鄭欣瑞，許燕楠，王丹陽，邢飛飛，宗夢瑤，張士豪，戰(zhàn)俊邑，劉 偉，陳高峰，陳佳美，劉 平，慕永平

上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海市中醫(yī)藥研究院肝病研究所，肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海 201203

肝移植是國際公認的終末期肝硬化的最佳治療手段［1］，但受制于供體缺乏、費用昂貴以及移植相關并發(fā)癥等限制，使部分患者在等待供肝期間死亡［2-4］。近年來，干細胞移植成為肝硬化治療研究的新熱點，尤其自體骨髓來源間充質干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC）具有易獲取、無排異反應及倫理問題等優(yōu)勢，已在乙型肝炎肝硬化、酒精性肝硬化等治療中初顯成效［5-8］，但也有研究［9］發(fā)現(xiàn)BMSC 移植后具有向肌成纖維細胞分化的潛能。因此，如何提高BMSC 治療終末期肝硬化的效果顯得尤為重要。課題組前期研究［10］表明，骨髓來源巨噬細胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）M2 亞型（M2-BMDM）可有效抑制四氯化碳（CCl4）誘導大鼠肝纖維化進展，BMSC 移植可有效抑制膽汁性肝纖維化進展［11］。但來源于M2-BMDM生長微環(huán)境的BMSC（命名為BMSCM2）移植是否能夠進一步提高其對肝硬化的治療效應尚不清楚。本研究觀察了BMSCM2移植對CCl4/2-乙酰氨基芴（CCl4/2-acetylaminofluorene，CCl4/2-AAF）誘導大鼠肝硬化進展的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠肌成纖維細胞L929細胞株購于中國科學院細胞庫。DMEM/F12（Dulbecco’s Modified Eagle Media：Nutrient Mixture F-12）細胞培養(yǎng)基購于GIBICO 公司。BMSC 成脂誘導試劑盒（RAXMX-90031）、BMSC 成骨誘導試劑盒（RAXMX-90021）購于Cyagen公司，BMSC細胞周期檢測試劑盒（C543）購于DOJINDO公司。α-平滑肌肌動蛋白抗體（α-smooth muscle actin，α-SMA，ab124964）、CD68 抗體（ab125212）、肝細胞核因子4α 抗體（hepatocyte nuclear factor 4 alpha，HNF-4α，ab41898）、Sox9（sex determining region Y-box 9）抗體（ab185230）、上皮細胞黏附分子抗體（epithelial cell adhesion molecule，EpCam，ab71916）均購于Abcam 公司；3-磷酸甘油醛脫氫酶抗體（GAPDH，60004-1-Ig）、細胞角蛋白7 抗體（cytokeratin7，CK7：15539-1-AP）、CK19 抗 體（10712-1-AP）均購于Proteintech 公司；白蛋白抗體（Alb，sc271605）購于Stan cruz Biotechnology 公司。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）引物序列由Takara 公司設計合成，逆轉錄試劑盒購自Takara 公司，Synergy Brands（SYBR）熒光染料購自TOYOBO 公司。肝組織羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 大鼠BMDM分離、極化及鑒定 參照課題組已經(jīng)建立的方法［10］。分離得到的BMDM 使用DMEM/F12+20%L929+10% FBS培養(yǎng)7 d后，即可獲得成熟的M2-BMDM。

1.3 大鼠BMSC 的分離與鑒定 參照課題組已經(jīng)建立的方法［11］分離大鼠BMSC，誘導成脂、成骨分化，并鑒定細胞周期。

1.4 實驗動物 Wistar 雄性大鼠24 只，SPF 級，體質量160～180 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證編號：SCXK（滬）2022-0004，于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)、造模和觀察，實驗動物使用許可證編號：SYXK（滬）2014-0008。

1.5 模型制備與分組干預 采用30% CCl4-橄欖油溶液2 mL/kg 皮下注射，每周2 次，共計6 周制備大鼠肝硬化模型。第7周開始，模型大鼠隨機分為模型組（M 組）、BMSC 組、BMSCM2組，每組6 只。在繼續(xù)30% CCl4-橄欖油溶液造模的同時，予以2-AAF 10 mg·kg-1·d-1灌胃以抑制肝細胞增殖，制備CCl4/2-AAF 大鼠肝硬化模型。于第7 周開始，將BMSC 和BMSCM2經(jīng)尾靜脈以單次注射的方式移植至大鼠體內，注射劑量為1×106cells/只。同時設正常對照組（N 組，n=6）。10 周末取材，留取血清及肝組織標本。

