畢炯炯，馬英杰

1 河南中醫(yī)藥大學第五臨床醫(yī)學院，鄭州 450003

2 河南中醫(yī)藥大學人民醫(yī)院/鄭州人民醫(yī)院消化內科，鄭州 450003

肝硬化是各種慢性肝病的終末階段，營養(yǎng)不良是肝硬化的常見并發(fā)癥，約有20%的代償期肝硬化患者和50%以上的失代償期肝硬化患者可并發(fā)營養(yǎng)不良，其發(fā)生率不但與疾病的嚴重程度呈正相關，還是疾病預后的獨立預測因子［1-4］。肝硬化患者的營養(yǎng)不良可由多種因素造成，既包括禁食時間和飲酒等外部因素，又包括能量和蛋白質攝入減少、炎癥、吸收不良、營養(yǎng)代謝改變、激素紊亂、高代謝和腸道微生態(tài)失調等內部因素［1，4］。Stadlbauer 等［5］發(fā)現中度營養(yǎng)不良的肝硬化患者的糞便中彎曲桿菌屬豐度較高。目前，評估肝硬化營養(yǎng)風險狀況的方法包括測量BMI、上臂圍、肌酐-身高指數及前白蛋白等指標及營養(yǎng)風險篩查2002、預后營養(yǎng)指數、主觀全面評K 估工具及皇家自由醫(yī)院營養(yǎng)優(yōu)先排序工具（Royal free hospital-nutriton priority tool，RFH-NPT）等，這些營養(yǎng)評估工具各具優(yōu)缺點，其中RFH-NPT 被認為是目前肝病患者營養(yǎng)篩查的最佳選擇［6］。為了探索肝硬化營養(yǎng)不良與腸道菌群的關系，本研究首先利用RFHNPT 對肝硬化患者進行營養(yǎng)風險評估，隨后利用高通量測序技術檢測患者糞便菌群的特征，旨在為肝硬化患者營養(yǎng)狀況的干預提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入2021年3月—2022年11月在鄭州人民醫(yī)院消化內科住院的肝硬化患者作為試驗組（LC組）。肝硬化符合2019年版《肝硬化診治指南》［7］中的診斷標準。選取同期健康體檢者作為對照組（HC 組），HC組納入標準：無消化系統疾病、自身免疫系統疾病、感染性疾病、神經系統疾病、器官功能障礙、惡性腫瘤等，常規(guī)檢查未見異常。排除標準：近4周內使用抗菌藥物、微生態(tài)制劑、胃腸動力藥物、免疫抑制劑；合并慢性腹瀉、炎癥性腸病等可引起腸道菌群紊亂的疾病；有胃腸道或腹腔外科手術史；妊娠及哺乳期婦女。

1.2 營養(yǎng)狀況評估 對患者問診是否為急性酒精性肝炎或正在接受鼻飼，有無液體潴留情況、過去3～6 個月是否有非計劃的體質量下降，營養(yǎng)攝入情況等，測量身高、BMI，完成RFH-NPT評分后進行營養(yǎng)風險篩查。

1.3 血清內毒素檢測 外周血內毒素檢測采用鱟試劑凝膠法，試劑為廈門鱟試劑生物科技有限公司生產，用分光光度計在545 nm波長處測定吸光度，最后通過標準曲線計算出內毒素濃度。

1.4 糞便樣本采集 采集前要求受檢者排盡尿液，避免采集過程中尿液等污染，用無菌密閉糞便采集管中的勺子從糞便內部挖取約5 g樣本，密封后凍存在-80 ℃冰箱中用于下一步研究。

1.5 測序方法及生物信息分析 采用DNeasy PowerSoil Pro Kit 試劑盒（QIAGEN，美國）提取糞便樣本基因組DNA，利用特異性引物343F：TACGGRAGGCAGCAG，798R：AGGGTATCTAATCCT 對基因組16S V3-V4區(qū)域進行PCR 擴增后，構建基因文庫，使用Illumina Miseq 測序平臺進行測序。測序結果經過Reads 拼接成Tags 后，按97%的相似性進行OUT 聚類并與Silva（v138）數據庫進行比對注釋，最終獲得物種信息。

1.6 統計學方法 采用SPSS 21.0 軟件進行統計學分析，正態(tài)分布的計量資料以xˉ±s表示，組間比較采用成組t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。非正態(tài)分布的計量資料以M（P25～P75）表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。計數資料組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman 檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 LC 組患者58 例，平均年齡（58.31±10.51）歲，其中男性39 例，女性19 例；乙型肝炎肝硬化54例，丙型肝炎肝硬化2例，酒精性肝硬化1例，自身免疫性肝炎肝硬化1 例。根據RFH-NPT 得分情況，將分值＜1分的患者歸為低營養(yǎng)風險組（LC-A組，n=28），分值≥1分的患者歸為中/高營養(yǎng)風險組（LC-B組，n=30）；其中Child-Pugh A 級、B 級、C 級營養(yǎng)風險的發(fā)生率分別為13.64%（3/22）、61.90%（13/21）、93.33%（14/15）。HC 組25 例，平均年齡（54.68±8.56）歲，男性12 例，女性13 例。三組ALT、GGT、Alb、TBil 及血清內毒素水平差異均有統計學意義（P值均＜0.05）（表1）。

