物，發(fā)揮著不可或缺的作用，而耐藥性的產(chǎn)生限制了其臨床應(yīng)用，其機(jī)制尚不明確［3］。

微RNA（microRNA，miRNA）是一組長度為21～25 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，通過與互補(bǔ)靶向信使RNA 結(jié)合而抑制或降解信使RNA 翻譯［4］，在細(xì)胞分化、增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用。研究報(bào)道，卵巢癌的發(fā)生發(fā)展與miRNA表達(dá)密切相關(guān)，miRNA可通過調(diào)控不同靶基因發(fā)揮抑癌或促癌作用［5-6］。例如，miR-212 和miR-31 在卵巢癌中低表達(dá)，可作為卵巢癌的標(biāo)志基因［7-8］；miR-142-5p，miR-203 和miR-373通過靶基因影響卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲以及耐藥性［9-11］。

近幾年，miR-152 被較多關(guān)注，其與miR-148a和miR-148b共同構(gòu)成miR-148/52家族［12］。miR-152功能復(fù)雜多樣，與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。據(jù)報(bào)道，胃癌中miR-152過表達(dá)可明顯抑制癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，抑制胃癌的發(fā)生發(fā)展［13］。miR-152-3p與卵巢癌發(fā)生亦密切相關(guān)。Li等［14］報(bào)道，miR-152-3p通過抑制酪氨酸激酶受體的編碼基因人表皮生長因子受體3（ERBB3）表達(dá)參與卵巢癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。He等［15］報(bào)道，早期生長反應(yīng)因子1通過與自噬相關(guān)基因14（autophagy-related gene 14，ATG14）相互作用上調(diào)miR-152-3p 轉(zhuǎn)錄。ATG14是miR-152-3p調(diào)節(jié)自噬的功能靶基因，可抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，并降低癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性。然而，miR-152-3p 對紫杉醇卵巢癌耐藥細(xì)胞的影響尚未見報(bào)道。本研究探討miR-152-3p對紫杉醇耐藥卵巢癌細(xì)胞A2780T 耐藥性的影響，以期為卵巢癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和主要儀器

人卵巢癌A2780和A2780T細(xì)胞購自上海美軒生物科技有限公司?？俁NA 提取試劑Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）試劑盒（中國TransGen Biotech公司）；MTT 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技公司）；Annexin Ⅴ/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；miR-152-3p抑制物（上海吉瑪制藥有限公司）；兔抗人P 糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）抗體、兔抗人多藥耐藥相關(guān)蛋白1（multidrug resistance associated protein 1，MRP1）、兔抗人三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G2（ATP-binding cassette G2，ABCG2）、兔抗人BCL2關(guān)聯(lián)X蛋白（Bax）、兔抗人Bcl-2、兔抗人磷酸酯酶張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）、鼠抗人GAPDH單克隆抗體（一抗）（美國Abcam公司）；脂質(zhì)體Lipo2000、胎牛血清、RPMI 1640 和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔或鼠IgG 抗體（二抗）及miR-152-3p，U6，PTEN和GAPDH引物（表1）（美國Invitrogen 公司）。165-8001 電泳儀（美國BIO-RAD公司）和Countess?ⅡFL全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國Llfe Technologles 公司）；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（美國Thermo Scientific 公司）；Odyssey Dlx 雙色紅外激光掃描成像系統(tǒng)（美國LICOR公司）。

Tab.1 Primer sequences for real-time quantitative PCR（RT-qPCR）

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

A2780 和A2780T 細(xì)胞用RPMI 1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青霉素和鏈霉素）于37 ℃，5% CO2和飽和濕度培養(yǎng)。A2780T 細(xì)胞用濃度為200 μg·L-1的紫杉醇培養(yǎng)以維持耐藥性。實(shí)驗(yàn)前，A2780T 細(xì)胞棄藥培養(yǎng)7 d，以避免藥物毒性對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞存活率

取對數(shù)生長期的A2780和A2780T細(xì)胞接種于96 孔板，每孔1×104細(xì)胞，加入不同濃度紫杉醇（1.875，3.75，7.5，17 和23 μmol·L-1），同時(shí)設(shè)空白對照組（無細(xì)胞）和細(xì)胞對照組（無藥物），每組設(shè)3復(fù)孔。孵育48 h后加入MTT（5 g·L-1）50 μL繼續(xù)孵育4 h，每孔加入二甲亞砜150 μL，于570 nm 處測定吸光度值（A570nm）。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A570nm-空白對照組A570nm）/（細(xì)胞對照組A570nm-空白對照組A570nm）×100%。采用Graphpad Prism 8.2.1 軟件計(jì)算IC50值，并計(jì)算耐藥指數(shù)（resistance index，RI）。RI=A2780T細(xì)胞IC50/A2780細(xì)胞IC50。

