凌 珺，朱 冰，陳威巍，王卓然，余麗梅，游紹莉

1 遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院貴州省細胞工程重點實驗室，貴州 遵義 563003

2 中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心肝病醫(yī)學部，北京 100039

1 半乳糖凝集素-9（galectin-9，Gal-9）基因與分子結構

Gal-9 是一種分子量為36 kDa 的β-D-半乳糖苷哺乳動物凝集素，1997年由Wada和Türeci等［1］從小鼠胚腎和人霍奇金淋巴瘤組織中分離鑒定。Gal-9基因定于17號染色體的短臂上17q11.2（HGNC：6570）。所有半乳糖凝集素（Gal）均含有一個由130個氨基酸殘基組成的碳水化合物識別結構域（carbohydrate recognition domain，CRD），其家族共有15種蛋白質，根據其分子結構的不同可分為3 型：（1）原型，只有1 個CRD（包括Gal-1、Gal-2、Gal-5、Gal-7、Gal-10、Gal-11、Gal-13、Gal-14、Gal-15）；（2）嵌合體型，由CRD 上富含脯氨酸和甘氨酸的短片段交聯結合形成（包括Gal-3）；（3）串聯重復型，由2個CRD 串聯融合形成（包括Gal-4、Gal-6、Gal-8、Gal-9、Gal-12）［2］。有研究［3］表明，Gal-9由一個肽鏈接2個CRD，分別是N端的N-CRD和C 端的C-CRD，二者氨基酸序列有較大差異且具有配體特異性，因此在介導Gal-9功能方面發(fā)揮不同的作用，其中C-CRD 是決定T 淋巴細胞受體識別和死亡信號轉導途徑的主要因素。迄今為止，Gal-9已被鑒定為T淋巴細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域分子-3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，Tim-3）、CD 44和Dectin 1 等多種受體的配體［4］，在mRNA 的剪接、細胞凋亡、細胞周期的調控、細胞黏附、細胞遷移及細胞分化等多種生物學功能中發(fā)揮重要的作用，是一種多功能的免疫調節(jié)蛋白［5］。

2 Gal-9的表達分布

Gal-9 廣泛分布于肝臟、胸腺、脾臟等器官。在免疫系統中，Gal-9 主要表達于巨噬細胞、樹突狀細胞等抗原提呈細胞、CD4+T 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞及調節(jié)性T淋巴細胞（Treg）。Tim-3 是Gal-9 的配體，Tim 基因家族于2001年由Monney等［6］首次發(fā)現并鑒定，家族主要包括8個成員（Tim-1～8），其中Tim-1、Tim-3、Tim-4在人體中發(fā)現。Tim-3 是Gal-9 的配體，其選擇性表達于Th1、Th17細胞，也可表達于抗原提呈細胞［7-8］。Gal-9 的2 個結構域（C-CRD、N-CRD）均可與Tim-3 結合，其中C-CRD 與Tim-3 的結合力更強，主要在獲得性免疫中發(fā)揮功能，誘導T 淋巴細胞凋亡，N-CRD 則傾向于活化樹突狀細胞、巨噬細胞等，調節(jié)天然免疫反應。

3 Gal-9的免疫調節(jié)機制

Gal-9主要由Kupffer細胞（KC）分泌，研究［9-11］提示肝損傷環(huán)境下KC 細胞受刺激后可釋放Gal-9。Gal-9 與CD4+T、CD8+T 淋巴細胞表面Tim-3 結合發(fā)揮生物學功能［11］。Caspase 家族在細胞凋亡的進程中起關鍵作用，caspase-1 在細胞中過表達可促使細胞早期凋亡［12］。caspase-1 的激活需要Ca2+依賴性蛋白酶（calpain），研究［13］證實Gal-9 可誘導Ca2+內流使calpain 激活，從而激活caspase-1，最終通過Ca2+-calpain-caspase-1 途徑促進細胞凋亡，調節(jié)免疫反應。