1.6 血清生化學檢測 血清ALT 和AST 活性檢測由上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院檢驗科完成。

1.7 肝組織Hyp含量測定 參考文獻［12］中的方法使用試劑盒檢測。

1.8 肝組織病理和免疫組化染色方法 石蠟固定組織切片，厚4 μm，以進行HE、天狼星紅、免疫組化染色。參考文獻［13］中的方法進行免疫組化。組織切片脫蠟修復封閉后，α-SMA（1∶2 000）、CD68（1∶1 000）、EpCam（1∶500）、Sox9（1∶1 000）、CK7（1∶400）、CK19（1∶1 000）、HNF-4α（1∶400）、Alb（1∶50）等一抗孵育1 h，HRP 標記的二抗（1∶1 000）孵育30 min，洗滌，DAB 顯色，蘇木精對比染色，Leica SCN 400掃描儀掃描。

1.9 RT-PCR TNF-α、TGF-β1、CD68、α-SMA、EpCam、Sox9、CK7、CK19、HNF-4α、Alb mRNA 表達采用定量RTPCR 方法檢測。總RNA 提取采用RNA 純化試劑盒（Lot.250800，Toyobo 公司），mRNA 表達檢測采用SYBR Green real-time PCR Master Mix（SYBR）（Lot.411900）（Toyobo 公司，Osaka，Japan），以及ViiA? 7 real-time PCR System（ABI，American）。引物由Takara 公司設計合成（Takara Chemical）。SYBR 一步法RT-PCR 反應條件如下：42 ℃ 15 min、95 ℃ 2 min、95 ℃變性15 s，40 個循環(huán)，60 ℃延伸退火1 min。

1.10 免疫印跡 肝組織采用RIPA 緩沖液裂解，4 ℃17 000×g離心10 min，測定上清液蛋白濃度，10%凝膠電泳，轉移至PVDF 膜上，5% BSA 混合溶液封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，α-SMA（1∶2 000）、CD68（1∶2 000）、GAPDH（1∶10 000）；二抗（1∶1 000）室溫下孵育1 h，ECL法顯影，使用image J分析計算灰度值積分。

1.11 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BMDM 及BMSC的分離、培養(yǎng)與鑒定 本實驗所分離的BMSC 符合漩渦狀生長的細胞形態(tài)（圖1a），成骨誘導發(fā)現(xiàn)BMSC周圍有明顯茜素紅染色的鈣結節(jié)樣沉淀物（圖1b）。成脂誘導顯示BMSC 周圍出現(xiàn)空泡樣的脂滴，油紅O 染色脂滴呈橘紅色（圖1c）。流式細胞儀分析顯示，M2-BMDM 細胞CD206＋95.5%（圖1d）；BMSC 細胞CD45－99.9%，CD90＋99.9%，CD29＋99.9%，且G1 期細胞占比為78.2%（圖1e～f）。

2.2 抑制肝臟炎癥反應的作用比較 HE 染色顯示，M組大鼠肝組織可見大量肝細胞脂肪變性，纖維間隔可見大量炎性細胞浸潤；與M 組比較，BMSC 組和BMSCM2組大鼠肝組織炎性細胞浸潤和脂肪變性明顯減少，尤以BMSCM2組改善更為明顯（圖2a）。

血清學檢測結果顯示，與N 組比較，M 組大鼠血清ALT、AST 活性顯著升高（P值均＜0.01）；與M 組比較，BMSC 組和BMSCM2組ALT、AST 活性顯著降低（P值均＜0.01），且BMSCM2組ALT、AST 活性顯著低于BMSC 組（P值均＜0.05）（圖2c）。

此外，與N 組比較，M 組肝組織TNF-α、TGF-β1、CD68 mRNA 表達水平顯著增加（P值均＜0.01）；與M 組比較，BMSC 組和BMSCM2組TNF-α、TGF-β1mRNA 水平均顯著降低（P值均＜0.05），且BMSCM2組TNF-α、TGF-β1 mRNA 水平顯著低于BMSC 組（P值均＜0.05）（圖2d）。CD68的免疫組化及蛋白印跡顯示相同的趨勢（圖2e～f）。

2.3 抑制肝硬化進展的作用比較 天狼星紅膠原染色顯示，M 組大鼠肝組織膠原沉積明顯增加，已形成完整假小葉結構；與M 組比較，BMSC 組和BMSCM2組膠原沉積明顯減輕，尤以BMSCM2組改善更為明顯（圖3）。

圖3 天狼星紅染色和α-SMA免疫組化染色結果（×200）Figure 3 Sirius red staining and α-SMA immunohistochemical staining results（×200）

