李萌，施浩，陳佳俊，呂家樂，秦雪梅，杜冠華，4，周玉枝

（山西大學(xué)1.中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，2.化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3.地產(chǎn)中藥功效物質(zhì)研究與利用山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原 030006；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京 100050）

抑郁癥是一種復(fù)雜的精神疾病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為抑郁心境、情緒低落、認(rèn)知障礙甚至自殺傾向，嚴(yán)重威脅人類健康［1］。目前臨床常用抗抑郁藥物如選擇性5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取抑制劑等，存在見效慢、作用靶點(diǎn)單一、且常伴有認(rèn)知功能損害等不良反應(yīng)［2-3］。中藥在抑郁癥的治療中具有多成分、多靶點(diǎn)且毒副作用小的獨(dú)特優(yōu)勢［4-6］，因此，從中藥中開發(fā)具有良好抗抑郁活性的天然化合物日益得到研究者們的關(guān)注。柴胡（Bupleurum chinenseDC.）是傘形科植物柴胡的干燥根，具有解表退熱、疏肝解郁等功效，臨床應(yīng)用較廣［7］。柴胡皂苷是柴胡的主要活性成分，具有抗抑郁［8］、抗癲癇［9］、治療神經(jīng)性疼痛［10］和調(diào)節(jié)免疫［11-12］等藥理作用。柴胡皂苷的活性成分包括柴胡皂苷a（saikosaponin a，SSa）、SSb2 和SSd 等［13］，其中柴胡總皂苷［14］、SSa［15-16］和SSd［17-18］的抗抑郁作用已有文獻(xiàn)報(bào)道。李軍等［19］研究發(fā)現(xiàn)，SSd 在柴胡煎煮過程中進(jìn)入煎液幾乎全部轉(zhuǎn)化為SSb2。同時(shí)，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SSb2 生物利用度的提高與柴胡-白芍藥對(duì)的抗抑郁作用增效有關(guān)［20］，提示SSb2 有潛在的抗抑郁活性。為此，本研究采用皮質(zhì)酮（corticosterone，CORT）誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷模型探討SSb2的神經(jīng)保護(hù)作用。

CORT 是一種在機(jī)體受到應(yīng)激反應(yīng)時(shí)釋放的糖皮質(zhì)激素，它能夠引起海馬神經(jīng)元的凋亡，在抑郁癥的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用［21］。PC12 細(xì)胞具有腦神經(jīng)元的典型特征，使用高濃度CORT 與其共培養(yǎng)能誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷，模擬抑郁癥的神經(jīng)元損傷狀態(tài)［22］，該模型已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于抑郁癥的體外研究［23-25］。代謝組學(xué)可以反映機(jī)體由病理或生理刺激產(chǎn)生的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分［26］。它可基于高通量質(zhì)譜技術(shù)、聚類指數(shù)分析和數(shù)據(jù)處理，篩選和識(shí)別與疾病表型相關(guān)的差異代謝物，被廣泛應(yīng)用于抑郁癥生物標(biāo)志物的研究領(lǐng)域［27］。目前，越來越多研究者通過細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)研究藥物的作用機(jī)制，包括CORT 誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的代謝組學(xué)研究［28-29］。

綜上所述，本研究采用CORT 誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷模型，運(yùn)用細(xì)胞藥理學(xué)和基于超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）的代謝組學(xué)技術(shù)探討SSb2 的神經(jīng)保護(hù)作用，旨在為抗抑郁藥物的研發(fā)提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

SSb2（批號(hào)：18053005，高效液相色譜純度≥98%），成都普菲德生物技術(shù)有限公司；CORT，成都華夏化學(xué)試劑有限公司；青霉素、鏈霉素、胰酶、胎牛血清和RPMI 1640 培養(yǎng)基，美國HyClone 公司；二甲亞砜、MTT 和多聚賴氨酸，美國Sigma-Aldrich公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒（貨號(hào)：A020-2-2）、細(xì)胞凋亡熒光Hoechst33342/PI 雙染試劑盒（貨號(hào)：G023-1-1）、谷氨酸檢測試盒（貨號(hào)：A074-1-1）和谷氨酰胺酶活性試劑盒（貨號(hào)：A124-1-1），南京建成生物工程研究所；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；LC-MS 級(jí)乙腈和高效液相色譜級(jí)甲酸，美國Thermo Fisher Scientific公司。