Wang 等［11］通過肺炎克雷伯菌小鼠模型研究發(fā)現，腹腔注射Gal-9 可抑制CD4+T 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞的數量，降低Th1和Th17細胞分泌的細胞因子如：IL-17、IFN-γ，且分離小鼠免疫細胞進行體外培養(yǎng)并加入Gal-9刺激后，可減少Th17細胞的數量并抑制IL-17的產生，提示Gal-9在Th17免疫反應中起重要作用。

CD4+CD25+Treg在免疫應答負調控中發(fā)揮重要作用，可通過細胞間直接接觸或者分泌抗炎細胞因子發(fā)揮免疫抑制作用［14］。研究［15-16］發(fā)現Gal-9可在CD4+CD25+Treg上表達，誘導Treg 增殖，同時體外實驗中使用熒光染料CFSE 標記的CD4+CD25-T 淋巴細胞和CD4+CD25+Treg 共培養(yǎng)，并加入可溶性CD3 和CD28 抗體刺激二者增殖，培養(yǎng)后發(fā)現CD4+CD25+Treg可抑制CD4+CD25-T淋巴細胞的增殖，而加入Tim3 抗體阻斷Gal-9/Tim3 通路后可明顯降低Treg 的抑制效應，導致CD4+T 淋巴細胞數量增加及分泌的相關細胞因子水平增高，提示CD4+CD25+Treg 可能通過Gal-9/Tim3通路抑制細胞增殖。在小鼠膠原誘導關節(jié)炎模型［17］中，敲除Gal-9蛋白的小鼠更容易患關節(jié)炎，且體內Treg 數量降低、CD4+Tim3+T 淋巴細胞增多，隨后在體外實驗中證實Gal-9 可使外周血CD4+Tim3+T 淋巴細胞減少，誘導幼稚T 淋巴細胞向Treg 分化，間接抑制其向Th17 分化，并以劑量依賴性方式抑制IL-17 的分泌。在ConA誘導的肝炎小鼠模型［18］中，將Tim-3阻斷后病情加重，而經過Gal-9 治療后病情得到改善。該模型中，Gal-9還可抑制促炎細胞因子TNF-α、IL-6的產生，通過增加Treg與效應T淋巴細胞因子的數量，誘導ConA激活的CD4+T 淋巴選擇性凋亡，進一步阻止TNF-α、IL-6、IFN-γ的釋放，抑制對肝細胞的細胞毒性作用。轉錄因子Foxp3 不僅是Treg 的標志物，還對Treg 具有調節(jié)作用［19］，Gal-9 可促進肝Treg Foxp3 的表達，促進Treg 增加來抑制IFN-γ的產生，抑制炎癥發(fā)展［20］。

自然殺傷T 淋巴細胞（NKT）可分泌IFN-γ 并作用于KC，KC 受到IFN-γ 刺激后釋放IL-15 和Gal-9，IL-15 反過來可使NKT 細胞增殖［21］。Gal-9 可與NKT 細胞上Tim-3結合，誘導細胞凋亡進一步抑制炎癥反應。Tang等［22］在非酒精性脂肪性肝病小鼠模型中，檢測NKT細胞上Tim-3的表達，發(fā)現NKT細胞在肝臟中表達Tim-3，且腹腔注射Gal-9 可發(fā)現肝臟NKT 細胞凋亡率顯著增高，隨后分離出肝臟NKT 細胞和重組Gal-9 一起培養(yǎng)，通過膜聯蛋白V/7-氨基放線菌素D（7AAD）染色測定NKT 細胞凋亡情況，發(fā)現Gal-9以劑量、時間依賴性方式誘導NKT 細胞凋亡，且可被Gal-9的競爭性抑制劑或Tim-3抗體阻斷。以上研究顯示Gal-9 在機體中可通過多種途徑發(fā)揮重要生物學功能（圖1）。

圖1 Gal-9免疫調節(jié)通路示意圖Figure 1 Schematic diagram of Gal-9 immunomodulatory pathway