肝組織Hyp含量檢測顯示，與N組比較，M 組Hyp含量顯著增加（P＜0.01）；與M 組比較，BMSC 組和BMSCM2組Hyp 含量顯著降低（P＜0.05）（圖4a）。免疫組化染色顯示，與N 組比較，M 組肝組織α-SMA 陽性表達明顯增加；與M 組比較，BMSC 組和BMSCM2組α-SMA 陽性表達均明顯減少，且BMSCM2組更優(yōu)（圖3）。α-SMA mRNA 表達水平及蛋白印跡結果與免疫組化染色結果相吻合，且BMSCM2組均顯著低于BMSC組（P＜0.01）（圖4b～d）。

圖4 BMSCM2抑制肝硬化進展Figure 4 BMSCM2 inhibits the progression of liver cirrhosis

2.4 抑制肝祖細胞增殖的作用比較 免疫組化染色顯示，與N組比較，M組大鼠肝組織EpCam、Sox9陽性表達明顯增加；與M 組比較，BMSC 組和BMSCM2組EpCam、Sox9陽性表達明顯減少，尤以BMSCM2組改善最佳（圖5）。EpCam 及Sox9 mRNA 表達水平與免疫組化染色相吻合，且BMSCM2組EpCam mRNA 水平顯著低于BMSC 組（P＜0.05）（圖6）。

圖5 EpCam和Sox9免疫組化染色結果（×200）Figure 5 Immunohistochemical staining results of EpCam and Sox9（×200）

圖6 BMSCM2抑制肝祖細胞增殖Figure 6 BMSCM2 inhibits hepatic progenitor cell proliferation

2.5 抑制膽管反應的作用比較 免疫組化染色顯示，與N 組比較，M 組大鼠肝組織CK7 和CK19 陽性表達明顯增加；與M 組比較，BMSC 組和BMSCM2組大鼠肝組織CK7 和CK19 表達明顯減少，尤以BMSCM2組改善更佳（圖7）。肝組織CK7 和CK19 mRNA 表達水平顯示相同趨勢，且BMSCM2組CK19 mRNA 水平顯著低于BMSC 組（P＜0.05）（圖8）。

圖7 CK7和CK19免疫組化染色結果（×200）Figure 7 Immunohistochemical staining results of CK7 and CK19（×200）

圖8 BMSCM2抑制膽管反應Figure 8 BMSCM2 inhibits bile duct reactions

2.6 促進肝細胞增殖的作用比較 免疫組化染色顯示，與N 組比較，M 組大鼠肝組織HNF-4α 和Alb 陽性表達明顯減少；與M組比較，BMSC組和BMSCM2組HNF-4α和Alb表達明顯增加，尤以BMSCM2組更為明顯（圖9）。HNF-4α及Alb mRNA 表達與免疫組化染色結果相吻合，且BMSCM2組HNF-4α顯著高于BMSC組（P＜0.05）（圖10）。

圖9 HNF-4α和Alb免疫組化染色結果（×200）Figure 9 Immunohistochemical staining results of HNF-4α and Alb（×200）

圖10 BMSCM2 促進肝細胞增殖Figure 10 BMSCM2 promotes hepatocyte proliferation

3 討論

巨噬細胞起源于單核細胞前體，具有吞噬、抗原提呈等多種功能，在組織穩(wěn)態(tài)和宿主防御中發(fā)揮重要作用［14］。肝臟中的巨噬細胞主要由肝臟Kupffer細胞和浸潤的單核巨噬細胞構成。在慢性肝損傷時，巨噬細胞可通過釋放促炎細胞因子或趨化因子等激活肝星狀細胞（HSC），使其轉化為肌成纖維細胞，分泌大量的細胞外基質（ECM），最終導致肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展［15］。同時，巨噬細胞具有高度的可塑性，其可根據(jù)環(huán)境信號快速地在促炎（M1）和抗炎（M2）之間進行表型轉換，稱之為巨噬細胞極化［16］。M1 和M2 巨噬細胞在轉錄表達譜、細胞表面標志、細胞因子等方面均具有高度異質性，對纖維化肝臟ECM沉積和組織重建發(fā)揮雙重調節(jié)作用［17］。

間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）來源于骨髓、脂肪、臍帶、皮膚、骨骼肌等多種組織［18］，具有良好的自我增殖與多向分化潛能，獲取容易，培養(yǎng)簡單，免疫原性低［19］。近年來，MSC在肝硬化的治療領域顯示出廣闊的應用前景［20］，其中BMSC 被認為是最具有肝細胞再生能力的干細胞群體［5］。MSC治療肝硬化的機制十分復雜，如移植的MSC 可分化為肝細胞樣細胞［21］；促進肝臟巨噬細胞由M1向M2轉化，抑制HSC活化，促進M2巨噬細胞分泌MMP13，促進膠原降解［22-23］；通過旁分泌功能表達各種細胞因子、趨化因子、生長因子以及外泌體等，間接和遠程促進受損肝組織修復等［24］。