LC-20AD型超高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司；Triple TOF 5600質(zhì)譜儀，美國ABSciex公司；HF Safe1800 生物安全柜、HF90 CO2培養(yǎng)箱和Neofuge 1600R 臺(tái)式高速離心機(jī)，中國力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；Nikon Eclipse Ti-S 熒光倒置顯微鏡，日本Nikon 公司；SCIENTZ-12N 真空冷凍干燥機(jī)和UP-250 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；M200 多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；高速冷凍離心機(jī)，上海力新儀器有限公司；FACS CaliburⅡ流式細(xì)胞儀，美國BD Biosciences公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

低分化PC12 細(xì)胞，中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。實(shí)驗(yàn)使用第10～15 代的PC12 細(xì)胞，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、青霉素10 kU·L-1和鏈霉素10 kU·L-1的RPMI 1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

1.3 PC12細(xì)胞CORT損傷模型構(gòu)建、分組和給藥

為篩選CORT 的最佳造模濃度和SSb2 對(duì)正常PC12 細(xì)胞的毒性，取對(duì)數(shù)生長期的PC12 細(xì)胞，以2×108L-1的密度接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被的96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL。①將細(xì)胞分為細(xì)胞對(duì)照組、CORT 組和SSb2 組。細(xì)胞對(duì)照組用RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；CORT組用CORT 100～800 μmol·L-1孵育24 h；SSb2 組用SSb2 1.5625，3.125，6.25，12.5，25，50 和100 μmol·L-1孵育24 h。MTT 法檢測細(xì)胞存活率，篩選出CORT 的最佳造模濃度和SSb2的無毒濃度范圍進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。②將細(xì)胞分為細(xì)胞對(duì)照組（RPMI-1640 培養(yǎng)基孵育24 h）、模型組（CORT 400 μmol·L-1孵育24 h）、模型+SSb2 組（SSb2 1.5625，3.125，6.25，12.5 和25 μmol·L-1預(yù)處理3 h，去上清，然后加入CORT 400 μmol·L-1及SSb2 1.5625，3.125，6.25，12.5 和25 μmol·L-1共孵育24 h），MTT 法檢測細(xì)胞存活率，微板法檢測PC12細(xì)胞LDH釋放率。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞存活率

取對(duì)數(shù)生長期的PC12 細(xì)胞，以2×108L-1的密度接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被過的96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μL。CORT損傷模型構(gòu)建和分組給藥同1.3，每組6 復(fù)孔。吸去孔中液體后，每孔加入含MTT 0.5 g·L-1的RPMI 1640培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入DMSO 100 μL 溶解沉淀物，微孔板振蕩器混勻10 min，用酶標(biāo)儀在波長570 nm 條件下測定吸光度值（A570nm）。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A570nm-空白對(duì)照組A570nm）/（細(xì)胞對(duì)照組A570nm-空白對(duì)照組A570nm）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 微板法檢測PC12細(xì)胞LDH釋放率

取對(duì)數(shù)生長期的PC12 細(xì)胞，以2×108L-1的密度接種于24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔500 μL，培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為細(xì)胞對(duì)照組、模型組和模型+SSb2組（給藥方式同1.3②），每組6復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔中加入細(xì)胞裂解液（含1% Trition X-100的PBS）500 μL，按照試劑盒說明書進(jìn)行樣本處理，用酶標(biāo)儀在波長450 nm 條件下測定各組樣本吸光度值（A450nm）。LDH 釋放率（%）=細(xì)胞培養(yǎng)液A450nm/（細(xì)胞培養(yǎng)液A450nm+細(xì)胞裂解液A450nm）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Annexin V-FlTC/Pl 流式細(xì)胞術(shù)檢測PC12 細(xì)胞凋亡率

取對(duì)數(shù)生長期的PC12 細(xì)胞，以2×108L-1的密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為細(xì)胞對(duì)照組、模型組和模型+SSb2 12.5 μmol·L-1組（給藥方式同1.3②），每組設(shè)3復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液。用1×Annexin V-FITC/PI工作液孵育15 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.7 UPLC-Q-TOF-MS 法檢測PC12 細(xì)胞代謝組變化