4 Gal-9在不同肝臟疾病中的作用

目前Gal-9 在白血病、宮頸癌、艾滋病以及自身免疫性疾病中有較多研究［23-25］。利用Gal-9 可誘導幼稚T 淋巴細胞向Treg 分化，減少自身反應性T 淋巴細胞的數量，使Treg抑制Th1細胞和Th17細胞分泌促炎因子從而在自身免疫性疾病中發(fā)揮治療作用。在痛風的小鼠模型［26］中使用Gal-9 可降低關節(jié)中各種促炎因子（IL-17、IL-12、IFN-γ）濃度從而改善疾病。在白血病相關研究中，運用實時定量PCR 技術分別檢測白血病患者和正常人骨髓中的Gal-9 表達水平，白血病患者Gal-9 表達水平明顯高于正常人，經過藥物治療后Gal-9 表達水平顯著下降，且白血病患者Gal-9 表達水平與疾病危險程度和化療治愈效果有相關性［23］。楊艷等［24］用流式細胞術檢測宮頸癌患者外周單核細胞中Gal-9 的表達變化，發(fā)現宮頸癌Ⅲ～Ⅳ期患者的外周血Gal-9 表達水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ期的表達水平，且低分化的宮頸癌患者的Gal-9水平明顯高于高分化、中分化的患者，推測Gal-9 的表達水平與宮頸癌的臨床分期、病理分級相關。目前，肝病中關于Gal-9 的免疫調節(jié)效應的研究主要聚焦于肝缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）、藥物性肝損傷（drug induced liver injury，DILI）、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）以及肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）等疾病。

4.1 IRI 在IRI 小鼠模型［27］中發(fā)現，損傷的肝細胞分泌Gal-9 并與Th1 細胞上的Tim-3 結合，促使Th1 分泌的IFN-γ水平降低，從而減輕后續(xù)炎癥反應。在IRI小鼠模型中，加入Tim-3 抗體的小鼠與對照組小鼠相比，加入Tim-3 抗體加劇了小鼠肝臟局部中性粒細胞浸潤，促使T 淋巴細胞和巨噬細胞在肝臟局部聚集，加速肝細胞凋亡，小鼠肝損傷更嚴重。Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）是IRI 的關鍵因素［10］。研究［28-29］發(fā)現在IRI 動物模型中TLR4缺陷型小鼠比野生型小鼠的肝損傷更輕，并證實TLR4 受體參與了IRI 的起始階段。研究［27-29］顯示Gal-9與Tim-3結合后可使TLR4受體表達降低，減輕中性粒細胞、巨噬細胞、T 淋巴細胞的聚集，從而減緩肝臟炎癥損傷。在CCl4誘導的小鼠急性化學性肝損傷模型中，Gal-9 的抑制作用［30］與IRI 小鼠模型相似，在體外實驗中，將脾T淋巴細胞與巨噬細胞共同培養(yǎng)，阻斷Tim-3后，T 淋巴細胞產生更多IFN-γ、IL-6，加劇炎癥反應，而不阻斷Tim-3 且加入Gal-9 后炎癥因子水平降低，推測Gal-9/Tim-3 通路可減輕炎癥反應。阻斷Tim-3 通路后小鼠TLR4 和NF-κB 蛋白與對照組小鼠相比顯著升高，然而在敲除TLR4 受體的小鼠模型中阻斷Tim-3 通路則不影響肝損傷，進一步提示Tim-3 可以通過抑制NF-κB 通路來負調控TLR4并調節(jié)TNF-α、IFN-γ、IL-1β的水平，進一步證實Tim-3/Gal-9可通過調控TLR4信號通路來維持肝內免疫穩(wěn)態(tài)。另有研究［31］利用Tim-3 轉基因（Tim-3 Tg）的肝缺血小鼠模型中Gal-9 的表達進行動力學分析，發(fā)現肝組織Gal-9 mRNA 的表達在再灌注過程中升高，之后利用免疫熒光技術發(fā)現，肝細胞在缺血再灌注后分泌Gal-9 至肝竇中。將重組Gal-9 分別注射到對照組和Tim-3 Tg 組后，兩組的ALT 和TNF-α、IL-1β 等促炎因子水平均降低，且Tim-3 Tg 組降低更明顯，提示Gal-9 可增強肝臟對缺血再灌注損傷的抵抗力，發(fā)揮一定的保護作用。