1.4 miR-152-3p抑制物和PTEN siRNA轉(zhuǎn)染A2780T細(xì)胞

用Lipo2000 對對數(shù)生長期的A2780T 進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，miR-152-3p 抑制物、PTEN siRNA 及其相應(yīng)陰性對照序列見表2。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 d，細(xì)胞聚合度達(dá)90%，進(jìn)行六孔板鋪板。將A2780T 細(xì)胞以3.0×108·L-1均勻鋪于六孔板，細(xì)胞聚合度達(dá)60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。首先，每孔用PBS 1 mL 清洗2 次，加入無雙抗培養(yǎng)基1.5 mL。將miR-152-3p抑制物或PTEN siRNA 10 μL 及其相應(yīng)陰性對照分別溶于250 μL無血清培養(yǎng)基中混勻，室溫靜置5 min；同時(shí)將Lipo2000 5 μL 溶于250 μL 無血清培養(yǎng)基中混勻，室溫靜置5 min。將2 種液體混勻，室溫放置20 min；隨后將混合液加入6 孔板中混勻，6 h 后將培養(yǎng)液換成含10%血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h 進(jìn)行蛋白質(zhì)提取、RNA 提取和流式細(xì)胞術(shù)測定。

Tab.2 Primer sequences of microRNA and small interfering RNA（siRNA）

1.5 Western 印跡法檢測A2780T 和A2780 細(xì)胞多藥耐藥蛋白P-gp，MRP1 和ABCG2 表達(dá)水平及A2780T細(xì)胞凋亡蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)水平

A2780、A2780T 和轉(zhuǎn)染miR-152-3p 抑制物或PTEN siRNA 的A2780T 細(xì)胞培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，用RIPA 裂解液和PMSF 于冰上充分裂解細(xì)胞，收集并離心獲得細(xì)胞總蛋白。BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度并定量后予以蛋白變性，隨后進(jìn)行SDS-PAGE分離、濕法轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉（室溫1 h）和一抗（抗P-gp，MRP1 和ABCG2 抗體：1∶5000；抗Bax和Bcl-2 抗體：1∶1000；抗PTEN 抗體：1∶2000；抗GAPDH 抗體：1∶10 000）4 ℃孵育過夜，次日用二抗（HRP 標(biāo)記山羊抗兔或鼠IgG 抗體：1∶10 000）室溫避光孵育1 h，Odyssey?Dlx 雙色紅外激光成像系統(tǒng)顯影獲取蛋白條帶。采用Image J 軟件對蛋白條帶進(jìn)行積分吸光度分析，以待測蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH 條帶的積分吸光度比值表示待測蛋白相對表達(dá)水平。

1.6 RT-qPCR檢測A2780和A2780T細(xì)胞miR-152-3p和PTEN mRNA表達(dá)水平

待A2780和A2780T細(xì)胞聚合度＞90%，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行RT-qPCR，檢測miR-152-3p 和PTENmRNA 水平。反應(yīng)體系：cDNA 0.4 μL（2 μg），PCR 上下游引物各0.4 μL，SYBR GreenⅠ熒光染料混合物10.0 μL 和DEPC水8.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95℃5 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。GAPDH或U6作為內(nèi)參基因，待測基因表達(dá)水平用2-△△Ct表示。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

培養(yǎng)轉(zhuǎn)染miR-152-3p 的A2780T 細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁時(shí)用200 μL 的無菌槍頭在細(xì)胞貼壁部分劃出一個(gè)“十”字型，PBS 洗掉脫落的細(xì)胞，倒置顯微鏡下拍照記錄0 h細(xì)胞劃痕寬度。繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h后，用PBS 洗掉漂浮的細(xì)胞，倒置顯微鏡下分別拍照，記錄培養(yǎng)24 和48 h 細(xì)胞劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移面積。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測A2780T細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染miR-152-3p 抑制物的A2780T 細(xì)胞經(jīng)不含EDTA 的胰蛋白酶消化后，用預(yù)冷PBS 洗滌2 次并重懸于500 μL預(yù)冷的結(jié)合緩沖液中，按細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行Annexin V-FITC 和碘化丙啶（PI）染色，通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率（含早期和晚期凋亡率）。