表1 各組基本資料Table 1 Basic information of each group

2.2 腸道菌群豐度和多樣性比較 與HC 組比較，LC-A組、LC-B 組的Chao1 指數和Shannon 指數均有下降趨勢，HC 組與LC-B 組Chao1 指數比較差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 各組腸道菌群豐度和多樣性比較Table 2 Comparison of the abundance and diversity of intestinal flora in each group

2.3 腸道菌群的豐度差異比較 在門水平上，各組主要由擬桿菌門（Bacteroidota）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteriota）組成，并占總體門類的95%以上，HC-A 組與LC-B 組厚壁門相對豐度差異有統計學意義（P＜0.05）（表3）。

表3 各組腸道菌群門水平相對豐度組成比較Table 3 Composition comparison of relative abundance of intestinal flora at phylum level in each group

在屬水平上，與HC 組比較，肝硬化組中擬桿菌屬（Bacteroides）、大腸埃氏菌屬-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）相對豐度升高（t值分別為-0.630、4.321、-1.082，P值分別為0.212、0.001、0.285），普雷沃氏菌（Prevotella）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）、羅氏菌屬（Roseburia）、毛螺菌屬（Lachnospira）、乳梭菌屬（Lachnoclostridium）相對豐度降低（t=-1.623、4.465、2.135、1.967、1.657，P值分別為0.111、＜0.001、0.038、0.055、0.104）（圖1）。進一步比較分析后，肝硬化低營養(yǎng)風險組和中/高營養(yǎng)風險組共有12種腸道差異菌群：內生單胞菌屬（Endozoicomonas）、霍華德菌屬（Howardella）、Roseimarinus、螺旋體（Spirochaeta_2）在中/高營養(yǎng)風險組中相對豐度升高，另枝菌屬（Alistipes）、柯林斯菌屬（Collinsella）、GCA-900066575、霍爾德曼氏菌屬（Holdemanella）、瘤胃菌科（Incertae_Sedis）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae_ND3007_group、Lachnospiraceae_UCG-010）、塞內加爾厭氧菌（Senegalimassilia）在低營養(yǎng)風險組中相對豐度升高（P值均＜0.05）（圖2）。

圖1 腸道菌群主要屬（前20位）相對豐度百分比Figure 1 Relative abundance percentage of major genera（top 20）of intestinal flora

圖2 腸道菌群屬水平物種相對豐度比較Figure 2 Comparison of relative abundance of species at genus level of gut microbiota

2.4 腸道差異物種與臨床指標相關性 血清內毒素與瘤胃菌科呈顯著負相關（r=-0.420，P=0.007）。螺旋體與TBil 呈顯著正相關（r=0.419，P=0.007），與Alb 呈顯著負相關（r=-0.492，P=0.001）（圖3）。

圖3 腸道差異菌群與臨床指標的關系Figure 3 Relationship between gut differential flora and clinical indicators

3 討論

肝硬化患者營養(yǎng)不良的發(fā)生被認為與營養(yǎng)和炎癥反應有關［8］。其中營養(yǎng)物質攝入減少，腸道消化或吸收不良以及高分解代謝等機制已被證實［9-11］。在晚期肝病中，小腸細菌過度生長也是導致肝硬化營養(yǎng)不良的重要機制，由于結腸細菌在小腸內大量定植，小腸微絨毛結構及腸道屏障功能受損，消化酶產生減少，腸道運動能力受阻，導致營養(yǎng)物質吸收代謝紊亂［12-13］。此外，炎癥反應介導的蛋白質分解代謝增加，也可導致營養(yǎng)不良和肌肉量減少，該反應與肝硬化失代償期患者的腸道菌群組成的改變相關［8］。肝硬化時腸道細菌易位，易位的微生物及其代謝產物通過門靜脈傳遞，并被肝細胞表面的模式識別受體識別，激活肝臟固有免疫反應，使機體處于促炎激活狀態(tài)，并通過TLR4/MYD88/NF-κB 通路，促使各種促炎因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6）大量表達，這些促炎因子不但會降低食欲，影響營養(yǎng)物質的攝入，還可能導致高代謝［14-15］。由此可見，腸道微生態(tài)失調是肝硬化患者營養(yǎng)不良的一個重要促進因素。

個體中微生物組多樣性越高，其對病原微生物的易感性越低，越有利于機體健康和微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定。在本研究中，肝硬化患者腸道菌群豐度和多樣性均低于健康人群，與國內外研究［16-17］結果一致。Kriss 等［18］認為低多樣性的腸道菌群失調是導致肝臟炎癥的可能機制。此外還發(fā)現，營養(yǎng)不良風險更高的患者腸道菌群的多樣性和豐度低于低營養(yǎng)不良風險患者。部分觀點認為，腸道微生物組豐度或多樣性的降低反映的是患者體內各種有害細菌過度生長的情況。但關于肝硬化營養(yǎng)不良患者腸道菌群多樣性降低的機制尚不明確，仍需進一步研究。