1.7.1 細(xì)胞藥物處理和UPLC-Q-TOF-MS樣本制備

取對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，以2×108L-1的密度接種于10 cm 培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿10 mL，培養(yǎng)24 h 后，將細(xì)胞分為細(xì)胞對(duì)照組、模型組和模型+SSb2 12.5 μmol·L-1組（給藥方式同1.3②），每組6皿。各組分別培養(yǎng)24 h 后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液；PBS 洗細(xì)胞2次，培養(yǎng)皿放置在冰上并加2 mL甲醇水（4∶1），用細(xì)胞刮板刮下細(xì)胞，置于-80 ℃冰箱過夜，取出后于冰上超聲破碎，以18 000×g4 ℃離心20 min，取上清；在細(xì)胞沉淀物添加500 μL 甲醇水（4∶1），渦旋1 min，以18 000×g4 ℃離心5 min，取上清液；合并2 次上清液并凍干。凍干的樣品用100 μL 甲醇水（4∶1）復(fù)溶，旋渦2 min，超聲10 min，4 ℃，18 000×g離心10 min，將上清液收集于液相小瓶中。另各取上述3組樣本20 μL，混合后作為質(zhì)量控制樣本。

1.7.2 UPLC-Q-TOF-MS測試分析條件

流動(dòng)相：A（水，含0.1%甲酸），B（乙腈，含0.1%甲酸）；流動(dòng)相梯度：0～2 min，0%～2%B；2～3 min，2%～35%B；3～10 min，35%～70%B；10～29 min，70%～98% B；29～31 min，98% B；31～33 min，98%～2%B；33～35 min，2%B。流速為0.2 mL·min-1，總色譜運(yùn)行時(shí)間35 min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL，使用Waters Acquity UPLC HSS T3 柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）。

電噴霧離子源（ESI），正（+）、負(fù)（-）離子模式下分別掃描。離子噴霧電壓為3.5 kV（+）和4.5 kV（-）；離子源溫度450 ℃，輔助氣為N2；氣簾氣、霧化氣和輔助氣壓力分別為30，55 和55 psi；氣流速：35 arb，輔助氣流速：10 arb；碰撞能量（CE）采用45 eV（+）和-45 eV（-）；去簇電壓（DP）為60 V（+）和60 V（-）V。選擇數(shù)據(jù)依賴性采集（IDA）模式，選取響應(yīng)值超過100 cps 的4 個(gè)最高峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描并開啟動(dòng)態(tài)背景扣除（DBS）以減少干擾，m/z采集范圍100～1500。

1.7.3 UPLC-Q-TOF-MS數(shù)據(jù)處理

將采集得到的UPLC-Q-TOF-MS 數(shù)據(jù)原始文件導(dǎo)入One-MAP（http：//www.5omics.com）在線軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)格式、電離模式設(shè)置，獲取匹配和對(duì)齊的峰值數(shù)據(jù)，將得到的峰面積進(jìn)行總峰面積歸一化，再將歸一化后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P13.0軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）和正交投影偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）。用OPLS-DA模型變量的變量權(quán)重值（variable important in projection，VIP）＞1以及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（studentttest）P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異代謝物。通過HMDB（http：//www.hmdb.ca），Mass bank（http：//massbank.eu）和Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）在線數(shù)據(jù)庫并結(jié)合二級(jí)離子碎片對(duì)篩選出的差異代謝物進(jìn)行鑒定指認(rèn)。使用MetaboAnalyst 4.0（https：//www.metaboanalyst.ca）對(duì)差異代謝物所涉及代謝通路進(jìn)行富集分析。

1.8 比色法檢測PC12 細(xì)胞谷氨酸含量和谷氨酰胺酶活力

取對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，以2×108L-1的密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為細(xì)胞對(duì)照組、模型組和模型+SSb2 12.5 μmol·L-1組（給藥方式同1.3②）。各組加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，采用比色法按照試劑盒說明進(jìn)行操作，使用分光光度計(jì)在420 nm 處檢測吸光度（A420nm）值，計(jì)算各組谷氨酸含量和谷氨酰胺酶活力。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度CORT 和SSb2 對(duì)PC12 細(xì)胞存活率的影響

CORT 造模濃度篩選結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，當(dāng)CORT 濃度為400 μmol·L-1時(shí)細(xì)胞存活率降低至（55±6）%（P＜0.01）（圖1A）。因此，選擇CORT 400 μmol·L-1作為造模濃度。SSb2 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，SSb2 濃度高于50 μmol·L-1時(shí)，PC12 細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.01）（圖1B）。因此，選擇SSb2 1.5625～25 μmol·L-1進(jìn)行后續(xù)研究。

Fig.1 Effects of different concentrations of corticosterone（CORT，A）and saikosaponin b2（SSb2，B）on viability of PC12 cells by MTT assay.PC12 cells were treated with different concentrations of CORT or SSb2 for 24 h.Cell viability（%）=（A570 nm of experimental group-A570 nm of blank control group）/（A570 nm of cell control group-A570 nm of blank control group）×100%.±s，n=6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control（0 μmol·L-1）group.