4.2 DILI DILI 是肝損傷的重要病因，DILI 的嚴重程度可從輕度血清轉氨酶升高發(fā)展到嚴重的肝損傷，甚至可進展為肝衰竭［32］。Rosen團隊［33］分析了149例急性肝衰竭患者的血漿樣本，其中110 例為對乙酰氨基酚誘導的肝損傷，39 例為非對乙酰氨基酚藥物誘導的肝損傷，同時選擇了年齡相似無肝臟疾病的健康個體作為對照。采用多克隆抗體和比色法測定血漿Gal-9的水平，發(fā)現肝衰竭患者血漿Gal-9水平明顯高于健康對照組，對乙酰氨基酚誘導的肝損傷和非對乙酰氨基酚藥物誘導的肝損傷二者之間無顯著差異。且Gal-9水平高于690 pg/mL的患者在21 天內的死亡風險是Gal-9 水平低于690 pg/mL 患者的2.9倍，提示血漿Gal-9水平與急性肝衰竭死亡風險呈正相關。該團隊進一步分析了血漿Gal-9 水平與全身炎癥反應綜合征的關系，發(fā)現肝衰竭患者的Gal-9水平高于386 pg/mL與其發(fā)生全身炎癥反應綜合征明顯相關。

4.3 病毒性肝炎 HBV 感染具有持續(xù)性和慢性化的特點，這些特點是由于效應T 淋巴細胞和記憶T 淋巴細胞功能缺陷所致。從急性感染到慢性感染的特征是由于效應T 淋巴細胞功能減弱和Treg 增多［34-35］。研究［36］證明，KC 細胞中的Gal-9 與病毒特異性CD4+T、CD8+T 淋巴細胞上的Tim-3 結合可誘導T 淋巴細胞凋亡。與健康對照組相比，乙型肝炎患者外周血單個核細胞（PBMC）中Tim-3 表達顯著增加，且隨著炎癥加重，CD4+T、CD8+T 淋巴細胞上Tim-3 的表達逐漸增高，乙型肝炎患者的血漿Gal-9循環(huán)水平也顯著高于健康對照組，且與疾病嚴重程度呈正相關。對兩組細胞進行7AAD染色，發(fā)現乙型肝炎患者Tim-3+CD4+T、Tim-3+CD8+T 淋巴細胞凋亡程度顯著高于健康對照組。此外，在乙型肝炎患者細胞培養(yǎng)基中加入Tim-3的Fc段融合蛋白，可較大程度上減緩CD8+T淋巴細胞凋亡，使其產生IFN-γ、TNF-α。Mengshol等［16］發(fā)現丙型肝炎患者血漿Gal-9 水平顯著升高，之后進行免疫組織化學分析健康志愿者和丙型肝炎患者的肝組織標本中Gal-9蛋白的表達，使用Gal-9抗體標記Gal-9蛋白并使用CD68 標記KC 細胞。與健康志愿者相比，丙型肝炎患者肝組織尤其門靜脈周圍區(qū)域CD68 及Gal-9 共定位且表達呈陽性，而健康志愿者肝組織中93%的肝門靜脈區(qū)域沒有Gal-9染色。Tim-3也可在丙型肝炎特異性T淋巴細胞表面高表達［37］，McMahan 團隊［38］發(fā)現阻斷Tim-3能夠阻止T 淋巴細胞耗竭并恢復CD4+T 淋巴細胞和CD8+T 淋巴細胞的功能，從而在病毒感染期間引起肝損傷［37，39］。用重組Gal-9刺激丙型肝炎患者和正常人PBMC可以促進Treg增多從而減緩疾病慢性化進程［16］。Gal-9/Tim-3 途徑在病毒性肝炎感染中可導致病毒特異性T 淋巴細胞功能缺陷且數量減少，在慢性乙型肝炎患者體外培養(yǎng)PBMC 中，無論是加入Gal-9 抗體或是Tim-3 抗體阻斷Gal-9/Tim-3 通路，CD8+T 淋巴細胞數量以及相關細胞因子水平都較對照組升高，提示阻斷該通路可部分恢復CD8+T淋巴細胞功能，增強抗病毒治療效果［40］。