1.9 在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-152-3p的靶基因

利用基因數(shù)據(jù)庫miRDB（V6.0，http：//www.mirdb.org），Targetscan（V7.2，http：//www.targetscan.org），miRWalk（V3.0，http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de）和Starbase（V3.0，http：//starbase.sysu.edu.cn）4 個(gè)在線預(yù)測工具，以“hsamiR-152-3p”為搜索詞進(jìn)行檢索并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分別獲取各軟件預(yù)測到的靶基因；利用在線集合統(tǒng)計(jì)軟件VENNY2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html），取4 個(gè)預(yù)測軟件預(yù)測得到的靶基因的交集。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 A2780T細(xì)胞紫杉醇耐藥性的鑒定

MTT 法檢測結(jié)果（圖1A）表明，紫杉醇處理后A2780T 細(xì)胞存活率明顯高于A2780 細(xì)胞（P＜0.01）；A2780T 細(xì)胞的IC50值為（3.4±0.6）mg·L-1，A2780細(xì)胞為（1.20±0.04）mg·L-1（P＜0.01）；A2780T細(xì)胞的耐藥指數(shù)為2.8。Western 印跡法檢測結(jié)果（圖1B）表明，A2780T 細(xì)胞多藥耐藥蛋白P-gp，MDR1 和ABCG2 表達(dá)明顯高于A2780 細(xì)胞（P＜0.01）；表明A2780T細(xì)胞對紫杉醇具有耐藥性。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-152-3p抑制物對A2780T細(xì)胞增殖、遷移、凋亡及紫杉醇耐藥的影響

RT-qPCR 檢測結(jié)果表明，A2780T 細(xì)胞中miR-152-3p表達(dá)水平比A2780細(xì)胞高（43.0±6.3）倍（P＜0.01，圖2A）。轉(zhuǎn)染miR-152-3p 抑制物后，A2780T中miR-152-3p表達(dá)抑制率達(dá)97%（P＜0.01，圖2B）。

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-152-3p抑制物組A2780T 細(xì)胞培養(yǎng)24 和48 h 細(xì)胞遷移面積明顯小于轉(zhuǎn)染miR-152-3p 陰性對照組（P＜0.05，圖2C），表明miR-152-3p 低表達(dá)可抑制A2780T 細(xì)胞的遷移能力。

MTT 法結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-152-3p 抑制物組A2780T 細(xì)胞與紫杉醇1.875，3.75，7.5，17 和23 μmol·L-1孵育48 h，細(xì)胞存活率（P＜0.05，P＜0.01，圖2D1）和IC50值（P＜0.05，圖2D2）均明顯低于轉(zhuǎn)染miR-152-3p 陰性對照組，表明抑制miR-152-3p表達(dá)可降低A2780T細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性。

Fig.1 ldentification of paclitaxel（PTX）resistant cells A2780T.A：A2780 and A2780T cells were incubated with PTX 1.875，3.75，7.5，17 or 23 μmol·L-1 for 48 h.The cell viability was detected by MTT assay.Cell viability（%）=（A570 nm of experimental group-A570 nm of blank control group）/（A570 nm of cell control group-A570 nm of blank control group）×100%.B：the protein expressions of P-glycoprotein（P-gp），multidrug resistance gene 1（MDR1）and ATP-binding cassette G2（ABCG2）measured by Western blotting，B2 was the semi-quantitative result of B1.IA：integrated absorbance.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with A2780 cells.

Fig.2 Effect of transfecting miR-152-3p inhibitor on proliferation，migration and drug resistance in A2780T cells.A：expression level of miR-152-3p in A2780 and A2780T cells detected by RT-qPCR.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with A2780 cells.B：verification of knockdown efficiency of miR-152-3p in A2780T cells using RT-qPCR after transfecting miR-152-3p inhibitor for 24 h.The miR-152-3p inhibitor was transfected using a lipid-mediated transient transfection technique，while miR-152-3p negative control（miR-152-3p NC）group was simultaneously established.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with miR-152-3p NC group.C：the migration ability of A2780T cells detected by scratch after transfecting for 24 h，C2 was the quantitative result of C1.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with miR-152-3p NC group at the same time.D：the cell viability（D1）and IC50（D2）of transfected A2780T cells incubated with PTX for 48 h detected by MTT assay.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with miR-152-3p NC group.