2.2 SSb2 對(duì)CORT 損傷PC12 細(xì)胞的存活率和LDH釋放率的影響

MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2A）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞存活率顯著減少（P＜0.01），與模型組相比，模型+SSb2（3.125，6.25 和12.5 μmol·L-1）組細(xì)胞存活率均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），其中SSb2濃度為12.5 μmol·L-1時(shí)作用最強(qiáng)。LDH釋放率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2B）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，模型組LDH釋放率顯著增加（P＜0.01）；而與模型組相比，模型+SSb2組（3.125，6.25 和12.5 μmol·L-1）的LDH 釋放率均顯著降低（P＜0.01），其中SSb2 濃度為12.5 μmol·L-1時(shí)的作用最強(qiáng)。結(jié)合細(xì)胞存活率及LDH 釋放率的結(jié)果，選擇SSb2 12.5 μmol·L-1進(jìn)行后續(xù)研究。

Fig.2 Effects of SSb2 on cell viability（A）and lactate dehydrogenase（LDH）leakage（B）in CORT injured PC12 cells by MTT and LDH assays.PC12 cells were divided into cell control，model and model+SSb2 groups.The cell control group and model group were cultured with RPMI-1640 medium or CORT 400 μmol·L-1 for 24 h，respectively.The model+SSb2 group was co-incubated with CORT 400 μmol·L-1 and SSb2（3.125，6.25 and 12.5 μmol·L-）for 24 h after the pretreatment with SSb2 for 3 h.LDH leakage（%）=A450 nm of cell culture supernatant/（A450 nm of cell culture supernatant+A450 nm of cell lysis solution）×100%.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.3 SSb2對(duì)CORT損傷PC12細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示（圖3），與細(xì)胞對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，模型+SSb2 12.5 μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）。

Fig.3 Effects of SSb2 on cell apoptosis in CORT-injured PC12 cells by flow cytometry assay.See Fig.2 for the PC12 cell treatment except that the dose of SSb2 was 12.5 μmol·L-1.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with model group.

2.4 SSb2對(duì)CORT損傷PC12細(xì)胞代謝的影響

2.4.1 代謝輪廓分析

將細(xì)胞對(duì)照組、模型組和模型+SSb2 組細(xì)胞UPLC-Q-TOF-MS 代謝輪廓數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。無監(jiān)督的PCA 分析結(jié)果顯示（圖4A），在正、負(fù)離子模式下，細(xì)胞對(duì)照組和模型組細(xì)胞樣本各自聚為一類，且能完全分離，表明在CORT 作用下PC12細(xì)胞的代謝輪廓發(fā)生改變。模型+SSb2 組與模型組明顯分開，并與細(xì)胞對(duì)照組靠近，表明SSb2 能調(diào)節(jié)CORT損傷PC12細(xì)胞的代謝紊亂。進(jìn)一步構(gòu)建有監(jiān)督的PLS-DA模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)對(duì)各組進(jìn)行代謝輪廓分析，通過參數(shù)R2和Q2來檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃院瓦^度擬合程度。PLS-DA 模型驗(yàn)證分析結(jié)果表明，正離子模式下的R2=0.816，Q2=0.464，負(fù)離子模式下R2=0.935，Q2=0.485，且正、負(fù)離子模式下的Q2所在的回歸線都交于y 軸的負(fù)半軸（圖4B），表明模型穩(wěn)定性良好，不存在過度擬合現(xiàn)象，有良好的預(yù)測能力和可靠性。

Fig.4 Multivariate data analysis from ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry(UPLC-Q-TOF-MS).See Fig.3 for the PC12 cell treatment.A：principal component analysis（PCA）score plots；B：validation plot obtained from 200 permutation tests for the partial least squares discrimination analysis（PLS-DA）models.A1 and B1：positive ion mode，A2 and B2：negative ion mode.