腸道微生物群是一種營養(yǎng)信號傳感器，能夠合成或修飾短鏈脂肪酸和支鏈氨基酸等營養(yǎng)信號分子。而在肝硬化病情進展中，腸道微生態(tài)的失衡會導致支鏈氨基酸的缺失，從而抑制蛋白質的合成和周轉，加劇營養(yǎng)不良和肌肉萎縮［19］。在本研究中，厚壁菌門在肝硬化中/高營養(yǎng)不良風險患者中相對豐度降低，而變形菌門在中/高營養(yǎng)不良風險患者中的相對豐度升高。郝莎莎等［20］發(fā)現肝硬化合并肌量減少患者的腸道菌群中變形菌門相對豐度同樣升高。進一步研究發(fā)現，肝硬化低營養(yǎng)不良風險患者和中/高營養(yǎng)不良風險患者腸道菌群中存在顯著差異的物種。其中，另枝菌屬、毛螺旋菌科、瘤胃菌科及柯林斯菌屬等在肝硬化中/高營養(yǎng)不良風險患者糞便中相對豐度降低。Iebba 等［21］發(fā)現肝硬化患者腸道中的另枝菌屬豐度低于健康對照組。并且這種豐度的改變與疾病嚴重程度呈負相關［22］。Sung 等［23］在比較失代償期肝硬化和急性肝性腦病患者的糞便菌群時發(fā)現，另枝菌屬豐度的降低與肝性腦病復發(fā)的增加有關。或許另枝菌屬在肝硬化病情發(fā)展中起到正向作用。此外，另枝菌屬是隸屬于擬桿菌門的一種革蘭陰性菌，在代謝過程中產生丙酸和乙酸［24］。丙酸是肝臟進行糖異生的主要能量來源，能夠通過其對厭食性腸道激素的刺激作用和增加瘦素的合成來控制攝食情況［25］。乙酸是脂肪生成和膽固醇合成的底物，可與腸道內的某些受體結合，促進特定腸道激素如酪酪肽（肽YY）和胰高血糖素樣肽1 的釋放來控制食欲和抑制胰腺分泌，從而影響營養(yǎng)物質消化吸收［26］。Lachnospiraceae_ND3007_group和Lachnospiraceae_UCG-010屬于毛螺菌科，可能是一種潛在的有益菌，參與膳食纖維的發(fā)酵，產生的乙酸和丁酸為宿主提供能量來源。瘤胃球菌科在新陳代謝中起著至關重要的作用，是“降解抗性淀粉的關鍵菌”，通過分解纖維素來獲取營養(yǎng)并產生丁酸。丁酸可被氧化成乙酰輔酶A，通過三羧酸循環(huán)產生大量的ATP，為機體提供能量來源，同時具有抗炎及預防代謝性內毒素血癥的特性。此外，丁酸鹽誘導調節(jié)性T 淋巴細胞群的擴張，通過產生TGF-β 來激活CD8+T 淋巴細胞中的WNT10b 表達促進骨的形成［27］。由此可見，肝硬化患者腸道中產短鏈脂肪酸的菌群減少，會打破腸道免疫系統的平衡，促進炎癥反應，影響腸道內營養(yǎng)物質的吸收和能量供應。此外，本研究還發(fā)現，相較于健康人群和低營養(yǎng)不良風險患者，肝硬化中/高營養(yǎng)不良風險患者具有更高水平的血清內毒素。肝硬化患者由于免疫功能障礙和門靜脈高壓的存在，易加重內毒素血癥，血清內毒素可能會通過TNF-α 依賴和獨立途徑引起自噬蛋白分解增加和蛋白質合成減少，從而導致營養(yǎng)不良［28-29］。進一步研究發(fā)現，血清內毒素水平與糞便中的瘤胃菌科菌屬呈負相關，但具體機制尚不清楚，但至少可以說明腸道菌群的改變能夠影響肝硬化患者的營養(yǎng)狀況。

目前尚不清楚是腸道微生態(tài)失調導致了肝硬化營養(yǎng)不良的發(fā)展，還是疾病本身或是藥物治療后導致的微生物群失調。盡管二者因果關系未明，但肝硬化患者營養(yǎng)狀況的改變確實與獨特的腸道微生物群失調有關，這為今后肝硬化營養(yǎng)不良的微生物治療提供了依據。

倫理學聲明：本研究方案于2021 年9 月4 日經由鄭州人民醫(yī)院倫理委員會審批，批號為2021001016。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：畢炯炯負責課題設計，收集整理數據，撰寫論文；馬英杰負責擬定寫作思路，指導論文撰寫和修改。