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-152-3p 抑制物組A2780T細(xì)胞凋亡率明顯高于轉(zhuǎn)染miR-152-3p 陰性對照組（P＜0.05，圖3A）。Western 印跡法結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染miR-152-3p陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-152-3p 抑制物組凋亡蛋白Bax 表達(dá)升高（P＜0.01），Bcl-2 表達(dá)降低（P＜0.05，圖3B）；提示miR-152-3p低表達(dá)可促進(jìn)A2780T細(xì)胞凋亡。

Fig.3 Effect of transfecting miR-152-3p inhibitor on apoptosis of A2780T cells.See Fig.2B for transfecting miR-152-3p inhibitor.A：apoptosis rate detected by flow cytometry，A2 was the quantitative result of A1.B：protein expressions of Bax and Bcl-2 measured by Western blotting，B2 was the semiquantitative result of B1.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with miR-152-3p NC group.

2.3 miR-152-3p 調(diào)控PTEN 參與A2780T 細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性

2.3.1 生物信息學(xué)預(yù)測miR-152-3p的靶向基因

利用基因數(shù)據(jù)庫miRDB，Targetscan，miRWalk和Starbase 等4 個(gè)在線預(yù)測工具預(yù)測miR-152-3p的靶基因，共篩選出308 個(gè)基因（圖4A）。結(jié)合PubMed 文獻(xiàn)查閱，最終得到與卵巢癌相關(guān)的靶向基因PTEN。數(shù)據(jù)庫分析顯示，在卵巢癌中miR-152-3p 與PTEN的關(guān)系呈正相關(guān)（圖4B），并且PTEN與miR-152-3p 有多個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)（圖4C）。

Fig.4 Targeted genes for miR-152-3p predicted by bioinformatics.A：venn diagram intersection of prediction results of miR-152-3p in TargetScan，miRDB，miRWalk，and Starbase databases；B：PTEN was positively correlated with miR-152-3p showed by StarBase database；C：displayed consequential pairing of target region（top）and miRNA（bottom）and the binding site of the target sequence displayed through the TargetScan database.

2.3.2 miR-152-3p靶基因的驗(yàn)證

Western 印跡法進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-152-3p 抑制物后，與其陰性對照組相比，A2780T 細(xì)胞PTEN 表達(dá)顯著降低（P＜0.05，圖5A），表明A2780T細(xì)胞miR-152-3p表達(dá)下調(diào)的同時(shí)，PTEN 蛋白表達(dá)亦顯著降低。用RT-qPCR 檢測PTENmRNA 在A2780 和A2780T 細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果顯示，A2780T 細(xì)胞中PTENmRNA 表達(dá)亦明顯高于A2780細(xì)胞（P＜0.01，圖5B）。

Fig.5 Verification of target gene of miR-152-3p.A：the expression level of PTEN protein in transfected A2780T cells by Western blotting.See Fig.2B for transfecting miR-152-3p inhibitor.A2 was the semi-quantitative result of A1.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with miR-152-3p NC group.B：the expression level of PTEN mRNA in A2780 and A2780T cells detected by RT-qPCR.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with A2780 cells.

2.3.3 下調(diào)PTEN 表達(dá)降低A2780T 細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性

通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染PTEN siRNA，沉默A2780T細(xì)胞中PTEN表達(dá)。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染PTEN siRNA 組A2780T 細(xì)胞PTENmRNA 降低60%（P＜0.05，圖6A）。MTT結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染PTEN siRNA組A2780T細(xì)胞存活率（P＜0.05，P＜0.01，圖6B1）和IC50值（P＜0.01，圖6B2）均降低。Western 印跡法檢測結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染siRNA陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染PTEN siRNA組A2780T細(xì)胞P-gp，MRP1 和ABCG2 蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05，P＜0.01，圖6C）。由此表明，下調(diào)PTEN表達(dá)可降低A2780T細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性。

Fig.6 Effect of transfecting PTEN siRNA on proliferation and drug resistance in A2780T cells.See Fig.2B for transfecting PTEN siRNA.A：transfection efficiency assessed using RT-qPCR after transfecting A2780T cells with PTEN siRNA for 24 h.B：the cell viability（B1）and IC50（B2）of transfected A2780T cells incubated with PTX for 48 h detected by MTT assay.C：protein expressions of P-gp，MRP1 and ABCG2 measured by Western blotting，C2 was the semi-quantitative result of C1.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with siRNA NC group.