課題組前期研究［10］表明體外誘導分化的M1-BMDM和M2-BMDM 對CCl4誘導大鼠肝纖維化均具有良好的干預效應，兩者均可通過抑制肝臟炎癥反應和HSC活化，或促進肝臟巨噬細胞活化并釋放MMP9、MMP13，促進ECM的降解，且M2-BMDM 的綜合干預作用優(yōu)于M1-BMDM。此外，課題組前期研究［11］表明BMSC 移植可有效抑制大鼠膽汁性肝纖維化進展。但目前尚不清楚M2-BMDM 是否可影響B(tài)MSC對肝硬化的治療效應。本研究將來源于M2-BMDM 微環(huán)境的BMSC（BMSCM2）經(jīng)尾靜脈注入CCl4/2-AAF 誘導的大鼠肝硬化模型體內，結果表明BMSC 和BMSCM2均可顯著抑制肝臟炎癥反應和肝硬化進展，且BMSCM2顯示出比BMSC更優(yōu)的治療作用。

HSC 活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關鍵細胞學基礎［25］，TNF-α 和TGF-β1 主要來源于活化的肝臟巨噬細胞，是促進HSC活化的關鍵細胞因子，參與HSC的活化并促進其產生大量ECM［26-27］。本研究結果顯示BMSCM2注射可顯著降低肝組織α-SMA 的蛋白表達以及α-SMA、TNF-α和TGF-β1的mRNA表達，其作用顯著優(yōu)于BMSC，提示與M2-BMDM 共培養(yǎng)后的BMSC 可進一步提高對HSC 活化的抑制作用，這可能與M2-BMDM 影響B(tài)MSC對肝臟巨噬細胞極化功能，或影響B(tài)MSC 的旁分泌功能等有關。

EpCam 和Sox9 是公認的肝祖細胞增殖的標志物［28-29］。膽管反應是各種慢性肝病常見病理改變，在肝硬化的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用，CK7和CK19是公認的膽管上皮細胞標志物［30］。課題組前期研究［31］結果表明，在CCl4/2-AAF誘導的大鼠肝硬化模型中，2-AAF可劑量依賴性地促進肝祖細胞活化并向肌成纖維細胞和膽管細胞分化，促進肝硬化進展。本研究發(fā)現(xiàn)，BMSC和BMSCM2注射后均能顯著抑制肝組織EpCam、Sox9、CK7和CK19的表達水平，顯著增加肝細胞標志物HNF-4α 和Alb 的表達水平，且BMSCM2優(yōu)于BMSC。提示BMSC 和BMSCM2治療肝硬化的機制可能與抑制肝祖細胞增殖及其向膽管細胞分化，促進肝再生有關，且BMSCM2的治療作用更為突出，這可能與M2-BMDM 影響B(tài)MSC 在肝硬化肝臟內的分化方向有關，也有可能通過促進BMSC 分泌調節(jié)性細胞因子如肝細胞生長因子、神經(jīng)生長因子等刺激肝細胞再生有關［32］。

綜上所述，BMSC 在肝硬化治療領域已經(jīng)取得長足發(fā)展，但M2-BMDM 是否可提高BMSC 的治療效應尚未見報道。本研究結果證實來源于M2-BMDM 微環(huán)境的BMSC 經(jīng)外周注射能夠進一步提高BMSC 治療肝硬化的效應，其機制與抑制肝臟炎癥反應及HSC 活化，抑制肝祖細胞增殖及膽管反應，促進肝細胞增殖等有關，為進一步提高BMSC的肝硬化治療作用提供了新思路。

倫理學聲明：本研究方案于2021年11月15日經(jīng)由上海中醫(yī)藥大學動物研究委員會批準，批號：PZSHUTCM211115023，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：鄭欣瑞、許燕楠負責實驗實施，收集數(shù)據(jù)，資料分析，論文撰寫；王丹陽、邢飛飛、張士豪、宗夢瑤、戰(zhàn)俊邑參與實驗研究；陳高峰負責病理；劉偉、陳佳美、劉平參與實驗設計；慕永平負責課題設計，提供寫作思路，指導論文撰寫并最后定稿。鄭欣瑞、許燕楠對本文貢獻等同，同為第一作者。