2.4.2 差異代謝物分析

為篩選出CORT 損傷PC12細(xì)胞前后的差異變量，使用模型組和細(xì)胞對(duì)照組構(gòu)建有監(jiān)督的OPLSDA 模型。并結(jié)合OPLS-DA 模型中VIP＞1 和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選細(xì)胞對(duì)照組與模型組之間潛在的差異代謝物。進(jìn)一步根據(jù)細(xì)胞代謝物的m/z、分子式、保留時(shí)間、二級(jí)碎片離子并通過在線數(shù)據(jù)庫（HMDB，Massbank 和Pubchem）對(duì)細(xì)胞對(duì)照組與模型組之間顯著變化的差異代謝物進(jìn)行指認(rèn)，最終獲得19 個(gè)潛在差異代謝物（表1），其中膽堿、谷氨酰胺、D-蛋氨酸、脯氨酸、乳酸和鳥氨酸的含量增加，谷氨酸、酪氨酸、肌酸、異亮氨酸、L-色氨酸、N-甲基煙酰胺、煙酰胺、3-氨基苯甲酸、檸檬酸、N-乙酰天冬氨酸、2-氧代己酸、苯丙氨酸和葡萄糖的含量減少。與模型組相比，模型+SSb2 組谷氨酸、肌酸、N-乙酰天冬氨酸、L-酪氨酸、檸檬酸、L-異亮氨酸的含量顯著減少，乳酸、谷氨酰胺和膽堿的含量顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）（圖5）。

Tab.1 Differential metabolites associated with CORT-injured PC12 cells detected by UPLC-Q-TOF-MS.

Fig.5 Comparison of relative peak areas of potential biomarkers in UPLC-Q-TOF-MS in PC12 cells.See Fig.3 for the PC12 cell treatment.±s，n=6.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

2.4.3 差異代謝物的代謝通路分析

使用在線軟件MetaboAnalyst 4.0 對(duì)差異代謝物進(jìn)行代謝通路分析（圖6），代謝通路影響值（pathway impact）由拓?fù)浞治鲇?jì)算得到，影響值和-lgP分別表示代謝通路的重要性和通路富集分析的顯著性水平。將影響值大于0.1作為篩選條件，最終篩選出5條代謝通路，包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；酪氨酸代謝；精氨酸生物合成。

Fig.6 Summary of metabolic pathway analysis of SSb2 on CORT-injured PC12 cells.See Fig.3 for the PC12 cell treatment.Each point represents one metabolic pathway；the size of dot and shades of color represnt correlations with the impact on the metabolic pathway.

2.4.4 SSb2 對(duì)CORT 損傷PC12 細(xì)胞谷氨酸含量和谷氨酰胺酶活性的影響

比色法檢測結(jié)果（圖7）顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，模型組谷氨酸含量和谷氨酰胺酶活性顯著降低（P＜0.01）；而與模型組相比，模型+SSb2 組谷氨酸含量（P＜0.01）和谷氨酰胺酶活性均顯著增加（P＜0.05）。

Fig.7 Effects of SSb2 on glutamic acid contents（A）and glutaminase activity（B）in CORT-injured PC12 cells by ultraviolet colorimetry.See Fig.3 for the PC12 cell treatment.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 討論

本研究采用PC12 細(xì)胞建立CORT 損傷模型，以CORT 400 μmol·L-1作為造模劑量。與模型組相比，模型+SSb2 組細(xì)胞存活率顯著升高，LDH 釋放率顯著降低，說明SSb2對(duì)CORT誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，且SSb2濃度為12.5 μmol·L-1時(shí)具有最佳保護(hù)作用。細(xì)胞代謝組學(xué)研究結(jié)果表明，SSb2 顯著改善CORT 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞代謝紊亂，主要涉及5 條代謝通路，分別為D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，酪氨酸代謝，以及精氨酸生物合成。