3 討論

卵巢癌是預(yù)后最為不良的婦科腫瘤，高死亡率是卵巢癌的標(biāo)志性特征，主要原因是疾病復(fù)發(fā)和化療耐藥［16］。已有大量研究表明，miRNA是卵巢癌的標(biāo)志性分子，可以通過調(diào)節(jié)多種信號通路影響卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及耐藥［17］，如miR-136 與人上皮卵巢癌的原發(fā)性順鉑耐藥相關(guān)，miR-200c 和miR-141也被證實(shí)為卵巢癌的潛在診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物［18-20］。然而，miR-152-3p在紫杉醇耐藥卵巢癌中的生物學(xué)功能和分子機(jī)制仍不清楚。

本研究觀察了miR-152-3p 對A2780T 細(xì)胞紫杉醇耐藥的作用。首先對A2780T細(xì)胞的紫杉醇耐藥性進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，A2780T細(xì)胞耐藥指數(shù)為2.8；且P-gp，MRP1和ABCG2蛋白表達(dá)均高于紫杉醇敏感細(xì)胞A2780，表明A2780T細(xì)胞對紫杉醇具有耐藥性。隨后用RT-qPCR 法檢測了miR-152-3p在A2780T 和A2780 細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果表明，A2780T細(xì)胞中miR-152-3p表達(dá)明顯高于A2780 細(xì)胞，提示miR-152-3p 對A2780T 細(xì)胞耐藥發(fā)揮作用。用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染miR-152-3p 抑制物降低A2780T 細(xì)胞中miR-152-3p 表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染miR-152-3p 陰性對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-152-3p抑制物后A2780T細(xì)胞存活率和細(xì)胞遷移能力明顯降低，細(xì)胞凋亡率升高，且Bax 蛋白表達(dá)增加，Bcl-2 蛋白表達(dá)降低。上述結(jié)果表明，抑制miR-152-3p表達(dá)可抑制A2780T細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低A2780T細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性。

已有研究表明，miRNA 可與目的蛋白信使RNA 的3′UTR 端結(jié)合，導(dǎo)致目的基因信使RNA 裂解或降解，從而對目的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，抑制其表達(dá)［21］。雖然miRNA 被廣泛認(rèn)為負(fù)向調(diào)控下游靶基因，但也有來自體外實(shí)驗(yàn)的證據(jù)表明，miRNA也可以激活基因表達(dá)，如miR-93-5p 正向調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶2（MAP3K2）水平抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移［22］；以鳥嘌呤序列結(jié)合因子1 介導(dǎo)的miR-G-10 正向調(diào)控磷脂酰肌醇-3-激酶調(diào)控亞基3水平激活蛋白激酶B/NF-κB信號通路抑制宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲［23］。據(jù)報(bào)道，心臟疾病、糖尿病和非小細(xì)胞肺癌等miR-152-3p 與PTEN 呈負(fù)向調(diào)控關(guān)系［24-26］。然而，在紫杉醇耐藥卵巢癌細(xì)胞中miR-152-3p 與PTEN 的靶向關(guān)系未見報(bào)道。本研究用miRDB，Targetscan，miRWalk 和Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-152-3p的靶基因。結(jié)果表明，PTEN是miR-152-3p的一個(gè)靶基因。用Western印跡法檢測轉(zhuǎn)染miR-152-3p 抑制物后A2780T 細(xì)胞PTEN 蛋白表達(dá)的變化及RT-PCR 檢測A2780 和A2780T 細(xì)胞PTENmRNA 表達(dá)水平予以驗(yàn)證。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-152-3p 抑制物后A2780T 細(xì)胞PTEN 蛋白表達(dá)低于轉(zhuǎn)染miR-152-3p陰性對照組，且A2780T細(xì)胞PTENmRNA表達(dá)水平高于A2780細(xì)胞。為此，用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染PTEN siRNA沉默A2780T細(xì)胞中PTEN表達(dá)。結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染siRNA 陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染PTEN siRNA沉默PTEN表達(dá)后A2780T 細(xì)胞存活率和IC50值顯著減低，P-gp，MRP1 和ABCG2 蛋白表達(dá)降低。由此提示，PTEN作為miR-152-3p 的靶基因，可能受miR-152-3p的正向調(diào)控，影響A2780T 細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性，其潛在機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

本研究的局限性在于僅用A2780T 細(xì)胞進(jìn)行了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，若進(jìn)一步探討具體的分子機(jī)制，尚需用其他卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞如紫杉醇耐藥細(xì)胞SKOV-3/Taxol等進(jìn)行深入研究。

綜上所述，miR-152-3p 在A2780T 細(xì)胞中高表達(dá)，其表達(dá)下調(diào)可抑制A2780T 細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低A2780T 細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性，該作用可能是通過降低其靶基因PTEN表達(dá)發(fā)揮的。本研究或?qū)閷ふ也⒎治雎殉舶┳仙即寄退幍闹委煱悬c(diǎn)提供新方向，并為臨床逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥、提高卵巢癌治療效果提供參考。