4.4 AIH AIH 是一種具有高丙種球蛋白血癥、肝組織學上大量漿細胞浸潤為主的肝臟疾病。AIH患者Tim-3+CD4+T淋巴細胞在效應CD4+T淋巴細胞中的占比低于正常人，Gal-9+Treg在Treg中的比例更低，Gal-9誘導CD4+T淋巴細胞凋亡或使Treg 增殖作用減弱，且AIH 患者的Gal-9+Treg 亞群中含有更多的IFN-γ+和IL-17+細胞，而轉化生長因子-β+（TGF-β+）和IL-10+細胞較少，從而炎癥反應增強，免疫調節(jié)受損。此外，Gal-9+Treg 與自身免疫球蛋白G水平和自身抗體滴度（疾病的血清學標志物）呈負相關，提示Gal-9+Treg可調控AIH 的發(fā)展［41］。Gal-9促進Treg 增殖后對CD4+T 淋巴細胞的抑制作用提示Gal-9 在AIH 治療中具有潛在價值，目前常規(guī)治療對一部分AIH患者無效，將Treg細胞作為靶點，可能對AIH患者的免疫治療有一定意義［41］。

4.5 HCC HCC 是全球常見的癌癥之一，最常見的病因是慢性病毒性肝炎［42］。Gal-9 在乙型肝炎相關性肝癌中主要表達于CD68+CD163+KC細胞上，免疫熒光染色顯示Gal-9+KC 與Tim-3+T 淋巴細胞共定位，CD4+T 淋巴細胞表面Tim-3 呈高水平表達，且與HCC 預后密切相關，推測Gal-9/Tim-3 參與了HCC 的免疫逃逸［43］，Gal-9 在抗腫瘤免疫中也發(fā)揮重要作用。NK 細胞是抗腫瘤免疫的靶標，NK 細胞表面的Gal-9 可導致NK 細胞IFN-γ 分泌降低，從而降低NK 細胞介導的細胞毒性作用［44］。另外，有研究［45］認為Gal-9以劑量和時間依賴性方式在體外抑制HCC細胞系HLE和Li-7的生長，在體內誘導Li-7細胞的凋亡，并在異種移植無胸腺小鼠模型中抑制了HCC細胞的生長。上述研究提示Gal-9在HCC中表現出雙面功能，既參與HCC 的免疫逃逸，又促進HCC 細胞凋亡。至于何種情況下，哪一方面機制占主導作用還需進一步研究。

5 小結與展望

Gal-9 在肝病免疫調節(jié)中具有多種生物學功能，這些功能與肝內免疫穩(wěn)態(tài)相關。根據不同肝臟疾病，Gal-9可能通過不同通路發(fā)揮不同的功能。此外，檢測Gal-9水平變化可作為疾病嚴重程度分型及預后的生物學標志物。但是，Gal-9 在體內免疫調節(jié)的具體機制尚未完全闡明，例如在DILI 中Gal-9 水平的升高是炎癥反應的結局還是調控炎癥的因子；在HCC 中Gal-9 既發(fā)揮免疫抑制又發(fā)揮免疫促進的作用等，還需進一步開展研究驗證。通過深入研究Gal-9 在各類肝病中的作用機制，有助于Gal-9 作為治療靶點研發(fā)新型治療藥物，進而改善病毒感染、自身免疫性疾病和癌癥的臨床結局。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：凌珺負責查找文獻、撰寫論文；朱冰負責擬定寫作思路；陳威巍、王卓然負責修改論文；余麗梅、游紹莉負責擬定寫作思路，指導撰寫文章，修改論文并最后定稿。余麗梅與游紹莉對本文貢獻等同，同為第一作者。