氨基酸作為神經(jīng)遞質(zhì)、代謝調(diào)節(jié)劑和神經(jīng)調(diào)節(jié)劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，與神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)的氨基酸代謝物有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺等［30］。谷氨酸是一種分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)［31］。它由神經(jīng)元中的谷氨酰胺在磷酸鹽活化的谷氨酰胺酶作用下合成，然后釋放到突觸間隙以發(fā)揮生物效應(yīng)。丙氨酸也可在丙氨酸轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)化為谷氨酸，釋放的谷氨酸通過谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體被吸收到星形膠質(zhì)細(xì)胞后，在谷氨酰胺酶的作用下轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺，從而完成谷氨酰胺-谷氨酸循環(huán)［32］。谷氨酰胺-谷氨酸循環(huán)作為膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元通信的一部分，是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)谷氨酸穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵［33］。大量動(dòng)物和臨床研究都表明，谷氨酰胺-谷氨酸循環(huán)系統(tǒng)參與了抑郁癥發(fā)生的病理生理學(xué)過程［34-36］。有文獻(xiàn)報(bào)道，阻斷正常大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸的攝取后會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知障礙和快感缺失等抑郁癥狀［37］；與正常大鼠相比，習(xí)得性無助抑郁模型大鼠大腦皮質(zhì)、紋狀體、海馬體切片中谷氨酸攝取量明顯減少［38］，杏仁核中的谷氨酰胺合成酶活性降低［39］。Son 等［40］在慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，菠菜提取物后能通過降低模型組小鼠血液CORT 水平和增加前額葉皮質(zhì)中的谷氨酸水平發(fā)揮抗應(yīng)激和抗抑郁特性。Gruenbaum 等［41］也在綜述中提出，抑郁癥是一種與谷氨酸系統(tǒng)相關(guān)的精神疾病，并建議治療應(yīng)指向通過恢復(fù)谷氨酰胺-谷氨酸循環(huán)系統(tǒng)來穩(wěn)定谷氨酸系統(tǒng)。本研究代謝組學(xué)和紫外比色法檢測結(jié)果均顯示，CORT 處理PC12 細(xì)胞后，谷氨酸和谷氨酰胺水平降低；給予SSb2 治療后，2 種指標(biāo)均得到升高。提示SSb2 可能通過調(diào)節(jié)谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮對(duì)PC12細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用。

代謝組學(xué)研究結(jié)果表明，除D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝通路外，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成代謝通路也與SSb2 的神經(jīng)保護(hù)作用存在聯(lián)系。在該通路中，酪氨酸含量變化與SSb2 神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)。酪氨酸經(jīng)酪氨酸羥化酶催化可生成3，4 二羥苯丙氨酸（多巴），多巴經(jīng)多巴脫羧酶催化生成多巴胺（dopamine，DA），而DA 與抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［42］。因此，作為DA 的重要合成前體，酪氨酸的含量變化也被認(rèn)為與抑郁癥發(fā)生相關(guān)［43-44］。本研究發(fā)現(xiàn)，CORT 作用于PC12 細(xì)胞使酪氨酸含量降低，給予SSb2 治療后酪氨酸水平顯著回調(diào)，提示SSb2 可能通過調(diào)節(jié)酪氨酸的生物合成影響神經(jīng)遞質(zhì)DA的產(chǎn)生，從而發(fā)揮對(duì)PC12細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。

抑郁癥的發(fā)生發(fā)展與能量代謝障礙、線粒體功能障礙密切相關(guān)，三羧酸循環(huán)和糖酵解是能量代謝的2 個(gè)重要途徑［45］。研究表明，抑郁癥患者腦內(nèi)葡萄糖代謝顯著降低，神經(jīng)元活動(dòng)被抑制，產(chǎn)能減少［46］。本研究中模型組細(xì)胞乳酸含量顯著升高，檸檬酸含量顯著降低，表明CORT 損傷的PC12 細(xì)胞中三羧酸循環(huán)和糖酵解代謝的紊亂。而給與SSb2后三羧酸循環(huán)和糖部分代謝產(chǎn)物均恢復(fù)至細(xì)胞對(duì)照組水平。

需要注意的是，本研究采用CORT 誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型在體外狀態(tài)下研究SSb2 的神經(jīng)保護(hù)作用是局限的，后續(xù)需要進(jìn)一步建立抑郁動(dòng)物模型探究SSb2 的體內(nèi)藥效以及潛在作用機(jī)制。另外，本研究用于評(píng)價(jià)SSb2藥效的生化指標(biāo)為LDH釋放率和細(xì)胞凋亡率，后續(xù)還需進(jìn)行多細(xì)胞模型、多藥效指標(biāo)的綜合評(píng)估，進(jìn)一步考察SSb2 的神經(jīng)保護(hù)作用及量效關(guān)系。不僅如此，本研究采用的UPLCQ-TOF-MS 非靶向代謝組學(xué)技術(shù)只限于對(duì)差異代謝物進(jìn)行定性分析，不能準(zhǔn)確反映代謝物的含量變化。因此，之后還需使用代謝物標(biāo)品通過靶向定量分析對(duì)SSb2 調(diào)節(jié)的差異代謝物進(jìn)行定量，進(jìn)一步明確SSb2發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。